CN103159778A - 一种半抗原、其抗原、其相应的抗体及其在检测蒿甲醚中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半抗原、其抗原、其相应的抗体及其在检测蒿甲醚中的应用。本发明提供的半抗原为式（Ⅱ）所示的化合物。本发明提供的化合物，可以作为半抗原，该半抗原与载体蛋白偶联后可以得到抗原，用抗原免疫动物，可以得到特异性针对蒿甲醚抗原的抗体。本发明还提供了所述化合物的制备方法，步骤简洁、成本低廉。用本发明方法制备的抗体的特异性好（与蒿甲醚结构类似物的交叉反应率低）、灵敏度高。本发明可用于蒿甲醚药物的大规模检测与质量控制，在蒿甲醚的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种半抗原、其抗原、其相应的抗体及其在检测蒿甲醚中的应用。
背景技术
青蒿素衍生物如青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿甲醚等对治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾具有高效、低毒、速效、复燃率低等显著疗效。蒿甲醚（Artemether）是非洲应用最广的抗疟疾药物。
假冒、劣质以及不符合标准的青蒿素药物对疟疾病情的防控造成了重大威胁，而这种伪劣假冒现象在东南亚、非洲等落后地区尤为突出。因此急需建立一种快捷、可靠的针对青蒿素及其衍生物的定性定量分析方法。
蒿甲醚的化学名为(3R,5αS,6R,8αS,9R,10S,12R,12αR)-十氢-10-甲氧基-3,6,9-三甲基-3,12-桥氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二塞平，CAS登记号为71963-77-4，分子式为C16H26O5，相对分子量为298.37，化学结构式见式（Ⅰ）。
目前国内外已发表的文献中，蒿甲醚检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱法（LC-MS）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。这些方法都需要昂贵的仪器设备，检测费用高，操作时间长，操作技术要求高且不能用于现场检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种半抗原、其抗原、其相应的抗体及其在检测蒿甲醚中的应用。
本发明提供的半抗原为式（Ⅱ）所示的化合物；
本发明还保护式（Ⅱ）所示化合物的制备方法，包括如下步骤：将式（Ⅶ）所示化合物和丁二酸酐反应，获得式（Ⅱ）所示化合物。
制备式（Ⅱ）所示化合物时，式（Ⅶ）所示化合物与丁二酸酐的摩尔比具体可为0.9：2。制备式（Ⅱ）所示化合物时，所述反应的条件可为：0-50℃反应1-48小时。式（Ⅱ）所示化合物的制备方法具体如下：将0.9mmol式（Ⅶ）所示化合物和25mL有机溶剂（如二氯甲烷）室温混合后边搅拌边加入2mmol丁二酸酐，冰浴冷却后于0℃-5℃温度条件下加入0.9mmol4-二甲氨基吡啶并冰浴反应30min，然后自然升至室温并反应1h，加入等体积的水，用盐酸调pH至3，分液后取有机相，用水洗涤后用无水MgSO4干燥,减压脱溶后得白色粉末，即为式（Ⅱ）所示化合物。
本发明还保护式（Ⅱ）所示化合物与载体蛋白的偶联物。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。式（Ⅱ）所示化合物与载体蛋白通过酰胺键连接。所述酰胺键是式（Ⅱ）所示化合物的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。所述偶联物的结构式见式（Ⅲ）。
所述偶联物的制备方法包括如下步骤：在NHS和EDC的作用下促使式（Ⅱ）所示化合物与载体蛋白偶联。制备所述偶联物时，式（Ⅱ）所示化合物、NHS和EDC的摩尔比可为1：（1-5）：（1-5）。制备所述偶联物时，所述反应的条件可为：0-50℃反应4-36小时。制备所述偶联物时，式（Ⅱ）所示化合物与所述载体蛋白的摩尔比可为（5-30）：1；具体可为（15-17）：1，更具体可为15：1。所述偶联物的制备方法具体如下：将0.036mmol式（Ⅱ）所示化合物、0.047mmol NHS和0.040mmol EDC，用有机溶剂（如DMSO）溶解，25℃搅拌反应6小时，然后滴加入含0.0024mmol载体蛋白的载体蛋白溶液（载体蛋白溶液具体是将0.0024mmol OVA溶于5mL pH7.5、0.1M的PBS缓冲液得到的），4℃搅拌12小时。
