CN103159760B - 作为cftr调控剂的氮杂吲哚衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及ATP-结合盒("ABC")转运蛋白或其片段的调控剂，包括囊性纤维化跨膜传导调节剂("CFTR")、其组合物和相关方法。本发明也涉及使用这类调控剂治疗ABC转运蛋白介导疾病的方法。

Description

作为CFTR调控剂的氮杂吲哚衍生物
本申请是发明名称为“作为CFTR调控剂的氮杂吲哚衍生物”的中国发明专利申请No.200780045474.6的分案申请，其申请日是2007年11月2日，优先权日是2006年11月3日。
发明的技术领域
本发明涉及ATP-结合盒（ATP-BindingCassette）("ABC")转运蛋白或其片段的调控剂，包括囊性纤维化跨膜传导调节剂("CFTR")、其组合物和相关方法。本发明也涉及使用这类调控剂治疗ABC转运蛋白介导疾病的方法。
发明背景
ABC转运蛋白是膜转运蛋白家族，调节多种药理成分、潜在毒性药物和异生素以及阴离子的转运。ABC转运蛋白是同源性膜蛋白，它们结合和利用细胞三磷酸腺苷(ATP)供它们的特异性活性。这些转运蛋白中有些被发现是多药耐受性蛋白（象MDR1-P糖蛋白或多药耐受性蛋白MRP1），为恶性癌细胞防御化学治疗剂。迄今已经鉴别了48种ABC转运蛋白，基于它们的序列同源性和功能分为7个家族。
ABC转运蛋白在体内调节多种重要的生理角色，并且提供对有害环境化合物的防御。因为如此，它们代表重要的潜在药物靶，用于治疗与该转运蛋白缺陷有关的疾病，防止药物从靶细胞中转运出去，和干预其他其中ABC转运蛋白活性的调控可能是有益的疾病。
普遍与疾病有关的一种ABC转运蛋白家族成员是cAMP/ATP-介导的阴离子通道CFTR。CFTR在多种细胞类型中被表达，包括吸收性和分泌性上皮细胞，在那里它调节阴离子的跨膜流动以及其他离子通道和蛋白质的活性。在上皮细胞中，CFTR的正常功能发挥是维持电解质在体内各处转运的关键，包括呼吸和消化组织。CFTR由大约1480个氨基酸组成，它们编码由跨膜结构域的串联重复要素所构成的蛋白质，各自含有六个跨膜螺旋和一个核苷酸结合结构域。两个跨膜结构域通过大型极性调节性(R)-结构域连接，具有多个调节通道活性和细胞运输的磷酸化位点。
编码CFTR的基因已被鉴别和测序(参见Gregory，R.J.等人(1990)Nature347:382-386；Rich，D.P.等人(1990)Nature347:358-362；Riordan，J.R.等人(1989)Science245:1066-1073)。这种基因的缺陷引起CFTR突变，导致囊性纤维化(“CF”)，这是人类最常见的致命性遗传疾病。囊性纤维化影响大约两千五百分之一的美国新生儿。在全部美国人口中，多达一千万人携带有缺陷基因的单一副本，没有明显的疾病效应。相反，带有两个CF相关基因副本的个体患有CF的衰弱与致命性效应，包括慢性肺疾病。
在囊性纤维化患者中，在呼吸道上皮中被内源性表达的CFTR的突变引起顶端阴离子分泌减少，导致离子和体液转运的失衡。所致阴离子转运疾病对肺中粘液蓄积增强和伴随微生物感染有贡献，最终导致CF患者死亡。除了呼吸疾病以外，CF患者通常患有胃肠问题和胰腺机能不全，如果不加治疗则导致死亡。另外，大多数囊性纤维化男性是不育的，囊性纤维化女性的生育力降低。与两个CF相关基因副本的严重效应相反，带有单一CF相关基因副本的个体表现对霍乱和腹泻所致脱水的抗性增加——这也许解释了人群内相对高频率的CF基因的原因。
CF染色体CFTR基因的序列分析已经揭示了多种致病性突变(Cutting，G.R.等人(1990)Nature346:366-369；Dean，M.等人(1990)Cell61:863：870；andKerem，B-S.等人(1989)Science245:1073-1080；Kerem，B-S等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8447-8451)。迄今已经鉴别了1000种以上致病性CF基因突变(http:// www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)。最常见的突变是CFTR氨基酸序列508位苯丙氨酸的缺失，普遍被称为ΔF508-CFTR。这种突变发生在大约70%的囊性纤维化病例中，与严重的疾病有关。
ΔF508-CFTR中508残基的缺失防止初生蛋白正确地折叠。这导致该突变蛋白不能退出内质网(“ER”)和运输至质膜。其结果是，膜中通道数量远远少于表达野生型CFTR的细胞。除了运输减低以外，突变还导致有缺陷的通道门控。总之，膜中通道数量减少和有缺陷的门控引起跨越上皮的阴离子转运减少，引起有缺陷的离子和体液转运(Quinton，P.M.(1990)，FASEBJ.4:2709-2727)。不过，研究已经显示，膜中ΔF508-CFTR的数量减少是功能性的，尽管少于野生型CFTR(Dalemans等人(1991)，NatureLond.354:526-528；Denning等人，supra；Pasyk和Foskett(1995)，J.Cell.Biochem.270:12347-50)。除了ΔF508-CFTR以外，其他导致有缺陷的运输、合成和/或通道门控的致病性CFTR突变可能被增量或减量调节，以改变阴离子分泌和修改疾病进展和/或严重性。
尽管CFTR除了阴离子以外还转运多种分子，不过显然这种角色（阴离子的转运）代表了跨越上皮转运离子和水的重要机理中的一种要素。其他要素包括上皮Na+通道、ENaC、Na+/2Cl-/K+共同转运蛋白、Na+-K+-ATP酶泵和基底外侧膜K+通道，它们负责摄取氯化物进入细胞。
这些要素一起发挥作用，经由它们在细胞内的选择性表达和定位实现跨越上皮的定向转运。借助存在于顶端膜上的ENaC与CFTR和在细胞基底外侧表面上表达的Na+-K+-ATP酶泵与Cl-通道的协调活性，发生氯化物的吸收。氯化物从腔侧的次级主动转运引起细胞内氯化物的蓄积，然后可以被动地经由Cl-通道离开细胞，导致向量转运。Na+/2Cl-/K+共同转运蛋白、Na+-K+-ATP酶泵和基底外侧膜K+通道在基底外侧表面上的排列和腔侧上的CFTR协调氯化物经由腔侧上CFTR的分泌。因为水可能从不主动转运自己，它跨越上皮的流动依赖于由钠和氯的大量流动所生成的微小跨上皮渗透梯度。
除了囊性纤维化以外，CFTR活性的调控也可以有益于其他不直接由CFTR突变所导致的疾病，例如分泌性疾病和其他由CFTR介导的蛋白质折叠疾病。这些疾病包括但不限于慢性阻塞性肺疾病(COPD)、干眼病和斯耶格伦氏综合征。
COPD是以气流受限为特征的，它是进行性的，不是完全可逆的。气流受限是由于粘液分泌过多、肺气肿和细支气管炎。突变或野生型CFTR的活化剂提供COPD常见的粘液分泌过多和粘液纤毛廓清率减低的潜在治疗。具体而言，增加跨越CFTR的阴离子分泌可以有利于体液转运进入气道表面液体，以水化粘液，优化纤毛周围的体液粘度。这将引起粘液纤毛廓清率增强和与COPD有关的症状减少。干眼病是以泪水产生降低和异常泪膜脂质、蛋白质与粘蛋白行为为特征的。干眼有很多原因，其中一些包括年龄、Lasik眼手术、关节炎、药物治疗、化学/热灼伤、变态反应和疾病，例如囊性纤维化和斯耶格伦氏综合征。增加经由CFTR的阴离子分泌将增强体液从角膜内皮细胞和眼周围分泌腺体的转运，以增加角膜的水化作用。这将有助于缓解与干眼病有关的症状。斯耶格伦氏综合征是一种自身免疫疾病，其中免疫系统攻击体内各处产生水分的腺体，包括眼、口、皮肤、呼吸组织、肝、阴道和肠。症状包括眼、口和阴道干燥以及肺疾病。该疾病也与类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、系统性硬化和多肌炎/皮肤肌炎有关。有缺陷的蛋白质运输据信会导致该疾病，治疗选择是有限的。CFTR活性调控剂可以水化各种受疾病影响的器官，帮助改善有关症状。
正如上文所讨论的，据信ΔF508-CFTR中508残基的缺失防止初生蛋白正确地折叠，导致这种突变蛋白不能退出ER和运输至质膜。其结果是，存在于质膜的成熟蛋白数量不足，上皮组织内氯化物的转运显著减少。事实上，这种ABC转运蛋白被ER机构有缺陷的ER加工的细胞现象已被显示不仅是CF疾病的基础，而且是广泛的其他孤立性与遗传性疾病的基础。ER机构可能发生故障的两种方式要么是与蛋白质的ER输出的偶联丧失，引起降解，要么是这些有缺陷/误折叠的蛋白质的ER蓄积[AridorM,等人，NatureMed.，5(7)，pp745-751(1999)；Shastry，B.S.,等人，Neurochem.International，43，pp1-7(2003)；Rutishauser，J.,等人，SwissMedWkly，132，pp211-222(2002)；Morello，JP等人，TIPS，21，pp.466-469(2000)；BrossP.,等人，HumanMut.，14，pp.186-198(1999)]。与前一类ER故障有关的疾病有囊性纤维化（由误折叠的ΔF508-CFTR引起，正如上文所讨论的）、遗传性肺气肿（由a1-抗胰蛋白酶非Piz变体引起）、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷（例如C蛋白缺陷）、1型遗传性血管水肿、脂质加工缺陷（例如家族性高胆固醇血）、1型乳糜微粒血、无β脂蛋白血症、溶酶体贮存疾病（例如I-细胞疾病/假性Hurler）、粘多糖病（由溶酶体加工酶引起）、Sandhof/Tay-Sachs（由β-己糖胺酶引起）、Crigler-NajjarII型（由UDP-葡糖醛基-sialyc-转移酶引起）、多内分泌病/高胰岛素血、糖尿病（由胰岛素受体引起）、拉伦侏儒症（由生长激素受体引起）、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退（由前促甲状旁腺激素引起）、黑素瘤（由酪氨酸酶引起）。与后一类ER故障有关的疾病有聚糖病CDG1型、遗传性肺气肿（由α1-抗胰蛋白酶PiZ变体引起）、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全（由I、II、IV型前胶原引起）、遗传性低纤维蛋白原血（由纤维蛋白原引起）、ACT缺陷（由α1-抗凝乳蛋白酶引起）、尿崩症(DI)、后叶激素运载蛋白性DI（由加压素/V2-受体引起）、肾原性DI（由水通道蛋白II引起）、夏-马-图三氏综合征（由外周髓磷脂蛋白22引起）、佩-梅二氏病、神经变性疾病（例如阿尔茨海默氏病（由βAPP和早老蛋白引起）、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克氏病）、若干聚谷氨酰胺神经病学疾患（例如亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状核苍白球丘脑下核萎缩和肌强直性营养不良）以及海绵状脑病（例如遗传性克-雅二氏病（由朊病毒蛋白加工缺陷引起）、法布里氏病（由溶酶体α-半乳糖苷酶A引起）和斯-施二氏综合征、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、干眼病和斯耶格伦氏综合征。
除了CFTR活性的增量调节以外，通过CFTR调控剂来减少阴离子分泌也可以有益于分泌性腹泻的治疗，其中作为促分泌性活化的氯化物转运的结果，上皮水转运戏剧性地增加。该机理牵涉cAMP的升高和CFTR的刺激。
尽管腹泻有大量原因，不过由过量氯化物转运所致腹泻性疾病的主要后果是共同的，包括脱水、酸中毒、生长减退和死亡。
急性与慢性腹泻在世界很多地区代表了主要的医学问题。腹泻在不到五岁的儿童中既是营养不良的显著因素，又是死亡的主导原因（5,000,000例死亡/年）。
分泌性腹泻也是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和慢性炎性肠疾病(IBD)患者中的危险病症。每年从工业化国家到发展中国家旅行的人中有一千六百万人患上腹泻，腹泻病例的严重性和数量因旅行的国家和地区而异。
牲畜和宠物、例如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和狗的腹泻也称为家畜腹泻病，是这些动物死亡的主要原因。腹泻可以由任何重大转变所致，例如断奶或身体运动，以及响应于多种细菌或病毒感染，一般发生在动物寿命的前几个小时内。
最常见的致腹泻性细菌是肠毒原性大肠杆菌(ETEC)，具有K99毛发抗原。腹泻的常见病毒原因包括轮状病毒和冠形病毒。其他感染性成分包括隐孢子虫、兰伯氏贾第虫和沙门氏菌等等。
轮状病毒感染的症状包括水样便的排泄、脱水和虚弱。冠形病毒导致更严重的新生动物疾病，具有比轮状病毒感染更高的死亡率。不过经常是年幼动物可能同时感染有一种以上病毒或者病毒与细菌微生物的组合。这戏剧性地增加疾病的严重性。
因此，需要ABC转运蛋白活性的调控剂及其组合物，它们能够用于调控哺乳动物细胞膜中ABC转运蛋白的活性。
需要用ABC转运蛋白的这类调控剂来治疗ABC转运蛋白介导疾病的方法。
需要在来自体内的哺乳动物细胞膜中调控ABC转运蛋白活性的方法。
需要CFTR活性调控剂，从而在哺乳动物细胞膜中调控CFTR活性。
需要用这类CFTR活性调控剂治疗CFTR介导疾病的方法。
需要在来自体内的哺乳动物细胞膜中调控CFTR活性的方法。
发明概述
现已发现，本发明化合物及其药学上可接受的组合物可用作ABC转运蛋白活性特别是CFTR活性的调控剂。这些化合物具有通式I：
或其药学上可接受的盐，其中Ar1、RN、环A、环B、X、RX和x如下文所描述。
这些化合物及其药学上可接受的组合物可用于治疗多种疾病、疾患或病症或者减轻其严重性，包括但不限于囊性纤维化、遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷（例如C蛋白缺陷）、1型遗传性血管水肿、脂质加工缺陷（例如家族性高胆固醇血）、1型乳糜微粒血、无β脂蛋白血症、溶酶体贮存疾病（例如I-细胞疾病/假性Hurler）、粘多糖病、Sandhof/Tay-Sachs、Crigler-NajjarII型、多内分泌病/高胰岛素血、糖尿病、拉伦侏儒、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退、黑素瘤、聚糖病CDG1型、遗传性肺气肿、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血、ACT缺陷、尿崩症(di)、后叶激素运载蛋白性di、肾原性DI、夏-马-图三氏综合征、佩-梅二氏病、神经变性疾病（例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克氏病）、若干聚谷氨酰胺神经病学疾患（例如亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩和肌强直性营养不良）以及海绵状脑病（例如遗传性克-雅二氏病、法布里氏病和斯-施二氏综合征）、COPD、干眼病和斯耶格伦氏病。
发明详细内容
1.本发明化合物的一般说明：
本发明涉及可用作ABC转运蛋白活性特别是CFTR活性的调控剂的式I化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
Ar1是：
其中：
G1、G2、G3和G4各自独立地选自CH和氮，其中G1、G2、G3和G4中的一个是氮而G1、G2、G3和G4中其余的各自是CH；
Ar1通过G2或G3与N(RN)连接；
Ar1可选地被w次出现的-WRW取代；和
RN是H、R2或R3；
环A是3-7元单环的环，具有0-3个选自氧、硫和氮的杂原子，其中环A可选地被q次出现的-Q-RQ取代；
环B可选地稠合于选自环脂族基、芳基、杂环基和杂芳基的5-7元环，其中环B与所述可选稠合的环一起，可选地被x次出现的-XRX取代；
Q、W或X独立地是价键或者独立地是可选被取代的(C1-C6)亚烷基链，其中Q、W或X的至多两个亚甲基单元可选地和独立地被-CO-、-CS-、-COCO-、-CONR'-、-CONR'NR'-、-CO2-、-OCO-、-NR'CO2-、-O-、-NR'CONR'-、-OCONR'-、-NR'NR'、-NR'NR'CO-、-NR'CO-、-S-、-SO、-SO2-、-NR'-、-SO2NR'-、NR'SO2-或-NR'SO2NR'-代替；
