CN103160560A - 11β，17α，20β，21- 四羟基孕甾-1，4-二烯-3-酮及其制备方法 - Google Patents

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王洪钟
张荣庆
谢莉萍
张文权
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Abstract

本发明公开了11β，17α，20β，21-四羟基孕甾-1，4-二烯-3-酮及其制备方法。本发明保护式(II)所示化合物及其制备方法。所述制备方法是以式(I)所示化合物为底物，发酵培养玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)CGMCC4.618，得到式(II)所示化合物。式(II)所示化合物为泼尼松龙的结构类似物，具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等作用效果。

Description

11β,17α,20β,21- 四羟基孕甾-1,4-二烯-3-酮及其制备方法
技术领域
本发明涉及11β，17α，20β，21-四羟基孕甾-1，4-二烯-3-酮及其制备方法。
背景技术
甾体激素类药物(steroid hormone drugs)是指分子结构中含有甾体结构的激素类药物，是临床上一类重要的药物，主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类。皮质激素类药物用于临床的有醋酸可的松(cortisone acetate)、氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸地塞米松(dexamethasone acetate)、醋酸氟轻松(fluocinonide)等。性激素分为雄性激素和蛋白同化激素、雌激素及孕激素等，例如甲睾酮(methytestosterone)、苯丙酸诺龙(norandrostenolone)、炔雌醇(ethinylestradiol)、黄体酮(progesterone)等药物。
泼尼松龙的结构式见式(I)，是一种重要的肾上腺皮质甾体激素类药物，具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等多种药理作用，主要用于严重的细菌感染和严重的过敏性疾病、各种血小板减少性紫癜、粒细胞减少症、严重皮肤病、器官移植的免疫排斥反应、肿瘤治疗及对糖皮质激素敏感的眼部炎症等。
Figure BDA0000117624250000011
泼尼松龙的许多结构类似物具有重要的生理活性，一些已经临床应用，如具有较强抗炎作用的甲基泼尼松龙，治疗哮喘的糖皮质激素类药物曲安奈德、布地奈德和环索奈德等。
发明内容
本发明的目的是提供11β，17α，20β，21-四羟基孕甾-1，4-二烯-3-酮及其制备方法。11β，17α，20β，21-四羟基孕甾-1，4-二烯-3-酮即式(II)所示化合物。
本发明提供了一种制备式(II)所示化合物的方法，是以式(I)所示化合物为底物，发酵培养玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)CGMCC 4.618，得到式(II)所示化合物。
Figure BDA0000117624250000021
所述方法可包括如下步骤：
(1)将玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)CGMCC 4.618的种子液接种至发酵培养基中进行第一阶段的发酵培养；
(2)在步骤(1)的培养体系中加入式(I)所示化合物，进行第二阶段的发酵培养，得到式(II)所示化合物。
所述发酵培养基具体可由溶质和水组成；所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：玉米淀粉20-30g/L、黄豆饼粉25-30g/L、蛋白胨1-2g/L、葡萄糖5-10g/L、硝酸铵1-5g/L和KH2PO4 1-2g/L。所述发酵培养基的pH值具体可为6.5-7.0。
所述步骤(2)中，式(I)所示化合物在所述培养体系中的初始浓度可为5-10g/L。
所述步骤(1)中，所述发酵培养的条件具体可为：28-30℃、220-250rpm培养20-24小时；
所述步骤(2)中，所述发酵培养的条件具体可为：28-30℃、220-250rpm培养20-24小时。