所述偶联物的制备方法包括如下步骤：在NHS和DCC的作用下促使式（Ⅱ）所示化合物与载体蛋白偶联。制备所述偶联物时，式（Ⅱ）所示化合物、NHS和DCC的摩尔比可为1：（1-5）：（1-5）。制备所述偶联物时，所述反应的条件可为：0-50℃反应4-36小时。制备所述偶联物时，式（Ⅱ）所示化合物与所述载体蛋白的摩尔比可为（5-30）：1；具体可为（15-17）：1，更具体可为15：1。所述偶联物的制备方法具体如下：将0.04mmol式（Ⅱ）所示化合物、0.052mmol NHS和0.044mmol DCC，用有机溶剂（如DMF）溶解，25℃搅拌反应6小时，离心（离心参数具体可为：8000rpm离心5分钟）收集上清液，然后滴加入含0.0024mmol载体蛋白的载体蛋白溶液（载体蛋白溶液具体是将0.0024mmol OVA溶于5mL pH7.5、0.1M的PBS缓冲液得到的），4℃搅拌12小时。
本发明还保护所述偶联物在制备抗体中的应用。
本发明还保护以所述偶联物为免疫原制备得到的抗体。
本发明还保护所述偶联物和/或所述抗体在检测蒿甲醚中的应用。
本发明还保护所述偶联物和/或所述抗体在制备用于检测蒿甲醚的试剂盒中的应用。所述试剂盒具体可为酶联免疫试剂盒。待检样本可为水体、药品、食品或土壤。
本发明还保护所述偶联物和/或所述抗体在制备用于检测蒿甲醚的免疫亲和色谱柱中的应用。待检样本可为水体、药品、食品或土壤。
本发明提供了一种化合物，可以作为半抗原，该半抗原与载体蛋白偶联后可以得到抗原，用抗原免疫动物，可以得到特异性针对蒿甲醚抗原的抗体。本发明还提供了所述化合物的制备方法，步骤简洁、成本低廉。用本发明方法制备的抗体的特异性好（与蒿甲醚结构类似物的交叉反应率低）、灵敏度高。本发明可用于蒿甲醚药物的大规模检测与质量控制，在蒿甲醚的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。
附图说明
图1为制备式（Ⅱ）所示化合物的流程示意图。
图2为制备偶联物的流程示意图。
图3为蒿甲醚间接ELISA法标准曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
丁二酸酐、N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、牛血清白蛋白（BSA，分子量68kDa）和卵清白蛋白（OVA，分子量为44kDa）均购自Sigma公司。羊抗小鼠IgG-HRP购自Jackson公司。邻苯二胺（OPD）、氨基乙酸、氨基丙酸等其余常规试剂均购自北京化学试剂公司。
蒿甲醚：购自阿拉丁试剂（上海）有限公司，货号为71963-77-4。
N,N'-二环己基碳二亚胺的化学结构式见式（Ⅳ）。
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的化学结构式见式（Ⅴ）。
N-羟基琥珀酰亚胺的化学结构式见式（Ⅵ）。
pH7.5、0.1M的PBS缓冲液的制备方法：称量4.0g NaCl、0.1g KH2PO4、1.48gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水定容至500mL。
实施例1、半抗原的制备
一、化合物的制备
1、式（Ⅶ）所示化合物的制备
式（Ⅶ）所示化合物的制备见文献：Ehab A.Abourashed and Charles D.Hufford,Microbial Transformation of Artemether,J.Nat.Prod.1996,59,251-253.。
产物的表征数据如下：白色针晶，MS m/z336.83[M+Na]+;1H-NMR(CDCl3,300MHz):δ5.42(1H,s),4.68(1H,d),3.41(3H,s),3.10(1H,m),2.60(1H,m),2.36(1H,m),1.9-2.1(1H,m),1.59(1H,m),1.5-1.9(2H,m),1.44(3H,s),1.2-1.4(1H,m),1.05(3H,d),0.90(3H,d)。
2、式（Ⅱ）所示化合物的制备
合成路线图如图1所示。
在三口烧瓶中加入0.9mmol式（Ⅶ）所示化合物和25mL干燥的二氯甲烷，于室温下边搅拌边加入2mmol丁二酸酐，冰浴冷却后于0℃-5℃温度条件下加入0.9mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)，冰浴反应30min；自然升至室温后反应1h，取样进行TLC薄层层析（展开剂为乙酸乙酯和石油醚的等体积混合物；式（Ⅶ）所示化合物的Rf值为0.57，目标产物的Rf值为0.78；结果表明，式（Ⅶ）所示化合物都生成了目标产物）；加入等体积的水，用10%盐酸调pH至3，分液后取有机相，用水洗涤(每次加入25mL水，洗涤三次)后用无水MgSO4干燥,减压脱溶后得白色粉末，即为产物。