RQ、RW和RX各自独立地是R1、R2、R3、R4或R5；
R'独立地是R2、R3或R6；
R1是氧代基、=NN(R6)2、=NN(R7)2、=NN(R6R7)、R6或((C1-C4)脂族基)n-Y;
其中n是0或1；和
Y是卤代基、CN、NO2、CF3、OCF3、OH、SR6、S(O)R6、SO2R6、NH2、NHR6、N(R6)2、NR6R8、COOH、COOR6或OR6；或者
两个相邻原子上的R1一起形成
其中J选自CH2、CF2、C(CH3)2、C(O)、C(苯基)2、B(OH)和CH(OEt)；
R2是脂族基，其中各R2可选地被至多2个独立地选自R1、R4和R5的取代基取代；
R3是环脂族基、芳基、杂环基或杂芳基环，其中R3可选地被至多3个独立地选自R1、R2、R4和R5的取代基取代；
R4是OR5、OR6、OC(O)R6、OC(O)R5、OC(O)OR6、OC(O)OR5、OC(O)N(R6)2、OC(O)N(R5)2、OC(O)N(R6R5)、SR6、SR5、S(O)R6、S(O)R5、SO2R6、SO2R5、SO2N(R6)2、SO2N(R5)2、SO2NR5R6、SO3R6、SO3R5、C(O)R5、C(O)OR5、C(O)R6、C(O)OR6、C(O)N(R6)2、C(O)N(R5)2、C(O)N(R5R6)、C(O)N(OR6)R6、C(O)N(OR5)R6、C(O)N(OR6)R5、C(O)N(OR5)R5、C(NOR6)R6、C(NOR6)R5、C(NOR5)R6、C(NOR5)R5、N(R6)2、N(R5)2、N(R5R6)、NR5C(O)R5、NR6C(O)R6、NR6C(O)R5、NR5C(O)R6、NR6C(O)OR6、NR5C(O)OR6、NR6C(O)OR5、NR5C(O)OR5、NR6C(O)N(R6)2、NR6C(O)NR5R6、NR6C(O)N(R5)2、NR5C(O)N(R6)2、NR5C(O)NR5R6、NR5C(O)N(R5)2、NR6SO2R6、NR6SO2R5、NR5SO2R6,NR5SO2R5、NR6SO2N(R6)2、NR6SO2NR5R6、NR6SO2N(R5)2、NR5SO2NR5R6、NR5SO2N(R5)2、N(OR6)R6、N(OR6)R5、N(OR5)R5或N(OR5)R6；
R5是环脂族基、芳基、杂环基或杂芳基环，其中R5可选地被至多3个R1取代；
R6是H或脂族基，其中R6可选地被R7取代；
R7是环脂族基、芳基、杂环基或杂芳基环，并且各R7可选地被至多2个独立地选自H、(C1-C6)-直链或支链烷基、(C2-C6)直链或支链烯基或炔基、1,2-亚甲二氧基、1,2-亚乙二氧基和(CH2)n-Z的取代基取代；
Z选自卤代基、CN、NO2、CF3、OCF3、OH、S-脂族基、S(O)-脂族基、SO2-脂族基、NH2、NH-脂族基、N(脂族基)2、N(脂族基)R8、NHR8、COOH、C(O)O(-脂族基)和O-脂族基；
R8是氨基保护基；
w是0到5；和
x和q各自独立地是0-5。
2.化合物和定义：
本发明化合物包括上文一般描述的那些，本文公开的种类、小类和品种会进一步阐述。正如本文所用，应当适用下列定义。
本文所用的术语“ABC-转运蛋白”表示包含至少一个结合结构域的ABC-转运蛋白或其片段，其中所述蛋白质或其片段是体内或体外存在的。本文所用的术语“结合结构域”表示ABC-转运蛋白上能够与调控剂结合的结构域。例如参见Hwang，T.C.等人，J.Gen.Physiol.(1998):111(3)，477-90。
本文所用的术语“CFTR”表示囊性纤维化跨膜传导调节剂或其有调节剂活性的突变体，包括但不限于ΔF508CFTR和G551DCFTR（例如参见http:// www.genet.sickkids.on.ca/cftr/关于CFTR突变）。
本文所用的术语“调控”表示增加或降低达到可测量的量。
出于本发明的目的，化学元素将根据元素周期表CAS版HandbookofChemistryandPhysics，第75版进行鉴定。另外，有机化学的一般原理描述在“OrganicChemistry”，ThomasSorrell，UniversityScienceBooks，Sausalito:1999和“March'sAdvancedOrganicChemistry”,第5版，Ed.:Smith，M.B.和March，J.，JohnWiley&Sons，NewYork:2001中，其完整内容引用在此作为参考。
正如本文所述，本发明化合物可以可选地被一个或多个取代基取代，例如上文概述所阐述的，或者如本发明的特定大类、小类和品种所例证的。将被领会到，措辞“可选被取代的”与措辞“取代或未取代的”是可互换使用的。一般而言，术语“取代”无论前面有无术语“可选”，都表示给定结构中的氢原子团被指定取代基的原子团所代替。除非另有指示，可选被取代的基团可以在该基团每个可取代的位置上具有取代基，若任意给定结构中一个以上位置可以被一个以上选自指定组的取代基所取代，则取代基可以在每个位置上是相同或不同的。本发明所关注的取代基组合优选地是能形成稳定的或化学上可行的化合物的那些。本文所用的措辞“稳定”表示在受到用于它们制备、检测、优选回收、纯化的条件和用于一种或多种本文所公开的目的时基本上不变的化合物。在有些实施方式中，稳定的化合物或化学上可行的化合物是在没有水分或其他化学反应性条件的存在下、在40℃或以下的温度下保持至少一周而基本上不发生变化的化合物。
本文所用的术语“脂族基”或“脂族基团”表示直链（即未分支）或支链的取代或未取代的烃链，其是完全饱和的或者含有一个或多个不饱和单元，或者表示单环烃或二环烃，其是完全饱和的或者含有一个或多个不饱和单元，但是不是芳族的（本文也称之为“碳环”、“环脂族基”或“环烷基”），其具有单一的与分子其余部分连接的点。除非另有指定，脂族基团含有1－20个脂族碳原子。在有些实施方式中，脂族基团含有1－10个脂族碳原子。在其他实施方式中，脂族基团含有1－8个脂族碳原子。在其他实施方式中，脂族基团含有1－6个脂族碳原子，在其他实施方式中，脂族基团含有1－4个脂族碳原子。在有些实施方式中，“环脂族基”（或者“碳环”或“环烷基”）表示单环C3-C8烃或二环C8-C12烃，其是完全饱和的或者含有一个或多个不饱和单元，但不是芳族的，其具有单一的与分子其余部分连接的点，其中所述二环环系中任意单一的环是3-7元环。适合的脂族基团包括但不限于直链或支链的取代或未取代的烷基、链烯基、炔基及其杂合物，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)链烯基。
本文所用的术语“杂脂族基”表示脂族基团，其中一个或两个碳原子独立地被一个或多个氧、硫、氮、磷或硅代替。杂脂族基团可以是取代或未取代的，分支或未分支的，环状或无环的，包括“杂环”、“杂环基”、“杂环脂族”或“杂环的”基团。
本文所用的术语“杂环”、“杂环基”、“杂环脂族”或“杂环的”等表示非芳族的单环、二环或三环环系，其中一个或多个环成员是独立选择的杂原子。在有些实施方式中，所述“杂环”、“杂环基”、“杂环脂族”或“杂环的”基团具有三至十四个环成员，其中一个或多个环成员是独立选自氧、硫、氮或磷的杂原子，该系统中每个环含有3至7个环成员。
术语“杂原子”表示一个或多个硼、氧、硫、氮、磷或硅（包括氮、硫、磷或硅的任意氧化形式；任意碱性氮或杂环可取代氮的季铵化形式，例如N（如在3,4-二氢-2H-吡咯基中）、NH（如在吡咯烷基中）或NR+（如在N-取代的吡咯烷基中））。
本文所用的术语“不饱和的”意味着该部分具有一个或多个不饱和单元。
本文所用的术语“烷氧基”或“硫代烷基”表示如前文所定义的烷基通过氧（“烷氧基”）或硫（“硫代烷基”）原子与主体碳链连接。
术语“卤代脂族基”和“卤代烷氧基”表示被一个或多个卤原子取代的脂族基或烷氧基，视情况而定。术语“卤素”表示F、Cl、Br或I。卤代脂族基的实例包括-CHF2、-CH2F、-CF3、-CF2-或全卤代烷基，比如，-CF2CF3。
单独或者作为更大部分“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的一部分使用的术语“芳基”表示具有总计五至十四个环成员的单环、二环和三环环系，其中该系统中至少一个环是芳族的，并且其中该系统中每一环含有3至7个环成员。术语“芳基”可以与术语“芳基环”互换使用。术语“芳基”也表示如下定义的杂芳基环系。
单独或者作为更大部分“杂芳烷基”或“杂芳基烷氧基”的一部分使用的术语“杂芳基”表示具有总计五至十四个环成员的单环、二环和三环环系，其中该系统中至少一个环是芳族的，该系统中至少一个环含有一个或多个杂原子，并且其中该系统中每一环含有3至7个环成员。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳基环”或术语“杂芳族基”互换使用。
芳基（包括芳烷基、芳烷氧基、芳氧基烷基等）或杂芳基（包括杂芳烷基和杂芳烷氧基等）可以含有一个或多个取代基。芳基或杂芳基基团的不饱和碳原子上的适宜取代基选自卤素、-Ro、-ORo、-SRo、1,2-亚甲二氧基、1,2-亚乙二氧基、可选被Ro取代的苯基(Ph)、可选被Ro取代的-O(Ph)、可选被Ro取代的-(CH2)1-2(Ph)、可选被Ro取代的-CH=CH(Ph)、-NO2、-CN、-N(Ro)2、-NR℃(O)Ro、-NR℃(O)N(Ro)2、-NR℃O2Ro、-NRoNR℃(O)Ro、-NRoNR℃(O)N(Ro)2、-NRoNR℃O2Ro、-C(O)C(O)Ro、-C(O)CH2C(O)Ro、-CO2Ro、-C(O)Ro、-C(O)N(Ro)2、-OC(O)N(Ro)2、-S(O)2Ro、-SO2N(Ro)2、-S(O)Ro、-NRoSO2N(Ro)2、-NRoSO2Ro、-C(=S)N(Ro)2、-C(=NH)-N(Ro)2、和-(CH2)0-2NHC(O)Ro，其中每次独立出现的Ro选自氢、可选被取代的C1-6脂族基、未取代的5-6元杂芳基或杂环基的环、苯基、-O(Ph)或-CH2(Ph)，或者尽管有如上定义，在相同取代基或不同取代基上的两次独立出现的Ro与每个Ro基团所键合的原子一起构成3-8元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环，具有0-3个独立选自氮、氧或硫的杂原子。Ro的脂族基团上可选的取代基选自NH2、NH(C1-4脂族基)、N(C1-4脂族基)2、卤素、C1-4脂族基、OH、O(C1-4脂族基)、NO2、CN、CO2H、CO2(C1-4脂族基)、O(卤代C1-4脂族基)和卤代C1-4脂族基，其中Ro的每个上述C1-4脂族基团是未取代的。
脂族或杂脂族基团或者非芳族杂环可以含有一个或多个取代基。脂族或杂脂族基团或者非芳族杂环的饱和碳原子上适合的取代基选自上面关于芳基或杂芳基不饱和碳所列举的那些，并且另外包括下列基团：=O、=S、=NNHR*、=NN(R*)2、=NNHC(O)R*、=NNHCO2(烷基)、=NNHSO2(烷基)和=NR*，其中每个R*独立地选自氢和可选被取代的C1-6脂族基。R*的脂族基团上可选的取代基选自NH2、NH(C1-4脂族基)、N(C1-4脂族基)2、卤素、C1-4脂族基、OH、O(C1-4脂族基)、NO2、CN、CO2H、CO2(C1-4脂族基)、O(卤代C1-4脂族基)和卤代C1-4脂族基，其中R*的每个上述C1-4脂族基团是未取代的。
非芳族杂环氮上可选的取代基选自-R+、-N(R+)2、-C(O)R+、-CO2R+、-C(O)C(O)R+、-C(O)CH2C(O)R+、-SO2R+、-SO2N(R+)2、-C(=S)N(R+)2、-C(=NH)-N(R+)2和-NR+SO2R+；其中R+是氢、可选被取代的C1-6脂族基、可选被取代的苯基、可选被取代的-O(Ph)、可选被取代的-CH2(Ph)、可选被取代的-(CH2)1-2(Ph)、可选被取代的-CH=CH(Ph)、或者具有一至四个独立选自氧、氮和硫的杂原子的未取代的5-6元杂芳基或杂环，或者尽管有如上定义，在相同取代基或不同取代基上的两次独立出现的R+与每个R+基团所键合的原子一起构成3-8元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环，具有0-3个独立选自氮、氧和硫的杂原子。R+的脂族基团或苯基环上可选的取代基选自NH2、NH(C1-4脂族基)、N(C1-4脂族基)2、卤素、C1-4脂族基、OH、O(C1-4脂族基)、NO2、CN、CO2H、CO2(C1-4脂族基)、O(卤代C1-4脂族基)和卤代（C1-4脂族基团），其中R+的每个上述C1-4脂族基团是未取代的。
术语“亚烷基链”表示直链或支链碳链，它可以是完全饱和的或者具有一个或多个不饱和单元，并且具有两个与分子其余部分连接的点。术语“亚螺环烷基”表示这样一种碳环的环，它可以是完全饱和的或者具有一个或多个不饱和单元，并且同一碳原子具有两个与分子其余部分连接的点。
如上所述，在有些实施方式中，两次独立出现的Ro（或者R+或本文相似定义的任意其他变量）与它们所键合的原子一起构成3－8元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环，具有0－3个独立选自氮、氧和硫的杂原子。两次独立出现的Ro（或者R+或本文相似定义的任意其他变量）与每个变量所键合的原子一起所构成的示范性环包括但不限于下列：a)两个独立出现的Ro（或者R+或本文相似定义的任意其他变量）键合于同一原子，并且与该原子一起构成一个环，例如N(Ro)2，其中出现的两个Ro与氮原子一起构成哌啶-1-基、哌嗪-1-基或吗啉-4-基；和b)两个独立出现的Ro（或者R+或本文相似定义的任意其他变量）键合于不同原子，并且与这些原子一起构成一个环，例如其中苯基被两次出现的ORo取代这两次出现的Ro与它们所键合的氧原子一起构成稠合的6-元含氧环：将被领会到，两次独立出现的Ro（或者R+或本文相似定义的任意其他变量）与每个变量所键合的原子一起可以构成多种其他环，上述详细实例不打算是限制性的。
除非另有规定，本文所描绘的结构也意味着包括该结构的所有异构（例如对映异构、非对映异构和几何异构（或构象异构））形式；例如每一不对称中心的R与S构型，(Z)与(E)双键异构体，和(Z)与(E)构象异构体。因此，这些化合物的单一立体化学异构体以及对映异构、非对映异构和几何异构(或构象异构)混合物都属于本发明的范围。除非另有规定，本发明化合物的所有互变异构形式都属于本发明的范围。另外，除非另有规定，本文所描绘的结构也意味着包括仅在一个或多个同位素富集原子的存在上有所不同的化合物。例如，除了氢被氘或氚代替或者碳被13C-或14C-富集的碳代替以外具有本发明结构的化合物都属于本发明的范围。这类化合物例如可用作生物学测定法中的分析工具或探针。
3.示范性化合物的说明：
在一个实施方式中，Ar1是可选被取代的环，选自：
在某些实施方式中，Ar1是可选被取代的基团，选自Ar-i、Ar-ii、Ar-iii和Ar-iv。
在某些实施方式中，Ar1是可选被取代的基团，通过G2或G3原子与N(RN)氮原子连接。
在一种实施方式中，RN是氢。在另一个实施方式中，RN是可选被取代的C1-C6脂族基。或者，RN是C1-C4烷基。示范性实施方式包括甲基、乙基或异丙基。
在某些实施方式中，环A是可选被取代的3-7元环脂族基环。
在其它实施方式中，环A是可选被取代的3-7元环，包含1个选自O、NH和S的杂原子。或者，环A包含至多两个选自O、S和NH的杂原子。
在一个实施方式中，环A选自：
环A优选选自a、b、c、d和l。
在一个实施方式中，环B稠合于5-7元杂环基或杂芳基环，具有至多3个独立选自B、O、N和S的杂原子。
在另一个实施方式中，环B稠合于5-6元杂环基环，具有至多3个独立选自B、O、N和S的杂原子。
在另一个实施方式中，环B稠合于5-6元杂芳基环，具有至多3个独立选自O、N和S的杂原子。
在又一个实施方式中，环B与所述稠合的环一起，可选地被至多两个RX取代基取代。
在另一个实施方式中，RX取代基是R1。
在另一个实施方式中，所述稠合于环B的环选自：
在某些实施方式中，稠合于环B的环选自i、ii、iii、viii、ix、x、xi、xii、xiii和xvi。在某些实施方式中，稠合于环B的环选自i、ii、iii、ix、xi、xii、xiii和xvi。在其它实施方式中，稠合于环B的环是i。或者，稠合于环B的环是ii。或者是iii。