所述种子液的制备方法具体如下：将玫瑰产色链霉菌(Streptomycesroseochromogenes)CGMCC 4.618接种至种子培养基，培养后得到种子液。
所述种子培养基具体可由溶质和水组成；所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度如下：玉米淀粉15-20g/L、黄豆饼粉15-20g/L、蛋白胨1-5g/L、葡萄糖4-10g/L、硝酸铵1-4g/L和KH2PO4 1-2g/L。所述种子培养基的pH值具体可为6.5-7.0。所述培养的条件具体可为28-30℃、200-230rpm培养20-24小时。
所述方法还可包括将所述步骤(2)的所述发酵培养的产物进行有机溶剂提取的步骤。所述有机溶剂为乙醇或乙酸乙酯。
所述方法还可包括将所述有机溶剂提取的提取物进行硅胶柱层析的步骤。硅胶柱层析的具体参数如下：填充物为硅胶(100-200目)，层析柱型号为22mm×900mm。硅胶柱层析的的洗脱过程为：先用3倍柱体积的石油醚进行洗涤；然后用石油醚-乙酸乙酯(2∶1，体积比)进行洗脱，收集保留体积为1L至1.2L的过柱后洗脱液。
所述方法还可包括如下步骤：将所述过柱后洗脱液的干燥产物用石油醚-丙酮(5∶1，体积比)溶解，过滤并收集滤液；将所述滤液进行重结晶。所述重结晶的具体方法为：调整所述滤液的密度至ρ＝0.700(即石油醚∶丙酮＝2.2∶1；体积比)，有晶体析出(该部分晶体为泼尼松龙)，去除该部分晶体；然后持续蒸发至滤液密度为0.720，得白色针状结晶物，过滤并收集结晶物，真空干燥后得到的产物，即为式(II)所示化合物。
本发明还保护以上任一所述方法得到的式(II)所示化合物。
本发明还保护式(II)所示化合物。
式(II)所示化合物为泼尼松龙的结构类似物(泼尼松龙进行20β-羟基化的产物)，具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等作用效果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
泼尼松龙(C21H28O5)，结构式见式(I)：太原市瑞和丰科贸有限公司。
实施例1、式(II)所示化合物的制备
本实施例中的种子培养基由溶质和水组成，pH值6.5；所述溶质及其在种子培养基中的浓度如下：玉米淀粉15g/L、黄豆饼粉15g/L、蛋白胨1g/L、葡萄糖4g/L、硝酸铵1g/L和KH2PO4 1g/L。
本实施例中的发酵培养基由溶质和水组成，pH值6.5；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度如下：玉米淀粉20g/L、黄豆饼粉25g/L、蛋白胨1g/L、葡萄糖5g/L、硝酸铵1g/L和KH2PO4 1g/L。
一、式(II)所示化合物的制备
1、将玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)CGMCC 4.618(中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种至PDA斜面培养基(pH值6.8-7.0)，28℃恒温培养至长出粉红色孢子(7-10天)，放置于4℃冰箱保存。
2、在无菌条件下，用接种铲从步骤1的PDA斜面培养基中挖取拇指大小的斜面孢子接种至种子培养基中，28℃、200rpm条件下振荡培养20小时，得到种子液。
3、将30mL步骤2的种子液接种至1000mL发酵培养基中，28℃、220rpm振荡培养20小时；然后在培养体系中加入泼尼松龙使其浓度为5g/L，28℃、220rpm振荡培养20小时。
二、式(II)所示化合物的提取
1、将2L步骤一得到的培养体系离心(6000g、10min)收集沉淀，得到206.6g沉淀(包括菌体和残余黄豆饼粉等)。
采用高压液相色谱法(HPLC)分析所述沉淀中式(II)所示化合物的含量。
高压液相色谱的参数如下：
色谱柱：Dikma Diamonsil C18，5μ，250×4.6mm；
填充物：18烷基硅烷键合反相柱；
分析系统：Waters600系统；检测波长：λ＝245nm；
流动相：3体积份乙腈与7体积份水的混合物；
柱温：常温；
流速：1ml/min；
收集保留时间为13.4min-13.5min的过柱后洗脱液。
计算目标峰的面积占整个色谱图峰面积的百分比，即式(II)所示化合物在沉淀的质量百分含量。
每2L培养体系得到的沉淀中含7.68g式(II)所示化合物。
式(I)所示化合物的转化率为94％。