二、化合物的表征
步骤一得到的产物的1H-NMR数据如下：
1H-NMR(DMSO,300MHz):δ12.11(1H,s),5.42(1H,s),4.60(1H,d),4.34(1H,m),3.27(3H,s),2.38-2.40(5H,m),2.18(1H,m),2.05(1H,m),1.77-1.84(2H,m),1.57-1.63(2H,m),1.37-1.42(2H,m),1.30(3H,s),0.80-0.85(6H,m)。
结果表明，步骤一得到的产物的化学结构式如式（Ⅱ）所示。
实施例2、抗原的制备
一、蒿甲醚-卵清白蛋白的偶联物的制备
1、取0.036mmol式（Ⅱ）所示化合物、0.047mmol NHS和0.040mmol EDC，用1mL DMSO溶解，25℃搅拌反应6小时，得到式（Ⅷ）所示化合物。
2、取完成步骤1的整个反应液（按照所有式（Ⅱ）所示化合物都生成了式（Ⅷ）所示化合物计，反应液中含有0.036mmol式（Ⅷ）所示化合物），缓慢滴加入载体蛋白溶液中（载体蛋白溶液是将0.0024mmol OVA溶于5mL pH7.5、0.1M的PBS缓冲液得到的），4℃搅拌12小时。
3、取完成步骤2的整个反应液（按照所有载体蛋白均与式（Ⅷ）所示化合物偶联计），用pH7.5、0.1M的PBS缓冲液透析三天（透析的作用在于去除未反应的蒿甲醚半抗原或其它小分子），然后用pH7.5、0.1M的PBS缓冲液稀释得到蒿甲醚-卵清白蛋白溶液（以OVA计，浓度为1mg/mL），-40℃冻存待用。蒿甲醚-卵清白蛋白又称蒿甲醚-OVA。
二、蒿甲醚-卵清白蛋白的偶联物的制备
1、取0.04mmol式（Ⅱ）所示化合物、0.052mmol NHS和0.044mmol DCC，用1mL无水DMF溶解，25℃搅拌反应6小时，然后8000rpm离心5分钟，取上清液。上清液中含有式（Ⅷ）所示化合物。
2、将步骤1得到的上清液代替步骤一的2中的反应液，其它同步骤一的2。
3、同步骤一的3。
三、蒿甲醚-牛血清白蛋白的偶联物的制备
1、同步骤一的1。
2、取完成步骤1的整个反应液（按照所有式（Ⅱ）所示化合物都生成了式（Ⅷ）所示化合物计，反应液中含有0.036mmol式（Ⅷ）所示化合物），缓慢滴加入载体蛋白溶液中（载体蛋白溶液是将0.0024mmol BSA溶于10mL pH7.5、0.1M的PBS缓冲液得到的），4℃搅拌12小时。
3、取完成步骤2的整个反应液（按照所有载体蛋白均与式（Ⅷ）所示化合物偶联计），用pH7.5、0.1M的PBS缓冲液透析三天（透析的作用在于去除未反应的蒿甲醚半抗原或其它小分子），然后用pH7.5、0.1M的PBS缓冲液稀释得到蒿甲醚-牛血清白蛋白溶液（以BSA计，浓度为1mg/mL），-40℃冻存待用。蒿甲醚-牛血清白蛋白又称蒿甲醚-BSA。
四、蒿甲醚-牛血清白蛋白的偶联物的制备
1、同步骤二的1。
2、将步骤1得到的上清液代替步骤三的2中的反应液，其它同步骤三的2。
3、同步骤三的3。
实施例3、抗体的制备及其在检测蒿甲醚中的应用
一、利用蒿甲醚-BSA作为抗原制备抗体
实验动物为8-10周龄的Bal b/c小鼠（军事医学科学院实验动物中心），体重23-25g。
1、基础免疫
将实施例2的步骤三制备的蒿甲醚-BSA溶液（以BSA计，浓度为1mg/mL）用无菌过滤器过滤后与等体积弗氏完全佐剂混合，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到乳化好的完全抗原。
取乳化好的完全抗原，腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg（以BSA计）。
2、加强免疫
将实施例2的步骤三制备的蒿甲醚-BSA溶液（以BSA计，浓度为1mg/mL）用无菌过滤器过滤后与等体积弗氏不完全佐剂混合，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到乳化好的不完全抗原。
基础免疫2周后，取乳化好的不完全抗原，腹腔及背部皮下多点注射Bal b/c小鼠，每只小鼠的注射剂量为0.1mg（以BSA计），之后每隔15天按相同的方法加强免疫一次。从第三次加强免疫开始，每次免疫后第3-5天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价。