根据另一个实施方式，R1是R6，其中R6是直链或支链(C1-C6)烷基或(C2-C6)烯基或炔基，可选地被R7取代。
根据另一个实施方式，R1是(C1-C4脂族基)n-Y，其中n是0或1并且Y是卤代基、CN、NO2、CF3、OCF3、OH、SR6、S(O)R6、SO2R6、NH2、NHR6、N(R6)2、NR6R8、COOH、COOR6或OR6。
根据另一个实施方式，R1选自卤代基、CF3、NH2、NH(C1-C4烷基)、NHC(O)CH3、OH、O(C1-C4烷基)、OPh、O-苄基、S-(C1-C4烷基)、C1-C4脂族基、CN、SO2NH(C1-C4烷基)和SO2N(C1-C4烷基)2。根据又一个实施方式，两个R1一起选自亚甲二氧基、二氟亚甲二氧基和亚乙二氧基。
根据另一个实施方式，R1选自甲基、正丙基、异丙基、叔丁基、环丙基甲基、环丙基、卤代基、CF3、NH2、NH(CH3)、NHC(O)CH3、OH、OCH3、OPh、O-苄基、S-(C2H5)、S-CH3、NO2、CN、SO2NH(正丙基)和SO2N(正丙基)2。根据又一个实施方式，两个R1一起选自亚甲二氧基和二氟亚甲二氧基。
根据一个实施方式，R2是直链或支链(C1-C6)烷基或(C2-C6)烯基或炔基，可选地被R1、R4或R5取代。在某些实施方式中，R2是直链或支链(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基或炔基，可选地被R1、R4或R5取代。根据其它实施方式，R2是直链或支链(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基或炔基。
根据一个实施方式，R3是环脂族基、芳基、杂环基或杂芳基环，其中R3可选地被至多3个独立选自R1、R2、R4和R5的取代基取代。在一个实施方式中，R3是C3-C8环脂族基，可选地被至多3个独立选自R1、R2、R4和R5的取代基取代。示范性环脂族基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。在另一个实施方式中，R3是C6-C10芳基，可选地被至多3个独立选自R1、R2、R4和R5的取代基取代。示范性芳基环包括苯基或萘基。在另一个实施方式中，R3是C3-C8杂环基，可选地被至多3个独立选自R1、R2、R4和R5的取代基取代。示范性杂环基环包括氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基或硫代吗啉基。在另一个实施方式中，R3是C5-C10杂芳基环，可选地被至多3个独立选自R1、R2、R4和R5的取代基取代。示范性杂芳基环包括吡啶基、吡嗪基(pyrazyl)、三嗪基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、咪唑基、三唑基、噻二唑基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚嗪基、吲哚基、异吲哚基、吲哚啉基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基（naphthylirinyl）或蝶啶基。
根据一个实施方式，R4选自OR5、OR6、SR5、SR6、NR5COR5、NR5COR6、NR6COR5和NR6COR6。
根据一个实施方式，R5是C5-C6环烷基、C6或C10芳基、C5-C10杂芳基或C3-C7杂环基，可选地被至多2个R1取代。在某些实施方式中，R5是可选被取代的环己基、苯基、C5-C6杂芳基或C3-C6杂环基。
根据一个实施方式，R6是H。
根据另一个实施方式，R6是直链或支链(C1-C6)烷基或(C2-C6烯基)或炔基，可选地被R7取代。
根据另一个实施方式，R6是直链或支链(C1-C6)烷基或(C2-C6烯基)或炔基。
根据一个实施方式，R7是C5-C6环烷基、苯基、萘基、C5-C10杂芳基或C3-C7杂环基，可选地被直链或支链(C1-C6)烷基或(C2-C6烯基)或炔基取代。或者，R7是C5-C6环烷基、苯基、萘基、C5-C10杂芳基或C3-C7杂环基，可选地被亚甲二氧基、二氟亚甲二氧基、亚乙二氧基或(CH2)n-Z取代。在某些实施方式中，R7是可选被取代的环己基、苯基、C5-C6杂芳基或C3-C6杂环基。
根据一个实施方式，R8是乙酰基、芳基磺酰基或C1-C6烷基磺酰基。
在某些实施方式中，J是CH2。在其它实施方式中，J是CF2。或者，J是C(CH3)2。或者，J是C(O)。或者，J是或者，J是或者，J是或者，J是或者，J是C(苯基)2。或者，J是B(OH)。或者，J是CH(OEt)。
在一个实施方式中，Q是价键。或者，Q是(C1-C6)亚烷基链。或者，Q是(C1-C6)亚烷基链，其中至多两个亚甲基单元可选地和独立地被-CO-、-CS-、-COCO-、-CONR'-、-CONR'NR'-、-CO2-、-OCO-、-NR'CO2-、-O-、-NR'CONR'-、-OCONR'-、-NR'NR'、-NR'NR'CO-、-NR'CO-、-S-、-SO、-SO2-、-NR'-、-SO2NR'-、NR'SO2-或-NR'SO2NR'-代替；在一个实施方式中，所述其中至多两个亚甲基单元任选地和独立地被-CO-、-CONR'-、-CO2-、-OCO-、-NR'CO2-、-O-、-NR'CONR'-、-OCONR'-、-NR'CO-、-S-、-SO、-SO2-、-NR'-、-SO2NR'-、NR'SO2-或-NR'SO2NR'-代替。或者，所述其中至多两个亚甲基任选地和独立地被-CO-、-O-、-S-、-NR'-、-CO2-或-SO2-代替。
在一个实施方式中，w是0-3。在另一个实施方式中，w是1-3。
在某些实施方式中，W是价键。在其它实施方式中，W是可选被取代的(C1-C6)亚烷基链，其中W的至多两个亚甲基单元任选地和独立地被-CO-、-CONR'-、-CO2-、-OCO-、-NR'CO2-、-O-、-NR'CONR'-、-OCONR'-、-NR'CO-、-S-、-SO、-SO2-、-NR'-、-SO2NR'-、NR'SO2-或-NR'SO2NR'-代替。或者，W是可选被取代的(C1-C6)亚烷基链，其中W的至多两个不相邻的亚甲基单元可选地被-CONR'-、-CO2-、-O-、-S-、-SO2-、-NR'-,或-SO2NR'-代替。
在某些实施方式中，RW独立地是R2或R3。
在另一个实施方式中，RW是C1-C6脂族基，可选地被至多四个选自R1、R4和R5的取代基取代。
在另一个实施方式中，RW是C6-C10芳基，可选地被至多五个选自R1、R4和R5的取代基取代。
在又一个实施方式中，RW是3-10元单环或双环杂环基环，可选地被至多五个选自R1、R4和R5的取代基取代。
在另一个实施方式中，RW是5-10元单环或双环杂芳基环，可选地被至多五个选自R1、R4和R5的取代基取代。
在可供选择的实施方式中，x是1-5。在某些实施方式中，x是1；在其他实施方式中，x是2；在一些其他实施方式中，x是3；在其他实施方式中，x是4；在其他实施方式中，x是5。
在某些实施方式中，X是价键。在某些其它实施方式中，X是(C1-C6)亚烷基链，其中一个或两个不相邻的亚甲基单元任选地和独立地被O、NR'、S、SO2、COO或CO代替。在某些实施方式中，RX是R2或R3。
在另一种实施方式中，本发明提供式II化合物：
其中：
Rx、X、x、RN、G1、G2、G3和G4如前文所定义；
m是0到4；
Ar1是：
其中G1、G2、G3和G4中的一个是氮并且G1、G2、G3和G4中其余的各自是CH；
其中Ar1通过G2或G3与N(RN)连接；
Ar1可选地被至多3个RW取代基取代，其中RW各自独立地选自R1、R2、R3和R4。
在一个实施方式中，Ar1通过原子G2连接。
在其它实施方式中，Ar1通过原子G3连接。
在另一种实施方式中，本发明提供式IIIA或式IIIB的化合物：
其中RX、X、x、m、RN、G1、G2、G3和G4如前文所定义；和
RW各自独立地选自R1、R2、R3和R4。
在IIIA的一个实施方式中，G1是N，G2和G4各自是CH，并且G3是C。在IIIA的另一个实施方式中，G2是N，G1和G4各自是CH，并且G3是C。在IIIA的又一个实施方式中，G4是N，G1和G2各自是CH，并且G3是C。在IIIB的一个实施方式中，G1是N，G3和G4各自是CH，并且G2是C。在IIIB的另一个实施方式中，G3是N，G1和G4各自是CH，并且G2是C。在IIIB的又一个实施方式中，G4是N，G1和G3各自是CH，并且G2是C。
在一个实施方式中，RW是R6或((C1-C4)脂族基)n-Y；
n是0或1；和
Y是卤代基、CN、NO2、CF3、OCF3、OH、SR6、S(O)R6、SO2R6、NH2、NHR6、N(R6)2、NR6R8、COOH、COOR6或OR6。
在一个实施方式中，RW是C1-C6脂族基，可选地被至多四个独立选自R1、R4和R5的取代基取代。
在另一个实施方式中，RW是C6-C10芳基，可选地被至多五个选自R1、R4和R5的取代基取代。
在又一个实施方式中，RW是3-10元单环或双环杂环基环，可选地被至多五个选自R1、R4和R5的取代基取代。
在另一个实施方式中，RW是5-10元单环或双环杂芳基环，可选地被至多五个独立选自R1、R4和R5的取代基取代。
在某些实施方式中，本发明提供式IVA、式IVB或式IVC的化合物：
其中Rx、X、x和RW如前文所定义。
在一个实施方式中，与2号碳连接的RW是R2或R3。
在某些实施方式中，与2号碳连接的RW是C1-C6脂族基，可选地被至多四个选自R1、R4和R5的取代基取代。
在某些实施方式中，与2号碳连接的RW是可选被取代的C1-C6烷基。
在某些实施方式中，与2号碳连接的RW是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、1-甲基环丙基或叔丁基。
在某些实施方式中，与2号碳连接的RW是叔丁基。
在某些实施方式中，与2号碳连接的RW是乙基。
在某些实施方式中，与2号碳连接的RW是1-甲基环丙基。
在某些实施方式中，与3号碳连接的RW是H。
在某些实施方式中，本发明提供式VA、式VB或式VC的化合物：
其中Rx、X、x和RW如前文所定义。
在某些实施方式中，W是可选被取代的C1-C6亚烷基。
在某些实施方式中，W是被羟基、烷氧基或氨基所取代的C1-C6亚烷基。
在某些实施方式中，W是被羟基取代的C1-C6亚烷基。
在某些实施方式中，Rw是R4。
在某些实施方式中，Rw是OR6。
在某些实施方式中，Rw是OH。
在某些实施方式中，W是可选被取代的C1-C6亚烷基并且Rw是OR6。
在某些实施方式中，W是被羟基、烷氧基或氨基所取代的C1-C6亚烷基并且Rw是OH。
在某些实施方式中，-WRw是-C2H4OH或-CH2CH(OH)CH2OH。
示范性的本发明化合物列于下面的表1中。
表1
4.一般合成流程
式I化合物可以通过本领域熟知的方法来制备。下面阐述制备式I化合物的示范性方法。下述的流程I阐述式I化合物的示范性合成方法。
合成流程
本发明化合物可以通过已知方法制备，阐述于流程I-IX中。
流程I
a)SOCl2、DMF(cat.)、DCM；b)HNRNAr1、pyr.；c)HNRNAr1、HATU、TEA、DCM/DMF。
流程II
a)NaOH，BTEAC，Δ；NaOH，Δ
流程III
a)NaOH，BTEAC，Δ；b)NaOH，Δ
该苯基乙腈是可商购的或可以如流程IV所示来制备。
流程IV
a)Pd(PPh3)4，CO，MeOH；b)LiAlH4，THF；c)SOCl2；d)NaCN；e)NBS或NCl，AIBN，CX4(X=Br或Cl)
流程V
a)I2，/Ag2SO4，EtOH；b)HC≡C-R’’，Pd(PPh3)2Cl2，CuI，Et3N，甲苯/H2O；c)RC(O)Cl，吡啶，CH2Cl2；d)t-BuOK，DMF；e)CuSO4，NH3/MeOH
流程VI
a)Boc2O，DMAP，Et3N，CH2Cl2；b)n-BuLi，TMEDA，Et2O；I2；c)HC≡C-R’’，Pd(PPh3)2Cl2，CuI，Et3N，甲苯/H2O；d)TBAF，THF；e)CuSO4，NH3/MeOH
流程VII
a)Boc2O，DMAP，Et3N，CH2Cl2；b)n-BuLi，TMEDA，Et2O；I2；c)3MHCl；d)HC≡C-R’’，Pd(PPh3)2Cl2，CuI，Et3N，甲苯/H2O；e)tBuOK，DMF；f)CuSO4，NH3/MeOH
流程VIII
a)Br2，H2SO4；b)HC≡C-R’’，Pd(PPh3)2Cl2，CuI，Et3N，甲苯/H2O；c)TBAF，THF；d)H2，兰尼Ni，MeOH
流程IX
a)R’’’CHO，NaBH3CN，CF3CO2H；b)HC≡C-R’’，Pd(PPh3)2Cl2，CuI，Et3N；c)t-BuOK，DMF；d)NH3(aq)/CuSO4，高压釜。
在上述流程中，其中所用的基团R是取代基，例如，如前文所定义的RW。本领域技术人员会容易地理解适于本发明的各种取代基的合成路线是上述反应条件和步骤。
5.用途、制剂和给药
药学上可接受的组合物
如前文所讨论，本发明提供可用作ABC转运蛋白调控剂并因此可用于治疗疾病、疾患或病症的化合物，比如囊性纤维化、遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷（例如C蛋白缺陷）、1型遗传性血管水肿、脂质加工缺陷（例如家族性高胆固醇血）、1型乳糜微粒血、无β脂蛋白血症、溶酶体贮存疾病（例如I-细胞疾病/假性Hurler）、粘多糖病、Sandhof/Tay-Sachs、Crigler-NajjarII型、多内分泌病/高胰岛素血、糖尿病、拉伦侏儒、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退、黑素瘤、聚糖病CDG1型、遗传性肺气肿、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血、ACT缺陷、尿崩症(DI)、后叶激素运载蛋白性DI、肾原性DI、夏-马-图三氏综合征、佩-梅二氏病、神经变性疾病（例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克氏病）、若干聚谷氨酰胺神经病学疾患（例如亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩和肌强直性营养不良）以及海绵状脑病（例如遗传性克-雅二氏病（由于朊病毒蛋白质处理缺陷）、法布里氏病和斯-施二氏综合征）、COPD、干眼病和斯耶格伦氏病。
因此，在本发明的另一方面，提供药学上可接受的组合物，其中这些组合物包含任意如本文所述的化合物，并且可选地包含药学上可接受的载体、助剂或赋形剂。在某些实施方式中，这些组合物可选地进一步包含一种或多种附加治疗剂。
也将被领会到，某些本发明化合物能够以游离形式存在供治疗，或者酌情为其药学上可接受的衍生物。按照本发明，药学上可接受的衍生物包括但不限于药学上可接受的盐、酯、这类酯的盐、或者任意其他加合物或衍生物，一旦对需要的患者给药即能够直接或间接提供如本文所述的化合物或者其代谢产物或残余物。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示这样的盐，在合理的医学判断范围内，它们适合用于与人体和低等动物组织接触，没有不适当的毒性、刺激性、变态反应等，与合理的利益/风险比相称。“药学上可接受的盐”表示本发明化合物的任意无毒性盐或酯盐，一旦对接受者给药，即能够直接或间接提供本发明化合物或者其抑制活性代谢产物或残余物。如本文所用，术语“其抑制活性代谢产物或残余物”表示其代谢产物或残余物也是ATP-结合盒转运蛋白的抑制剂。