2、将步骤1获得的沉淀用210ml冰乙醇室温浸提0.5小时，离心(6000g、10min)收集上清。
3、在步骤2的沉淀中再加入210ml冰乙醇并室温浸提0.5小时，离心(6000g、10min)收集上清。
4、在步骤3的沉淀中再加入210ml冰乙醇并室温浸提0.5小时，离心(6000g、10min)收集上清。
5、将步骤2、步骤3和步骤4的上清合并，即为式(II)所示化合物的粗提液。
采用高压液相色谱法(HPLC)分析所述粗提液中式(II)所示化合物的含量，方法同步骤1。所述粗提液中含6.22g式(II)所示化合物。
三、式(II)所示化合物的纯化
1、将步骤二的粗提液进行减压浓缩至粘稠糊状物，得50.12g浓缩物。
2、将30g步骤1得到的浓缩物与300g柱层析硅胶(100-200目)混合均匀，然后装层析柱(
Figure BDA0000117624250000051
22mm×900mm)；先用3倍柱体积的石油醚进行洗涤(去除绝大部分色素及其它杂质)；然后用石油醚-乙酸乙酯(2∶1，体积比)进行洗脱，收集保留体积为1L至1.2L的过柱后洗脱液。
3、将步骤2得到的过柱后洗脱液进行减压浓缩并真空干燥，得粗产物5.02g。
4、在步骤3的粗产物中加入20ml石油醚-丙酮(5∶1，体积比)，室温溶解，过滤并收集滤液。
5、将步骤4的滤液进行重结晶。
调整滤液的密度至ρ＝0.700(即石油醚∶丙酮＝2.2∶1；体积比)，有晶体析出，该部分晶体为泼尼松龙，去除该部分晶体；然后持续蒸发至滤液密度为0.720，得白色针状结晶物，过滤并收集结晶物，真空干燥后得3.26g结晶物，即为产物。
采用高压液相色谱法(HPLC)分析所述产物中式(II)所示化合物的含量，方法同步骤二的1。经HPLC分析显示，产物中式(II)所示化合物的纯度达99.3％。
四、式(II)所示化合物的表征
采用离子-质谱(EI-MS)和1H-NMR分析步骤三的产物或泼尼松龙。
EI/MS谱显示步骤三的产物的离子峰在m/z 362，比泼尼松龙(底物)多2，说明结构上出现双键还原现象。
步骤三的产物和泼尼松龙的1H-NMR(δ，CDCl3)归属比较见表1。
表1步骤三的产物和泼尼松龙的1H-NMR(δ，CDCl3)归属比较
Figure BDA0000117624250000061
步骤三的产物和泼尼松龙的1H-NMR谱除H-20以外，其他都基本相近。步骤三的产物的H-20为δ3.84。步骤三的产物与泼尼松龙同样含有两个甲基信号值(δ1.07，H-18 and δ1.46，H-19)。因此，结合离子-质谱(EI-MS)和1H-NMR分析结果，步骤三的产物为11β，17α，20β，21-四羟基孕甾-1，4-二烯-3-酮(或称20β-羟基泼尼松龙)。
产物的结构示意图见式(II)。
Figure BDA0000117624250000062
式(II)所示化合物为泼尼松龙的结构类似物，具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等作用效果。
实施例2、式(II)所示化合物的制备
本实施例中的种子培养基由溶质和水组成，pH值7.0；所述溶质及其在种子培养基中的浓度如下：玉米淀粉20g/L、黄豆饼粉20g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、硝酸铵4g/L和KH2PO4 2g/L。
本实施例中的发酵培养基由溶质和水组成，pH值7.0；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度如下：玉米淀粉30g/L、黄豆饼粉30g/L、蛋白胨2g/L、葡萄糖10g/L、硝酸铵5g/L和KH2PO42g/L。
一、式(II)所示化合物的制备
1、将玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)CGMCC 4.618(中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种至PDA斜面培养基(pH值6.8-7.0)，28℃恒温培养至长出粉红色孢子(7-10天)，放置于4℃冰箱保存。
2、在无菌条件下，用接种铲从步骤1的PDA斜面培养基中挖取拇指大小的斜面孢子接种至种子培养基中，30℃、230rpm条件下振荡培养24小时，得到种子液。
3、将30mL步骤2的种子液接种至1000mL发酵培养基中，30℃、250rpm振荡培养24小时；然后在培养体系中加入泼尼松龙使其浓度为10g/L，30℃、250rpm振荡培养24小时。