测定抗体效价时，采用实施例2中制备的1mg/mL蒿甲醚-OVA溶液（以OVA计，浓度为1mg/mL）的500倍稀释液（用pH7.5、0.1M的PBS缓冲液进行稀释）作为包被原。
待效价大于1：8000后（效价定义为零孔显色值为1时，血清的稀释倍数；第三次加强免疫后已经达到了该效价），眼球摘除采血，血液室温静置1小时，再4℃静置2小时，然后于离心机中8000r/min离心5分钟，分离血清，即为蒿甲醚-BSA抗体。
二、制备抗体效果检测时所用的各种缓冲液
包被缓冲液：pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液。
样品稀释液：由0.5mL吐温20、0.5g明胶和500mL pH9.6、0.1M的PBS缓冲液混合得到。
柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液（pH5.5）：由柠檬酸三钠、Na2HPO4和水组成，柠檬酸三钠的浓度为0.01M，Na2HPO4的浓度为0.03M。
底物缓冲液：将20.0mg邻苯二胺（OPD）溶解于10.0mL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，然后加入4μL体积百分含量为30%的H2O2水溶液。
终止液：2.0M硫酸水溶液。
洗涤液：由NaCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、Tween-20和水组成，NaCl的浓度为8.0g/L，KH2PO4的浓度为0.2g/L，Na2HPO4·12H2O的浓度为2.96g/L，Tween-20的体积百分含量为1：1000。
三、蒿甲醚-BSA抗体对蒿甲醚的检测效果
1、蒿甲醚-OVA稀释液的配制
将实施例2的步骤一制备蒿甲醚-OVA溶液（以OVA计，浓度为1mg/mL）完全解冻后，用包被缓冲液分别按1：500、1：1000、1：2000和1：4000进行梯度稀释，得到不同浓度的蒿甲醚-OVA稀释液。
2、蒿甲醚标准品溶液的配制
（1）称取5mg蒿甲醚标准品，充分溶解于5mL乙腈中，得到1mg/mL蒿甲醚标准品溶液。
（2）用样品稀释液将1mg/mL蒿甲醚标准品溶液配成1000ng/mL的蒿甲醚标准品溶液。
3、蒿甲醚-BSA抗血清稀释液的配制
将步骤一制备的蒿甲醚-BSA抗体用样品稀释液分别按1:500、1:1000、1:2000和1:4000进行梯度稀释，得到不同浓度的蒿甲醚-BSA抗体稀释液。
4、抗原、抗体的棋盘格实验
包被：在96孔酶标板中每孔加入100μL蒿甲醚-OVA稀释液，37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次，甩干。
竞争：零孔每孔加50μl样品稀释液，抑制孔每孔加50μl步骤2的（2）制备的蒿甲醚标准品溶液；加入蒿甲醚-BSA抗体稀释液（50μl/孔）；置湿盒中37℃放置30min，用洗涤液洗涤4次，甩干。
加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗（IgG-HRP，Jackson公司，产品目录号为79556）(0.1mg/mL)用样品稀释液稀释1000倍，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，用洗涤液洗涤4次，甩干。
显色：将底物缓冲液加入酶标板中，每孔100μl，避光显色10min。
终止：每孔加入50μL终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
结果如表1所示。
表1抗原、抗体的棋盘格实验结果（OD492nm值）
注：I表示抑制孔，C表示零孔。
结果表明，实施例2制备的蒿甲醚-BSA可以作为免疫原制备出检测蒿甲醚的抗体。
四、蒿甲醚标准曲线的建立
1、称取5mg蒿甲醚标准品，充分溶解于5mL乙腈中，得到1mg/mL蒿甲醚标准品溶液。将蒿甲醚标准品溶液用样品稀释液分别稀释成如下不同的浓度：50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.12ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0.39ng/mL和0.20ng/mL。
2、将实施例2的步骤一制备的蒿甲醚-OVA溶液（以OVA计，浓度为1mg/mL）用包被缓冲液1:16000稀释后加入到96孔酶标板中，每孔100μL，37℃包被3小时；用洗涤液洗涤4次，甩干。