药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等在J.PharmaceuticalSciences，1977，66，1-19中详细描述了药学上可接受的盐，引用在此作为参考。本发明化合物的药学上可接受的盐包括从适合的无机与有机酸与碱衍生的那些。药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例是与无机酸或有机酸生成的氨基盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，有机酸例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，或者利用本领域所用的其他方法，例如离子交换形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对-甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。从适当的碱衍生的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N+(C1-4烷基)4盐。本发明也涵盖如本文所公开的化合物的任意碱性含氮基团的季铵化作用。借助这类季铵化作用可以得到可溶于水或油或可分散在水或油中的产物。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。在适当时，其他药学上可接受的盐包括无毒的铵盐、季铵盐和胺阳离子盐，利用抗衡离子生成，例如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐。
如上所述，本发明的药学上可接受的组合物另外包含药学上可接受的载体、助剂或赋形剂，正如本发明中所述，它们包括适合于所需的特定剂型的任意和所有溶剂、稀释剂或其他液体赋形剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington'sPharmaceuticalSciences，SixteenthEdition，E.W.Martin(MackPublishingCo.，Easton，Pa.，1980)公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。除了任何常规载体介质与本发明化合物不相容以外，例如产生任何不可取的生物学效应或者以有害方式相互作用于药学上可接受的组合物的任何其他组分，它的使用涵盖在本发明的范围内。能够充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于离子交换剂；氧化铝；硬脂酸铝；卵磷脂；血清蛋白质，例如人血清白蛋白；缓冲物质，例如磷酸盐；甘氨酸；山梨酸或山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物；水；盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐；胶体二氧化硅；三硅酸镁；聚乙烯吡咯烷酮；聚丙烯酸酯；蜡类；聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物；羊毛脂；糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉碎的黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇或聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及其他无毒的可相容的润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁；根据制剂人员的判断，在组合物中也可以存在着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香料、防腐剂和抗氧化剂。
化合物和药学上可接受的组合物的用途
另一方面，本发明提供治疗牵涉ABC转运蛋白活性的病症、疾病或疾患的方法。在某些实施方式中，本发明提供治疗牵涉ABC转运蛋白活性缺陷的病症、疾病或疾患的方法，该方法包含对有此需要的受治疗者、优选哺乳动物给予包含式(I)化合物的组合物。
在某些优选实施方式中，本发明提供治疗如下疾病的方法：囊性纤维化、遗传性肺气肿（由a1-抗胰蛋白酶非Piz变体引起）、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷（例如C蛋白缺陷）、1型遗传性血管水肿、脂质加工缺陷（例如家族性高胆固醇血）、1型乳糜微粒血、无β脂蛋白血症、溶酶体贮存疾病（例如I-细胞疾病/假性Hurler）、粘多糖病（由溶酶体加工酶引起）、Sandhof/Tay-Sachs（由β-己糖胺酶引起）、Crigler-NajjarII型（由UDP-葡糖醛基-sialyc-转移酶引起）、多内分泌病/高胰岛素血、糖尿病（由胰岛素受体引起）、拉伦侏儒症（由生长激素受体引起）、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退（由前促甲状旁腺激素引起）、黑素瘤（由酪氨酸酶引起）。与后一类ER故障有关的疾病有聚糖病CDG1型、遗传性肺气肿（由α1-抗胰蛋白酶PiZ变体引起）、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全（由I、II、IV型前胶原引起）、遗传性低纤维蛋白原血（由纤维蛋白原引起）、ACT缺陷（由α1-抗凝乳蛋白酶引起）、尿崩症(DI)、后叶激素运载蛋白性DI（由加压素/V2-受体引起）、肾原性DI（由水通道蛋白II引起）、夏-马-图三氏综合征（由外周髓磷脂蛋白22引起）、佩-梅二氏病、神经变性疾病（例如阿尔茨海默氏病（由βAPP和早老蛋白引起）、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克氏病）、若干聚谷氨酰胺神经病学疾患（例如亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状核苍白球丘脑下核萎缩和肌强直性营养不良）以及海绵状脑病（例如遗传性克-雅二氏病（由朊病毒蛋白加工缺陷引起）、法布里氏病（由溶酶体α-半乳糖苷酶A引起）和斯-施二氏综合征，包含对所述哺乳动物给予有效量的包含式(I)化合物的组合物的步骤，或如前文所述的其优选实施方式。
按照替代的优选实施方式，本发明提供治疗囊性纤维化的方法，包含对所述哺乳动物给予有效量的包含式(I)化合物的组合物的步骤，或如前文所述的其优选实施方式。
按照本发明，化合物或药学上可接受的组合物的“有效量”是有效治疗一种或多种如下疾病或者减轻其严重性的量：囊性纤维化、遗传性肺气肿（由a1-抗胰蛋白酶非Piz变体引起）、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷（例如C蛋白缺陷）、1型遗传性血管水肿、脂质加工缺陷（例如家族性高胆固醇血）、1型乳糜微粒血、无β脂蛋白血症、溶酶体贮存疾病（例如I-细胞疾病/假性Hurler）、粘多糖病（由溶酶体加工酶引起）、Sandhof/Tay-Sachs（由β-己糖胺酶引起）、Crigler-NajjarII型（由UDP-葡糖醛基-sialyc-转移酶引起）、多内分泌病/高胰岛素血、糖尿病（由胰岛素受体引起）、拉伦侏儒症（由生长激素受体引起）、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退（由前促甲状旁腺激素引起）、黑素瘤（由酪氨酸酶引起）。与后一类ER故障有关的疾病有聚糖病CDG1型、遗传性肺气肿（由α1-抗胰蛋白酶PiZ变体引起）、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全（由I、II、IV型前胶原引起）、遗传性低纤维蛋白原血（由纤维蛋白原引起）、ACT缺陷（由α1-抗凝乳蛋白酶引起）、尿崩症(DI)、后叶激素运载蛋白性DI（由加压素/V2-受体引起）、肾原性DI（由水通道蛋白II引起）、夏-马-图三氏综合征（由外周髓磷脂蛋白22引起）、佩-梅二氏病、神经变性疾病（例如阿尔茨海默氏病（由βAPP和早老蛋白引起）、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克氏病）、若干聚谷氨酰胺神经病学疾患（例如亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状核苍白球丘脑下核萎缩和肌强直性营养不良）以及海绵状脑病（例如遗传性克-雅二氏病（由朊病毒蛋白加工缺陷引起）、法布里氏病（由溶酶体α-半乳糖苷酶A引起）和斯-施二氏综合征。
根据本发明方法的化合物和组合物可以利用就治疗如下疾病或者减轻其严重性而言有效的任意量和任意给药途径加以给药：囊性纤维化、遗传性肺气肿（由a1-抗胰蛋白酶非Piz变体引起）、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷（例如C蛋白缺陷）、1型遗传性血管水肿、脂质加工缺陷（例如家族性高胆固醇血）、1型乳糜微粒血、无β脂蛋白血症、溶酶体贮存疾病（例如I-细胞疾病/假性Hurler）、粘多糖病（由溶酶体加工酶引起）、Sandhof/Tay-Sachs（由β-己糖胺酶引起）、Crigler-NajjarII型（由UDP-葡糖醛基-sialyc-转移酶引起）、多内分泌病/高胰岛素血、糖尿病（由胰岛素受体引起）、拉伦侏儒症（由生长激素受体引起）、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退（由前促甲状旁腺激素引起）、黑素瘤（由酪氨酸酶引起）。与后一类ER故障有关的疾病有聚糖病CDG1型、遗传性肺气肿（由α1-抗胰蛋白酶PiZ变体引起）、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全（由I、II、IV型前胶原引起）、遗传性低纤维蛋白原血（由纤维蛋白原引起）、ACT缺陷（由α1-抗凝乳蛋白酶引起）、尿崩症(DI)、后叶激素运载蛋白性DI（由加压素/V2-受体引起）、肾原性DI（由水通道蛋白II引起）、夏-马-图三氏综合征（由外周髓磷脂蛋白22引起）、佩-梅二氏病、神经变性疾病（例如阿尔茨海默氏病（由βAPP和早老蛋白引起）、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克氏病）、若干聚谷氨酰胺神经病学疾患（例如亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状核苍白球丘脑下核萎缩和肌强直性营养不良）以及海绵状脑病（例如遗传性克-雅二氏病（由朊病毒蛋白加工缺陷引起）、法布里氏病（由溶酶体α-半乳糖苷酶A引起）和斯-施二氏综合征。
所需确切的量将因受治疗者而异，取决于受治疗者的种类、年龄与一般状态、感染的严重性、特定药物、其给药的方式等。本发明化合物优选地被配制成剂量单元形式，有易于给药和剂量的一致性。本文所用的表达方式“剂量单元形式”表示物理上离散的药物单元，对所治疗的患者而言是适当的。不过将被理解到，本发明化合物和组合物的总每日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任意特定患者或生物体的具体有效剂量水平将依赖于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重性；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药的时间、给药的途径和所采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物联合或同时使用的药物；和医药领域熟知的其他因素。本文所用的术语“患者”表示动物，优选哺乳动物，最优选人。
本发明的药学上可接受的组合物可以对人和其他动物口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部（以粉剂、软膏剂或滴剂）、口腔、以口用或鼻用喷雾剂等方式给药，这依赖于所治疗感染的严重性。在某些实施方式中，本发明化合物可以被口服或肠胃外给药，剂量水平为每天约0.01mg/kg至约50mg/kg、优选约1mg/kg至约25mg/kg受治疗者体重，一天一次或多次，以获得所需的治疗效果。
口服给药的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬液、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄基酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油（特别是棉籽油、花生油、玉米油、麦胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，和它们的混合物。除了惰性稀释剂以外，口服组合物也可以包括助剂，例如湿润剂、乳化与悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
使用适合的分散或湿润剂和悬浮剂，可以按照已知技术配制可注射制备物，例如无菌可注射的水性或油性悬液。无菌可注射制备物也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬液或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的载体和溶剂有水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，常规采用无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何温和的固定油，包括合成的单-或二-甘油酯。另外，在注射剂的制备中也可以使用脂肪酸，例如油酸。
可注射制剂可以这样进行灭菌，例如通过细菌截留性滤器过滤，或者掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，可以在使用前将其溶解或分散在无菌的水或其他无菌可注射介质中。
为了延长本发明化合物的作用，经常需要延缓化合物在皮下或肌内注射后的吸收。这可以利用水溶性差的结晶性或无定形物质的液体悬液来实现。化合物的吸收速率取决于它的溶解速率，而后者又可能取决于晶体大小和晶型。作为替代选择，将化合物溶解或悬浮在油类载体中，实现肠胃外给药化合物形式的延迟吸收。可注射的储库形式是这样制备的，在生物可降解的聚合物中，例如聚交酯-聚乙醇酸交酯，生成化合物的微囊包封基质。根据化合物与聚合物的比例和所采用特定聚合物的属性，可以控制化合物的释放速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型可注射制剂也可以将化合物包合在与机体组织相容的脂质体或微乳中来制备。
直肠或阴道给药组合物优选地是栓剂，它们可以这样制备，将本发明化合物与适合的无刺激性赋形剂或载体混合，例如可可脂、聚乙二醇或栓剂用蜡，它们在环境温度下是固体，但是在体温下是液体，因此在直肠或阴道腔中融化，释放出活性化合物。
口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这类固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或a)填充剂或增容剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)润湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶解迟延剂，例如石蜡，f)吸收促进剂，例如季铵化合物，g)湿润剂，例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，和i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可以包含缓冲剂。
也可以采用相似类型的固体组合物作为软或硬的填充的明胶胶囊剂中的填充剂，胶囊所用赋形剂例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。片剂、锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂等固体剂型可以带有包衣和外壳，例如肠溶衣和药物配制领域熟知的其他包衣。它们可以可选地含有遮光剂，也可以是仅仅或优先在肠道某一部分释放活性成分的组合物，可选地为延迟的方式。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡类。也可以采用相似类型的固体组合物作为软或硬的填充的明胶胶囊剂中的填充剂，胶囊所用赋形剂例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。