二、式(II)所示化合物的提取
1、将3.5L步骤一得到的培养体系离心(6000g、10min)收集沉淀，得到401.3g沉淀(包括菌体和残余黄豆饼粉等)。
采用高压液相色谱法分析所述沉淀中式(II)所示化合物的含量，方法同实施例1的步骤二的1。每3.5L培养体系得到的沉淀中含31.06g式(II)所示化合物。
式(I)所示化合物的转化率为96％。
2、将步骤1获得的沉淀用400ml乙酸乙酯室温浸提0.5小时，离心(6000g、10min)收集上清。
3、在步骤2的沉淀中再加入400ml乙酸乙酯并室温浸提0.5小时，离心(6000g、10min)收集上清。
4、在步骤3的沉淀中再加入400ml乙酸乙酯并室温浸提0.5小时，离心(6000g、10min)收集上清。
5、将步骤2、步骤3和步骤4的上清合并，即为式(II)所示化合物的粗提液。
采用高压液相色谱法分析所述粗提液中式(II)所示化合物的含量，方法同步骤1。所述粗提液中含28.92g式(II)所示化合物。
三、式(II)所示化合物的纯化
1、将步骤二的粗提液进行减压浓缩至粘稠糊状物，得87.12g浓缩物。
步骤2至5同实施例1的步骤三的2-5。经HPLC分析显示，产物中式(II)所示化合物的纯度达99.1％。
四、式(II)所示化合物的表征
结果与实施例1的步骤四的结果一致。

Claims (10)

1.一种制备式(II)所示化合物的方法，是以式(I)所示化合物为底物，发酵培养玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)CGMCC 4.618，得到式(II)所示化合物；
Figure FDA0000117624240000011
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)CGMCC 4.618的种子液接种至发酵培养基中进行第一阶段的发酵培养；
(2)在步骤(1)的培养体系中加入式(I)所示化合物，进行第二阶段的发酵培养，得到式(II)所示化合物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基由溶质和水组成；所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：玉米淀粉20-30g/L、黄豆饼粉25-30g/L、蛋白胨1-2g/L、葡萄糖5-10g/L、硝酸铵1-5g/L和KH2PO4 1-2g/L。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，式(I)所示化合物在所述培养体系中的初始浓度为5-10g/L。
5.如权利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述发酵培养的条件为：28-30℃、220-250rpm培养20-24小时；所述步骤(2)中，所述发酵培养的条件为：28-30℃、220-250rpm培养20-24小时。
6.如权利要求2至5中任一所述的方法，其特征在于：所述种子液的制备方法如下：将玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)CGMCC 4.618接种至种子培养基，培养后得到种子液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述种子培养基由溶质和水组成；所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度如下：玉米淀粉15-20g/L、黄豆饼粉15-20g/L、蛋白胨1-5g/L、葡萄糖4-10g/L、硝酸铵1-4g/L和KH2PO41-2g/L；
所述玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)CGMCC 4.618在所述种子培养基中的培养条件为28-30℃、200-230rpm培养20-24小时。
8.如权利要求2至7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述步骤(2)的所述发酵培养的产物进行有机溶剂提取的步骤。
9.权利要求1至8中任一所述方法得到的式(II)所示化合物。
10.式(II)所示化合物。
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