3、在步骤2的酶标板中加入不同浓度的蒿甲醚标准品稀释液（实验孔），每孔50μL，用50μL样品稀释液代替蒿甲醚标准品稀释液作为对照孔。
4、将步骤一制备的蒿甲醚-BSA抗体用样品稀释液1:8000稀释后加入步骤3的酶标板中，每孔50μL；37℃温育30分钟；用洗涤液洗涤4次，甩干。
5、将羊抗小鼠IgG-HRP用样品稀释液1:1000稀释后加入步骤4的酶标板中，每孔100μL，37℃温育30分钟；用洗涤液洗涤4次，甩干。
6、每孔加入100μL底物缓冲液，避光显色10min。
7、每孔加入50μL终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。
以蒿甲醚标准品稀释液的浓度（ng/mL）作为X轴，以吸光度值的比值（B/B0×100%，其中，B为试验孔的平均吸光度值，B0为对照孔的平均吸光度值）作为Y轴，绘制标准曲线图。
标准曲线图见图3（实验设3次重复，取三次平均值）。检测蒿甲醚的IC50（即B/B0为50%时对应的蒿甲醚浓度）为3.70ng/mL，检测范围是0.70ng/mL-18.75ng/mL。结果表明，用实施例1制备的蒿甲醚-BSA作为抗原免疫小鼠得到的抗体具有很好的效果。
五、抗体特异性检测
1、蒿甲醚类似物标准品溶液的配制
分别用青蒿琥酯（中国食品药品检定研究院，货号为100200）、青蒿素（中国食品药品检定研究院，货号为100202）和双氢青蒿素（中国食品药品检定研究院，货号为100184）三种结构类似物代替蒿甲醚进行步骤四的1，其它步骤均同步骤四中的相应步骤。
交叉反应率（%）＝（蒿甲醚的IC50）/（蒿甲醚的类似物的IC50）×100%。
实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，结果如表2所示。
表2由蒿甲醚-BSA制备的抗体的特异性检测
| 分析物 | IC50（ng/mL） | 交叉反应率（%） |
| 蒿甲醚 | 3.70 | 100 |
| 青蒿琥酯 | >20,000 | <0.02 |
| 青蒿素 | 158.92 | 2.29 |
| 双氢青蒿素 | 282.63 | 1.31 |
结果表明，上述由蒿甲醚-BSA制备得到的抗体与其类似物青蒿素的交叉反应率很小，说明用蒿甲醚-BSA制备的抗体对蒿甲醚具有很好的特异性。
实施例4、抗体的制备及其在检测蒿甲醚中的应用
用步骤二制备的蒿甲醚-OVA溶液代替步骤一制备蒿甲醚-OVA溶液，并且用步骤四制备的蒿甲醚-BSA溶液代替步骤三制备的蒿甲醚-BSA溶液，其它同实施例3。
结果与实施例3的结果一致。
Claims (9)
1.式（Ⅱ）所示的化合物；
2.式（Ⅱ）所示化合物的制备方法，包括如下步骤：将式（Ⅶ）所示化合物和丁二酸酐反应，获得所述化合物；
3.式（Ⅱ）所示化合物与载体蛋白的偶联物。
4.根据权利3所述的偶联物，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
5.权利要求3或4所述偶联物在制备抗体中的应用。
6.以权利要求3或4所述偶联物为免疫原制备得到的抗体。
7.权利要求3或4所述偶联物和/或权利要求6所述抗体在检测蒿甲醚中的应用。
8.权利要求3或4所述偶联物和/或权利要求6所述抗体在制备用于检测蒿甲醚的试剂盒中的应用。
9.权利要求3或4所述偶联物和/或权利要求6所述抗体在制备用于检测蒿甲醚的免疫亲和色谱柱中的应用。
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| CN102827222A (zh) * | 2012-08-25 | 2012-12-19 | 河北农业大学 | 一种泰乐菌素的半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其制备方法与应用 |
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2013
- 2013-03-27 CN CN201310102015.4A patent/CN103159778B/zh not_active Expired - Fee Related
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| CN103159778B (zh) | 2015-07-22 |
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