活性化合物也可以是微囊包封的形式，其中含有一种或多种上述赋形剂。片剂、锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂等固体剂型可以带有包衣和外壳，例如肠溶衣、释放控制性包衣和药物配制领域熟知的其他包衣。在这类固体剂型中，可以将活性化合物与至少一种惰性稀释剂混合，例如蔗糖、乳糖或淀粉。在正常情况下，这类剂型也可以包含除惰性稀释剂以外的其他物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型也可以包含缓冲剂。它们可以可选地含有遮光剂，也可以是仅仅或优先在肠道某一部分释放活性成分的组合物，可选地为延迟的方式。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡类。
本发明化合物的局部或透皮给药剂型包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。将活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何必需的防腐剂或缓冲剂混合，根据需要而定。眼科制剂、滴耳剂和滴眼剂也被涵盖在本发明的范围内。另外，本发明涵盖透皮贴剂的使用，它们具有控制化合物向机体递送的附加优点。这类剂型可以通过将化合物溶解或分散在恰当的介质中来制备。也可以使用吸收增强剂以增加化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或者将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。
正如上文一般性描述的，本发明化合物可用作ABC转运蛋白的调控剂。因而，不希望受任意特定理论所限，化合物和组合物特别可用于治疗疾病、病症或疾患或者减轻其严重性，其中ABC转运蛋白的活性过高或无活性在该疾病、病症或疾患中有牵连。当ABC转运蛋白的活性过高或无活性在特定疾病、病症或疾患中有牵连时，该疾病、病症或疾患也可以被称为“ABC转运蛋白-介导的疾病、病症或疾患”。因此，在另一方面，本发明提供治疗疾病、病症或疾患或者减轻其严重性的方法，其中ABC转运蛋白的活性过高或无活性在该疾病状态中有牵连。
在本发明中用作ABC转运蛋白调控剂的化合物的活性可以按照本领域中和本文实施例中一般描述的方法来测定。
也将被领会到，本发明的化合物和药学上可接受的组合物可以用在联合疗法中，也就是说，化合物和药学上可接受的组合物可以在一种或多种其他所需治疗剂或医药程序同时、之前或随后给药。用在联合方案中的特定疗法组合（治疗剂或程序）将考虑所需治疗剂和/或程序与所要达到的所需治疗效果的可相容性。也将被领会的是，所用疗法可以对同一病症达到所需效果（例如，本发明化合物可以与另一种用于治疗同一病症的药物同时给药），或者它们可以达到不同的效果（例如控制任何副作用）。正如本文所用的，在正常情况下给药以治疗或预防特定疾病或病症的附加治疗剂被称为“就所治疗的疾病或病症而言是适当的”。
附加治疗剂在本发明组合物中的含量将不超过在包含该治疗剂作为唯一活性成分的组合物中通常的给药量。优选地，附加治疗剂在目前所公开的组合物中的量将是通常的包含该药物作为唯一治疗活性成分的组合物中的含量的约50%至100%。
本发明化合物或其药学上可接受的组合物也可以引入到涂覆可植入医药装置的组合物中，例如假肢、人工瓣膜、脉管移植物、支架和导管。因此，本发明在另一方面包括涂覆可植入装置的组合物，包含如上一般性描述和在本文大类与小类中所述的本发明化合物，和适合于涂覆所述可植入装置的载体。在另一方面，本发明包括涂有组合物的可植入装置，所述组合物包含如上一般性描述和在本文大类与小类中所述的本发明化合物，和适合于涂覆所述可植入装置的载体。适合的涂料和涂覆可植入装置的一般制备方法描述在美国专利6,099,562、5,886,026和5,304,121中。涂料通常是生物可相容的聚合材料，例如水凝胶聚合物、聚甲基二硅氧烷、聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和它们的混合物。涂料可以可选地进一步被适合的氟硅酮、多糖、聚乙二醇、磷脂或其组合的表层所覆盖，以赋予组合物的控释特征。
本发明的另一个方面涉及调控生物样品或患者中（例如，体外或体内）的ABC转运蛋白活性，该方法包含向患者给药或使所述生物样品接触式I化合物或包含所述化合物的组合物。本文所用的术语“生物样品”非限制性地包括细胞培养物及其提取物；从哺乳动物或其提取物获得的活组织检查材料；和血液、唾液、尿、粪便、精液、泪液或其他体液或者其提取物。
调控ABC转运蛋白活性可用于本领域技术人员已知的多种目的。上述目的的实例包括，但不限于，在生物和病理现象中研究ABC转运蛋白；和新ABC转运蛋白调控剂的对比评价。
在又一个实施方式中，提供在体外或体内调控阴离子通道活性的方法，包含将所述通道与式(I)化合物接触的步骤。在优选实施方式中，该阴离子通道是氯化物通道或碳酸氢根通道。在其它优选实施方式中，该阴离子通道是氯化物通道。
按照替代实施方式，本发明提供增加在细胞膜中的功能性ABC转运蛋白数量的方法，包含将所述细胞与式(I)化合物接触的步骤。本文所用术语“功能性ABC转运蛋白”表示具有转运活性的ABC转运蛋白。在优选实施方式中，所述功能性ABC转运蛋白是CFTR。
按照另一个优选实施方式，通过测量跨膜电压电位来测量ABC转运蛋白的活性。在生物样品中测量跨膜电压电位的手段可以借助本领域中的任意已知方法，比如光学膜电位测定法或其他电生理学方法。
光学膜电位测定法采用如Gonzalez和Tsien所述的电压-敏感性FRET传感器(参 见，Gonzalez，J.E.和R.Y.Tsien(1995)"Voltagesensingbyfluorescenceresonanceenergytransferinsinglecells"BiophysJ69(4):1272-80，以及Gonzalez，J.E.和R.Y.Tsien(1997)"Improvedindicatorsofcellmembranepotentialthatusefluorescenceresonanceenergytransfer"ChemBiol4(4):269-77)与测量荧光变化的仪器的组合，例如电压/离子探针读数器(VIPR)(参见，Gonzalez，J.E.，K.Oades,等人(1999)"Cell-basedassaysandinstrumentationforscreeningion-channeltargets"DrugDiscovToday4(9):431-439)。
这些电压敏感性测定法基于膜溶性、电压敏感性染剂DiSBAC2(3)与荧光磷脂CC2-DMPE之间荧光共振能量转移(FRET)的变化，所述荧光磷脂连接于质膜的外部小叶，充当FRET供体。膜电位(Vm)的变化导致带负电的DiSBAC2(3)跨越质膜重新分布，从CC2-DMPE转移的能量相应地改变。荧光发射的变化可以利用VIPRTMII监测，它是一种集成的液体处理器和荧光检测器，被设计用来在96-或384-孔微量滴定平板中进行细胞类筛选。
在本发明的另一方面中提供用于体外或体内测量生物样品中ABC转运蛋白或其片段活性的药盒，包含(i)组合物，其包含式(I)化合物或者任意上述实施方式；和(ii)关于如下内容的说明书：a)将该组合物与生物样品接触和b)测量所述ABC转运蛋白或其片段的活性。在一个实施方式中，所述药盒进一步包含关于如下内容的说明书：a)将附加组合物与生物样品接触；b)在所述附加化合物存在下测量ABC转运蛋白或其片段的活性，和c)比较附加化合物存在下的ABC转运蛋白的活性与式(I)组合物存在下的ABC转运蛋白的密度。在优选实施方式中，所述试剂盒用于测量CFTR的密度。
为了可以更加充分地理解本文所述发明，描述下列实施例。应当理解，这些实施例仅供阐述目的，不被解释为以任何方式限制本发明。
实施例
下述表2包含可商购的或通过下文所描述的方法之一制备的羧酸合成材料的列表。
表2：羧酸构建单元。
1.制备A-3:1-苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基-环丙烷羧酸
在70℃下，加热苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-乙腈(5.10g，31.7mmol)、1-溴-2-氯-乙烷(9.00mL，109mmol)和氯化苄基三乙基铵(0.181g，0.795mmol)的混合物，然后将50%(wt/wt)含水氢氧化钠(26mL)缓慢地加入该混合物。在70℃下搅拌该反应18小时，然后在130℃下加热24小时。用水(400mL)稀释此深棕色反应混合物，用等体积的乙酸乙酯萃取一次，再用等体积的二氯甲烷萃取一次。用浓盐酸将此碱性水溶液酸化至pH小于1，过滤沉淀，用1M盐酸洗涤。将固体物质溶于二氯甲烷(400mL)，用等体积的1M盐酸萃取两次，用氯化钠饱和水溶液萃取一次。在硫酸钠上干燥上述有机溶液，蒸发至干，产生白色至浅灰白色的固体(5.23g，80%)ESI-MSm/z计算值206.1，测定值207.1(M+1)+。保留时间是2.37分钟。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.07-1.11(m，2H)，1.38-1.42(m，2H)，5.98(s，2H)，6.79(m，2H)，6.88(m，1H)，12.26(s，1H)。
2.制备A-1:1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-环丙烷羧酸
步骤a：2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-羧酸甲酯
在一氧化碳气氛(55PSI)下，于75℃(油浴温度)下搅拌5-溴-2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯(11.8g，50.0mmol)和四(三苯基膦)合钯(0)[Pd(PPh3)4，5.78g，5.00mmol]的含乙腈(30mL)和三乙胺(10mL)的甲醇(20mL)溶液15小时。过滤经冷却的反应混合物，将滤液蒸发至干。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，产生粗2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-羧酸甲酯(11.5g)，将其直接用于后续步骤。
步骤b：(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-甲醇
在0℃下，将溶于20mL无水四氢呋喃(THF)的粗2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-羧酸甲酯(11.5g)缓慢加至氢化锂铝(4.10g，106mmol)在无水THF(100mL)中的悬浮液。将该混合物温热至室温。在室温下搅拌1小时之后，将该反应混合物冷却至0℃，用水(4.1g)处理，随后用氢氧化钠(10%水溶液，4.1mL)处理。过滤所得浆液，用THF洗涤。将合并的滤液蒸发至干，通过硅胶柱色谱法纯化残余物，产生(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-甲醇(7.2g，38mmol，两步收率76%)，是无色油状物。
步骤c：5-氯甲基-2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯
在0℃下将亚硫酰氯(45g，38mmol)缓慢加至(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-甲醇(7.2g，38mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后蒸发至干。将残余物在饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)和二氯甲烷(100mL)间分配。用二氯甲烷(150mL)萃取分离后的水层。在硫酸钠上干燥有机层，过滤，蒸发至干产生粗5-氯甲基-2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯(4.4g)将其直接用于后续步骤。
步骤d：(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-乙腈
在室温下，搅拌粗5-氯甲基-2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯(4.4g)和氰化钠(1.36g，27.8mmol)在二甲亚砜(50mL)中的混合物过夜。将上述反应混合物倾入冰中，用乙酸乙酯(300mL)萃取。在硫酸钠上干燥有机层，蒸发至干产生粗(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-乙腈(3.3g)，将其直接用于后续步骤。
步骤e：1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-环丙烷腈
在70℃下将氢氧化钠(50%水溶液，10mL)缓慢加至粗(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-乙腈、氯化苄基三乙基铵(3.00g，15.3mmol)和1-溴-2-氯乙烷(4.9g，38mmol)的混合物。
在70℃下搅拌混合物过夜，随后用水(30mL)稀释该反应混合物，用乙酸乙酯萃取。在硫酸钠上干燥合并的有机层，蒸发至干产生粗1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-环丙烷腈，将其直接用于后续步骤。
步骤f：1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-环丙烷羧酸
将1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-环丙烷腈(上一步的粗产物)在10%含水氢氧化钠(50mL)中回流2.5小时。用乙醚(100mL)洗涤经冷却的反应混合物，用2M盐酸将水相酸化至pH2。过滤沉淀的固体，产生1-(2,2-二氟-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-环丙烷羧酸，是白色固体(0.15g，四步总收率1.6%)。ESI-MSm/z计算值242.04，测定值241.58(M+1)+;1HNMR(CDCl3)δ7.14-7.04(m，2H)，6.98-6.96(m，1H)，1.74-1.64(m，2H)，1.26-1.08(m，2H)。
下述表3包含可商购的或通过下文所描述的方法之一制备的胺合成材料的列表。
表3：胺构建单元。
化合物 名称
B-1 2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-胺
B-2 2-叔丁基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-5-胺28 -->
B-3 2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
B-4 1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-6-胺[CAS:145901-11-7]
B-5 2-乙基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
B-6 2-(1-甲基环丙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
B-7 2-环丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
B-8 2-(5-氨基-2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-基)乙醇
3.制备B-2：2-叔丁基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-5-胺
步骤a：6-氯-2-碘-吡啶-3-基胺
在室温下，向6-氯-吡啶-3-基胺(10.0g，77.8mmol)的EtOH(150mL)溶液中加入Ag2SO4(12.1g，38.9mmol)和I2(23.7g，93.4mmol)。在20℃下将混合搅拌过夜。减压蒸发除去溶剂。向上述残余物中加入水(100mL)和EtOAc(200mL)。分离有机层，用EtOAc(100mL×3)萃取水层。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层，减压蒸发，产生粗产品，将其通过柱色谱法在硅胶上纯化(石油醚/乙酸乙酯7:1)，产生6-氯-2-碘-吡啶-3-基胺(17.1g，86%)。1HNMR(DMSO，300MHz)δ7.16(d，J=8.4Hz，1H)，7.01(d，J=8.4Hz，1H)，5.57(s，2H)。
步骤b:6-氯-2-(3,3-二甲基-丁-1-炔基)-吡啶-3-基胺
在N2气氛下，向6-氯-2-碘-吡啶-3-基胺(16.0g，62.7mmol)的甲苯(160mL)/水(80mL)溶液中顺序加入Et3N(12.7g，125mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(2.2g，3.1mmol)、CuI(238mg，1.3mmol)和3,3-二甲基-丁-1-炔(7.7g，94mmol)。在70℃下加热反应混合物3小时，随后将其冷却至室温。用乙酸乙酯(150mL×3)萃取所得混合物。在无水Na2SO4上干燥合并的有机萃取物，减压蒸发，产生6-氯-2-(3,3-二甲基-丁-1-炔基)-吡啶-3-基胺(11.5g，88%)，将其不加进一步纯化直接用于后续步骤。
步骤c：N-[6-氯-2-(3,3-二甲基-丁-1-炔基)-吡啶-3-基]-丁酰胺
在0℃下，向6-氯-2-(3,3-二甲基-丁-1-炔基)-吡啶-3-基胺(11.5g，55.2mmol)和吡啶(13.1g，166mmol)的CH2Cl2(150mL)溶液中滴加丁酰氯(6.5g，61mmol)。使混合物温热至室温并在此温度下搅拌过夜。在0℃下滴加水(50mL)。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取所得混合物。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层，减压蒸发，产生N-[6-氯-2-(3,3-二甲基-丁-1-炔基)-吡啶-3-基]-丁酰胺(16g)，将其不加进一步纯化直接用于后续步骤。1HNMR(CDCl3，300MHz)δ8.72(d，J=9.0Hz，1H)，7.88(brs，1H)，7.23(d，J=8.4Hz，1H)，2.40(d，J=7.2Hz，2H)，1.83-1.75(m，2H)，1.40(s，9H)，1.04(d，J=7.2Hz，3H)。
步骤d：2-叔丁基-5-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶
在室温下向粗N-[6-氯-2-(3,3-二甲基-丁-1-炔基)-吡啶-3-基]-丁酰胺(16g)的DMF(150mL)溶液中加入t-BuOK(12.4g，110mmol)。在70℃下加热此混合物1小时。减压蒸发除去溶剂。加入水(100mL)和乙酸乙酯(200mL)。分离有机层，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取水层。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层，减压蒸发，产生粗产品，将其通过柱色谱法在硅胶上纯化(石油醚/乙酸乙酯10:1)，产生2-叔丁基-5-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶(10.8g，两步总收率94%)。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ8.52(brs，1H)，7.28(d，J=8.4Hz，1H)，7.02(d，J=8.4Hz，1H)，6.37(d，J=2.0Hz，1H)，1.40(s，9H)。
步骤e：2-叔丁基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-5-胺
在500mL高压釜中，在180℃下(在此温度下，高压釜中的压力为约2MPa)加热2-叔丁基-5-氯-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶(5.0g，24mmol)和CuSO4·5H2O(0.5g，2.0mmol)的氨水(200mL)/CH3OH(100mL)溶液，搅拌10小时。使混合物冷却至室温。减压蒸发除去溶剂。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取所得混合物。在Na2SO4上干燥合并的有机层，减压蒸发产生粗产品，将其通过制备型HPLC纯化，产生2-叔丁基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-5-胺(1.15g，26%)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δ10.63(brs，1H)，7.35(d，J=8.7Hz，1H)，6.23(d，J=8.7Hz，1H)，5.86(d，J=1.5Hz，1H)，5.40(brs，2H)，1.29(s，9H);MS(ESI;)m/e(M+H+):190.2。
4.制备B-3：2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
步骤a：(6-氯-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯
在0℃下向6-氯吡啶-3-胺(30.0g，0.23mol)、DMAP(1g)和Et3N(41.7g，0.47mol)在CH2Cl2(200mL)中的混合物中加入Boc2O(54.5g，0.25mol)。使混合物温热至室温并搅拌过夜。用饱和NaHCO3溶液洗涤此混合物。用二氯甲烷萃取上述水溶液。用盐水(100mL)洗涤合并的有机物，在Na2SO4上干燥，减压蒸发产生(6-氯-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(50.0g，94%)，将其直接用于后续反应。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.23(d，J=2.7Hz，1H)，7.97(d，J=6.9Hz，1H)，7.27-7.24(m，1H)，6.58(s，1H)，1.52(s，9H)。
步骤b:(6-氯-4-碘-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯
在-78℃下向TMEDA(1.45g，12.5mmol)的无水Et2O(30mL)溶液中滴加n-BuLi(5.0mL，12.5mmol)。在-78℃下搅拌该混合物0.5小时。在-78℃下将(6-氯-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(1.14g，5.0mmol)的无水Et2O(10mL)溶液滴加至反应混合物，并在-78℃下继续搅拌所得混合物1小时。在-78℃下滴加I2(1.52g，6.0mmol)的无水Et2O(10mL)溶液。在此温度下继续搅拌该混合物1小时。饱和NH4Cl水溶液淬灭反应。分离有机相，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取水层。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层，减压蒸发产生残余物，过柱(石油醚/乙酸乙酯=10/1)纯化，获得(6-氯-4-碘-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(1.75g，30%)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.95(brs，1H)，7.73(s，1H)，6.64(brs，1H)，1.54(s，1H)。
步骤c：[6-氯-4-(3,3-二甲基-丁-1-炔基)-吡啶-3-基]-氨基甲酸叔丁酯
在N2下向(6-氯-4-碘-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(23.3g，65.6mmol)、3,3-二甲基-丁-1-炔(53.8g，0.656mol)、CuI(623mg，3.3mmol)和三乙胺(13.3g，0.13mol)的除氧的甲苯(150mL)/水(50mL)溶液中加入Pd(PPh3)2Cl2(2.30g，3.28mmol)。在70℃下加热此混合物并搅拌24小时。滤去固体并用乙酸乙酯(200mL×3)洗涤。减压蒸发滤液获得残余物，过柱(石油醚/乙酸乙酯=10/1)纯化产生[6-氯-4-(3,3-二甲基-丁-1-炔基)-吡啶-3-基]-氨基甲酸叔丁酯(15.8g，78%)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ9.10(brs，1H)，7.21(s，1H)，6.98(brs，1H)，1.53(s，9H)，1.36(s，9H)。
步骤d：2-叔丁基-5-氯-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶
在回流下将[6-氯-4-(3,3-二甲基-丁-1-炔基)-吡啶-3-基]-氨基甲酸叔丁酯(15.8g，51mmol)和TBAF(26.6g，0.1mol)在THF(200mL)中的混合物加热24小时。冷却后，将混合物倾入冰水中，用CH2Cl2(300mL×3)萃取。在无水Na2SO4干燥合并的有机层，减压蒸发获得残余物，将其通过柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯=10/1)纯化，产生2-叔丁基-5-氯-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(9.2g，87%)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ9.15(brs，1H)，8.43(s，1H)，7.44(s，1H)，6.25(dd，J=0.6，2.1Hz，1H)，1.42(s，9H)。
步骤e：2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
向2-叔丁基-5-氯-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(5.0g，24mmol)的NH3.H2O(400mL)溶液中加入CuSO4.5H2O(595mg，2.39mmol)。在200℃(3MPa压力)下加热混合物24小时。冷却后，用CH2Cl2(150mL×3)萃取此混合物。在无水Na2SO4干燥合并的有机层，减压蒸发获得残余物，将其过柱(石油醚/乙酸乙酯=10/1)纯化，获得2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺(1.2g，27%)。1HNMR(400MHz，DMSO)δ10.66(brs，1H)，8.02(s，1H)，6.39(s，1H)，5.86(d，J=1.2Hz，1H)，4.85(brs，2H)，1.29(s，9H)。
5.制备B-1：2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-胺
步骤a：3-溴-5-硝基吡啶-2-胺
在10℃下向5-硝基-吡啶-2-基胺(30g，0.22mol)的乙酸(200mL)溶液滴加Br2(38g，0.24mol)。滴加后，在20℃下搅拌该混合物30分钟。过滤固体，然后溶于乙酸乙酯(200mL)。用饱和NaHCO3水溶液将混合物碱化至pH8-9。分离有机层，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取水层。用水、盐水洗涤合并的有机层，在Na2SO4上干燥，减压浓缩产生3-溴-5-硝基吡啶-2-胺(14.8g，32%)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ8.94(d，J=2.4Hz，1H)，8.50(d，J=2.4Hz，1H)，5.67(brs，2H)。
步骤b:3-(3,3-二甲基丁-1-炔基)-5-硝基吡啶-2-胺
在N2保护下向3-溴-5-硝基吡啶-2-胺(1.0g，4.6mmol)的甲苯/水(5mL/2.5mL)溶液中顺序加入Et3N(1.2mL，9.2mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(0.3g，0.46mmol)、CuI(35mg，0.18mmol)和3,3-二甲基-丁-1-炔(0.75g，9.2mmol)。在70℃下加热该混合物2.5小时。过滤固体，分离有机层。用乙酸乙酯(10mL×3)萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，在Na2SO4上干燥，减压浓缩产生3-(3,3-二甲基丁-1-炔基)-5-硝基吡啶-2-胺(0.9g，90%)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ8.87(d，J=3.2Hz，1H)，8.25(d，J=3.2Hz，1H)，5.80(brs，2H)，1.36(s，9H)。
步骤c：2-叔丁基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶
在回流下加热3-(3,3-二甲基丁-1-炔基)-5-硝基吡啶-2-胺(0.4g，1.8mmol)和TBAF(1.9g，7.3mmol)的THF(10mL)溶液过夜。减压将反应混合物浓缩至干，将残余物溶于乙酸乙酯(20mL)。用水、盐水洗涤有机层，在Na2SO4上干燥，减压浓缩产生2-叔丁基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(0.25g，63%)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ11.15(brs，1H)，9.20(s，J=2.0Hz，1H)，8.70(d，J=2.0Hz，1H)，6.43(d，J=1.6Hz，1H)，1.51(s，9H)。
步骤d：2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-胺
在N2保护下，向2-叔丁基-5-硝基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(2.3g，0.01mol)的MeOH(50mL)溶液中加入拉尼Ni(0.23g，10%)。在30℃下于氢气氛(1个大气压)下搅拌此混合物1小时。滤去催化剂，将滤液减压浓缩至干。通过柱色谱法在硅胶上(石油醚/乙酸乙酯1:2)纯化残余物，产生2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-胺(1.4g，70%)。1H-NMR(MeOD，400MHz)δ7.71(s，1H)，7.27(s，1H)，5.99(s，1H)，1.37(s，9H)。MS(ESI)m/e(M+H+)190.1。
6.制备B-5：2-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-胺
步骤a：(6-氯-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯
在0℃下，向6-氯-吡啶-3-胺(30.0g，230mmol)、DMAP(1.0g)和Et3N(41.7g，470mmol)在CH2Cl2(200mL)中的混合物中加入Boc2O(54.5g，250mmol)。使反应混合物温热至室温并搅拌过夜。用饱和NaHCO3溶液和盐水(100mL)洗涤所得混合物。在无水Na2SO4上干燥有机层，减压蒸发。通过柱色谱法在硅胶上(10/1的石油醚/乙酸乙酯)纯化残余物，产生6-氯-吡啶-3-基-氨基甲酸叔丁酯(40.0g，76%)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ8.23(d，J=2.8Hz，1H)，7.96(d，J=5.6Hz，1H)，7.25(d，J=5.6Hz，1H)，6.58(brs，1H)，1.52(s，9H)。
步骤b:(6-氯-4-碘-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯
在-78℃下，向TMEDA(25.4g，219.3mmol)的无水THF(300mL)溶液中滴加n-BuLi(87.7mL，219.3mmol)，在此温度下搅拌此混合物0.5小时。在-78℃下将(6-氯-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(20g，87.7mmol)的THF(170mL)溶液滴加至反应混合物，并在-78℃下继续搅拌所得混合物1小时。在-78℃下滴加I2(26.7g，105.3mmol)的无水THF(170mL)溶液。1小时之后，用饱和NH4Cl(300mL)水溶液淬灭反应。分离有机相，用乙酸乙酯(150mL×3)萃取水层。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层，减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶上(石油醚/乙酸乙酯，10/1)纯化残余物，产生(6-氯-4-碘-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(7g，22.7%)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ8.95(s，1H)，7.73(s，1H)，6.64(brs，1H)，1.54(s，9H)。
步骤c：4-(丁-1-炔基)-6-氯吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯
在高压釜中于N2下，向(6-氯-4-碘-吡啶-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(6.0g，16.9mmol)、1-丁炔(9g，169mmol)、CuI(160.1mg，0.84mmol)和三乙胺(3.4g，33.2mmol)的脱氧的甲苯(40mL)/水(14mL)中加入Pd(PPh3)2Cl2(592mg，0.84mmol)。将混合物加热至70℃，搅拌24小时。滤去固体并用乙酸乙酯(60mL×3)洗涤。减压蒸发滤液，通过柱色谱法在硅胶上(石油醚/乙酸乙酯，10/1)纯化残余物，产生4-(丁-1-炔基)-6-氯吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(3.5g，74%)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ9.13(s，1H)，7.22(s，1H)，6.98(s，1H)，2.53(q，J=7.5Hz，2H)，1.54(s，9H)，1.29(t，J=7.5Hz，3H)。
步骤d：2-乙基-5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶
在回流下，加热4-(丁-1-炔基)-6-氯吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(3.5g，12.5mmol)和TBAF(6.65g，25mmol)在THF(60mL)中的混合物24小时。冷却后，将混合物倾入冰水中，用CH2Cl2(100mL×3)萃取。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层，减压蒸发。通过柱色谱法在硅胶上(石油醚/乙酸乙酯，10/1)纯化残余物，产生2-乙基-5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶(2.0g，89%)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ8.96(brs，H)，8.46(s，1H)，7.44(s，1H)，6.24(s，1H)，2.89(q，J=7.5Hz，2H)，1.37(t，J=7.5Hz，3H)。
步骤e：2-乙基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
将2-乙基-5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶(1.3g，7.19mmol)在EtOH(20mL)中的悬浮液、CuSO4·5H2O(179mg，0.72mmol)和NH3·H2O(60ml)加入高压釜(100mL)。在200℃下和2MPa下搅拌反应10小时。将反应冷却至25℃，用水淬灭并用乙酸乙酯萃取(100mL×3)。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层，减压蒸发。通过柱色谱法在硅胶上(石油醚/乙酸乙酯，10:1)纯化残余物，产生2-乙基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺(190mg，16%)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ10.71(brs，H)，8.00(s，1H)，6.39(s，1H)，5.87(s，1H)，4.89(brs，2H)，2.65(q，J=7.5Hz，2H)，1.22(t，J=7.5Hz，3H。
7.制备B-6：2-(1-甲基环丙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
步骤a：6-氯-4-((1-甲基环丙基)乙炔基)吡啶-3-胺
在N2气氛下向6-氯-4-碘吡啶-3-胺(7.0g，28mmol)的Et3N(100mL)溶液中加入1-乙炔基-1-甲基-环丙烷(11.0g，137mmol)、CuI(0.53g，2.8mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(1.9g，2.8mmol)。回流混合物过夜，用H2O(100mL)淬灭。分离有机层，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，在无水Na2SO4上干燥，通过色谱法在硅胶上(3%的EtOAc/石油醚洗脱)纯化，产生6-氯-4-((1-甲基环丙基)乙炔基)吡啶-3-胺(3.0g，53%)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ7.84(s，1H)，7.08(s，1H)，4.11(brs，2H)，1.37(s，3H)，1.03(t，J=2.4，2H)0.76(t，J=2.4，2H)。
步骤b:5-氯-2-(1-甲基环丙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶
在N2气氛下向6-氯-4-((1-甲基环丙基)乙炔基)吡啶-3-胺(3.0g，15mmol)的DMF(50mL)溶液加入t-BuOK(3.3g，29mmol)。在80℃下加热混合物过夜，用H2O(100mL)淬灭。分离有机层，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，在无水Na2SO4上干燥，通过色谱法在硅胶上(3%的EtOAc/石油醚)纯化，产生5-氯-2-(1-甲基环丙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(2.2g，73%)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ9.79(brs，1H)，8.37(s，1H)，7.36(s，1H)，6.16(s，1H)，1.51(s，3H)，1.09(m，2H)，0.89(m，2H)。
步骤c：2-(1-甲基环丙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
在100mL高压釜中，将5-氯-2-(1-甲基环丙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(1.0g，4.9mmol)和CuSO4·5H2O(100mg，0.4mmol)的氨水(60mL)/EtOH(20mL)溶液加热至200℃，在此温度下搅拌8小时。使混合物冷却至室温。减压除去乙醇。用乙酸乙酯(50mL×3)萃取所得混合物。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层，通过色谱法在硅胶上(2%的CH3OH/二氯甲烷洗脱)纯化，产生2-(1-甲基环丙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺(250mg，27%)。1H-NMR(DMSO，300MHz)δ7.96(s，1H)，6.37(s，1H)，5.88(d，J=1.2，1H)，5.01(brs，2H)，1.41(s，3H)，0.98(t，J=2.1,2H)，0.80(t，J=2.1，2H)。
8.制备B-7：2-环丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
步骤a：制备乙炔基环丁烷
在-78℃下将n-BuLi滴加至6-氯己-1-炔(10.0g，86mmol)的THF(100mL)溶液。在-78℃下搅拌20分钟后，使其温热至40℃，在此温度下搅拌3天。用饱和NH4Cl水溶液淬灭反应，用乙醚(3×50mL)萃取。用盐水洗涤合并的萃取物，干燥，蒸馏除去乙醚，产生乙炔基环丁烷的THF溶液，其用于步骤b。
步骤b:6-氯-4-(环丁基乙炔基)吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯
向6-氯-4-碘吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(7.0g，19.8mmol)的Et3N(100mL)溶液中加入乙炔基环丁烷的THF(制备于步骤a)溶液、Pd(PPh3)2Cl2(1.8g，2.1mmol)和CuI(400mg，2.1mmol)。在25℃下搅拌反应混合物16小时。用水洗涤混合物，用二氯甲烷(3×100mL)萃取。用盐水洗涤萃取物，干燥，减压浓缩，通过色谱法在硅胶上(5-10%的乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化，产生6-氯-4-(环丁基乙炔基)吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(3.6g，收率60%)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ:9.11(br，s，1H)，7.22(s1H)，6.97(s，1H)，3.39-3.25(m，1H)，2.48-1.98(m，6H)，1.52(s，9H)。
步骤c：5-氯-2-环丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶
向6-氯-4-(环丁基乙炔基)吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(2.6g，8.5mmol)的DMF(50mL)溶液中加入t-BuOK(1.9g，16mmol)。在90℃下搅拌反应混合物2小时。用水洗涤混合物，用二氯甲烷(3×50mL)萃取。用盐水洗涤萃取物，干燥，减压浓缩，通过色谱法在硅胶上(5-10%的乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化，产生纯5-氯-2-环丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(0.9g，收率53%)产物。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ:8.66(br，s，1H)，8.45(s，1H)，7.44(s1H)，6.27(s，1H)，3.75-3.52(m，1H)，2.52-1.90(m，6H)。
步骤d：2-环丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺
向5-氯-2-环丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(200mg，0.97mmol)的EtOH(10mL)/NH3·H2O(30mL)溶液中加入CuSO4·5H2O(30mg，0.12mmol)。在180℃下于3MPa下搅拌反应混合物16小时。用乙酸乙酯(3×30mL)萃取此混合物。干燥萃取物，减压浓缩，通过色谱法在硅胶上(5-10%的MeOH/乙酸乙酯洗脱)纯化，产生纯的2-环丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺(40mg，收率22%)。1HNMR(300MHz，MeOH)δ:8.02(s，1H)，6.72(s，1H)，6.11(s1H)，3.72-3.60(m，1H)，2.47-1.90(m，6H).MS(ESI):m/z[M+H+]188.1。
9.制备B-8：
步骤a：6-氯吡啶-3-基-氨基甲酸叔丁酯
在0℃下向6-氯-吡啶-3-胺(30.0g，230mmol)、DMAP(1.0g)和Et3N(41.7g，470mmol)在CH2Cl2(200mL)中的混合物中加入Boc2O(54.5g，250mmol)。使反应混合物温热至室温并搅拌过夜。用饱和NaHCO3溶液和盐水(100mL)洗涤所得混合物，在无水Na2SO4上干燥有机层，减压蒸发，通过柱色谱法在硅胶上(石油醚/乙酸乙酯，10/1)纯化残余物，产生6-氯吡啶-3-基-氨基甲酸叔丁酯(40.0g，76%)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ1H-NMR(CDCl3，400MHz)8.23(d，J=2.8Hz，1H)，7.98(m，1H)，7.26(d，J=5.6Hz，1H)，6.51(brs，1H)，1.52(s，9H)。
步骤b:6-氯-4-碘吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯
在-78℃下向TMEDA(25.4g，219.3mmol)的无水THF(300mL)溶液中滴加n-BuLi(87.7mL，219.3mmol)，在此温度下搅拌此混合物0.5小时。在-78℃下将6-氯吡啶-3-基-氨基甲酸叔丁酯(20g，87.7mmol)的THF(170mL)溶液中滴加至反应混合物，在-78℃下继续搅拌所得混合物1小时。在-78℃下滴加I2(26.7g，105.3mmol)的无水THF(170mL)溶液。1小时之后，用饱和NH4Cl(300mL)水溶液淬灭反应。分离有机相，用EtOAc(150mL×3)萃取水层。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层，减压浓缩产生残余物，将其通过柱色谱法在硅胶上(石油醚/乙酸乙酯，10/1)纯化，产生6-氯-4-碘吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(10.0g，33%)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ8.95(s，1H)，7.73(s，1H)，6.64(brs，1H)，1.53(s，9H)。
步骤c：6-氯-4-碘吡啶-3-胺
在60℃下加热6-氯-4-碘吡啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(10.0g，28mmol)的3MHCl(600mL)溶液12小时。使混合物冷却至室温并用饱和NaHCO3处理至pH=8。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，通过色谱法在硅胶上(10%的乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化，产生6-氯-4-碘吡啶-3-胺(6.6g，93%)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ7.81(s，1H)，7.60(s，1H)，4.13(brs，2H)。
步骤d：2-(6-氯-4-碘吡啶-3-基氨基)乙醇
向6-氯-4-碘吡啶-3-胺(6.5g，25.5mmol)的CH3OH(1500mL)溶液中加入2-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙醛(18.0g，103mmol)。随后在0℃下缓慢加入三氟乙酸(150mL)和NaBH3CN(8.0g，127mmol)。使混合物温热至25℃，再继续搅拌12小时。减压浓缩此混合物，用NaOH(3M)处理至pH=8。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，在无水Na2SO4上干燥。减压浓缩溶剂产生粗产物2-(6-氯-4-碘吡啶-3-基氨基)乙醇(14.5g)，将其不加进一步纯化用于后续步骤。
步骤e：2-(6-氯-4-(3,3-二甲基丁-1-炔基)吡啶-3-基氨基)乙醇
在N2气氛下向2-(6-氯-4-碘吡啶-3-基氨基)乙醇(14.5g，49mmol)的Et3N(200mL)溶液中加入3,3-二甲基-丁-1-炔(12.0g，146mol)、CuI(0.9g，4.9mmol)和Pd(PPh3)Cl2(3.4g，4.9mmol)。回流混合物过夜，用H2O(100mL)淬灭。分离有机层，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，在无水Na2SO4上干燥，通过色谱法在硅胶上(3%的乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化，产生2-(6-氯-4-(3,3-二甲基丁-1-炔基)吡啶-3-基氨基)乙醇(3.6g，29%)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ7.74(s，1H)，7.11(s，1H)，4.77(brs，1H)，3.92-3.90(m，2H)，3.78-3.36(m，2H)，1.34(s，9H)。
步骤f：2-(2-叔丁基-5-氯-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-基)乙醇
在N2气氛下向2-(6-氯-4-(3,3-二甲基丁-1-炔基)吡啶-3-基氨基)乙醇(3.6g，14.3mmol)的DMF(100mL)溶液中加入t-BuOK(3.1g，28mol)。在80℃下加热混合物12小时，随后用H2O(200mL)淬灭。分离有机层，用EtOAc(150mL×3)萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，在无水Na2SO4上干燥，通过色谱法在硅胶上(3%的乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化，产生2-(2-叔丁基-5-氯-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-基)乙醇(1.6g，44%)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ8.50(s，1H)，7.39(s，1H)，6.28(s，1H)，4.55(t，J=6.6，2H)，4.05(t，J=6.6，2H)，1.49(s，9H)。
步骤g:2-(5-氨基-2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-基)乙醇
在100mL高压釜中，将2-(2-叔丁基-5-氯-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-基)乙醇(350mg，1.39mmol)和CuSO4.5H2O(35mg，1.4mmol)在氨水(14mL)/CH3OH(7ml)中的混合物加热至120℃，持续14小时。使混合物冷却至25℃。减压蒸发除去甲醇，用乙酸乙酯萃取(50mL×3)所得混合物。用盐水洗涤合并的有机层，在无水Na2SO4上干燥，通过色谱法在硅胶上(5%的CH3OH/二氯甲烷洗脱)纯化，产生2-(5-氨基-2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-基)乙醇(50mg，16%)。1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ8.22(s，1H)，6.59(s，1H)，6.08(s，1H)，4.44(t，J=6.9Hz，2H)，3.99(t，J=6.9Hz，2H)，1.45(s，9H)。
10.制备1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-N-(2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)环丙烷羧酰胺
将2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺(325mg，0.158mmol)和1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酸(300mg，1.58mmol)溶于含三乙胺(659μL，0.470mmol)的乙腈(10mL)中。将O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(608mg，1.60mmol)加入此混合物，搅拌所得溶液16小时，在此期间形成大量沉淀。过滤反应混合物，用乙腈洗涤滤饼，随后干燥，产生1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-N-(2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)环丙烷羧酰胺(397mg，67%)。ESI-MSm/z计算值377.2，测定值378.5(M+1)+;保留时间1.44分钟。1HNMR(400MHz，DMSO)11.26(s，1H)，8.21(s，1H)，8.06(s，1H)，7.83(s，1H)，7.13(d，J=1.5Hz，1H)，7.04-6.98(m，2H)，6.20(d，J=1.0Hz，1H)，6.09(s，2H)，1.49-1.45(m，2H)，1.38(s，9H)，1.12-1.08(m，2H)。
11.制备N-(2-叔丁基-1-(2-羟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酰胺
将HATU(38mg，0.10mmol)加至1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酸(24mg，0.10mmol)、2-(5-氨基-2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-基)乙醇(23mg，0.10mmol)和三乙胺(42μL，0.30mmol)的DMF(1mL)溶液。在室温下搅拌混合物1小时。过滤此混合物，通过反相HPLC(10-99%CH3CN-H2O，含0.035%TFA)纯化，产生N-(2-叔丁基-1-(2-羟乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-基)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酰胺。ESI-MSm/z计算值457.2，测定值458.5(M+1)+。保留时间1.77分钟。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.54(brs，1H)，8.84(s，1H)，7.83(s，1H)，7.58(d，J=1.7Hz，1H)，7.45(d，J=8.3Hz，1H)，7.35(dd，J=8.3，1.7Hz，1H)，6.67(s，1H)，4.58(t，J=5.7Hz，2H)，3.76(t，J=5.7Hz，2H)，1.58(m，2H)，1.46(s，9H)，1.28(m，2H)。
12.制备N-(2-叔丁基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-5-基)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酰胺
将HATU(31mg，0.083mmol)加至1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酸(18mg，0.075mmol)、2-叔丁基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-5-胺(16mg，0.083mmol)和三乙胺(21μL，0.15mmol)的DMF(1mL)溶液。在60℃下搅拌反应18小时。过滤此混合物，通过反相HPLC(10-99%的CH3CN-H2O，含0.035%TFA)纯化，产生N-(2-叔丁基-1H-吡咯并[3,2-b]吡啶-5-基)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酰胺，是TFA盐。ESI-MSm/z计算值413.2，测定值414.1(M+1)+。保留时间2.86分钟。
13.制备N-(2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酰胺
将HATU(31mg，0.083mmol)加至1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酸(18mg，0.075mmol)、2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-5-胺(16mg，0.083mmol)和三乙胺(21μL，0.15mmol)的DMF(1mL)溶液。在60℃下搅拌反应18小时。过滤此混合物，通过反相HPLC(10-99%的CH3CN-H2O，含0.035%TFA)纯化，产生N-(2-叔丁基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷羧酰胺，是TFA盐。ESI-MSm/z计算值413.2，测定值414.3(M+1)+。保留时间3.25分钟。
14.制备其它化合物
用实施例10-13中描述的偶联反应来从酸A和胺B制备表3中的化合物。
表3.
下面给出了按照上述实施例制备的本发明化合物的表征数据。
表4.
检测和测量化合物的△F508-CFTR纠正性的测定法
测定化合物△F508-CFTR调控性质的膜电位光学方法。
该测定法采用荧光电压敏感性染料来测量膜电位变化，用荧光板读取器(例如，FLIPRIII，MolecularDevices，Inc.)来读出NIH3T3细胞中的功能性ΔF508-CFTR的增加。该响应的驱动力是氯离子梯度的形成，与预先用化合物处理细胞并随后载入电压敏感性染料之后通过单独的液体添加步骤的通道活化有关。
纠正化合物的鉴定
为了鉴定纠正有关△F508-CFTR的运输缺陷的小分子，开发了单加入HTS测定形式。在组织培养温育器中，在37℃、5%CO2、90%湿度下温育含有细胞的测定板约2-4小时。在附着于测定板底部后，细胞即准备好进行化合物暴露。
在组织培养温育器中，在37℃、5%CO2、90%湿度下，在试验化合物存在或不存在(阴性对照)下，在不含血清的培养基中温育细胞16-24小时。随后用KrebsRingers溶液冲洗上述细胞3次，并载入电压敏感再分布染料。为了活化ΔF508-CFTR，将10μM福司扣林和CFTR强化剂染料木素(20μM)与无Cl-培养基一起加入各孔。无Cl-培养基的加入促进响应于ΔF508-CFTR活化的Cl-流出，使用电压-传感染剂来光学监测所致膜的去极化。
强化化合物的鉴定
为了鉴定ΔF508-CFTR的强化剂，开发了双加入HTS测定形式。该HTS测试法采用荧光电压敏感性染料来在FLIPRIII上测量膜电位变化，它是在温度纠正的ΔF508CFTRNIH3T3细胞中的ΔF508CFTR门控(传导)增加的度量。该响应的驱动力是Cl-离子梯度，与预先用强化剂化合物(或DMSO媒介对照)处理细胞并随后载入再分布染料之后在使用荧光板读取器如FLIPRIII的单独液体添加步骤中用福司扣林的通道活化有关。
溶液：
浴溶液#1:(mM)NaCl160，KCl4.5，CaCl22，MgCl21，HEPES10，用NaOH调至pH7.4。
无氯化物浴溶液:用葡萄糖酸盐代替浴溶液#1中的氯化物盐。
细胞培养
使用稳定表达ΔF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞进行膜电位的光学测量。在175cm2培养烧瓶中，将细胞供养在37℃下、在5%CO2和90%湿度中和Dulbecco氏改性Eagle培养基中，其中补充有2mM谷氨酰胺、10%胎牛血清、1XNEAA，β-ME、1X青霉素/链霉素和25mMHEPES。就全部光学测定而言，将细胞按约20,000/孔接种在384-孔涂有基质胶的平板中，在37℃下培养2小时，然后在27℃下培养24小时，供强化剂测定。就纠正测定而言，在27℃或37℃下将细胞用和不用化合物培养16－24小时。
测定化合物ΔF508-CFTR调控性质的电生理测定法。
1.Ussing室测试法
对表达ΔF508-CFTR的极化导气管上皮细胞进行Ussing室实验，以进一步鉴定在光学测定法中鉴别的ΔF508-CFTR调控剂。非CF和CF导气管上皮分离自支气管组织，按先前的描述(Galietta，L.J.V.，Lantero，S.，Gazzolo，A.，Sacco，O.，Romano，L.，Rossi，G.A.，&Zegarra-Moran，O.(1998)InVitroCell.Dev.Biol.34，478-481)来培养，并覆盖至预涂NIH3T3条件培养基的SnapwellTM过滤器上。四天后，除去顶端培养基，在使用前在空气液体界面生长细胞>14天。获得完全分化的纤毛柱状细胞单层，这正是导气管上皮的特征。非CFHBE分离自无任何已知肺病的不吸烟者。CF-HBE分离自对△F508-CFTR纯合的患者。
将生长在SnapwellTM细胞培养插件上的HBE固定在Ussing室内(PhysiologicInstruments，Inc.，SanDiego，CA)，利用电压钳系统(DepartmentofBioengineering，UniversityofIowa，IA)来测量在基底外侧到顶端的Cl-梯度(ISC)存在下的经上皮电阻和短路电流。简言之，在37℃下于电压钳记录条件下(Vhold=0mV)检验HBE。基底外侧溶液包含(mM)145NaCl，0.83K2HPO4，3.3KH2PO4，1.2MgCl2，1.2CaCl2，10葡萄糖，10HEPES(用NaOH调至pH为7.35)，而顶端溶液包含(mM)145葡萄糖酸钠，1.2MgCl2，1.2CaCl2，10葡萄糖，10HEPES(用NaOH调至pH为7.35)。
纠正化合物的鉴定
典型的方案采用基底外侧至顶端膜Cl-浓度梯度。为了建立这种梯度，对基底外侧膜使用正常的套环，而顶端NaCl被等摩尔葡糖酸钠代替（用NaOH滴定至pH为7.4），得到跨越上皮的大幅Cl-浓度梯度。全部实验都是用完好的单层进行的。为了完全活化ΔF508-CFTR，将福司扣林(10μM)、PDE抑制剂、IBMX(100μM)和CFTR强化剂染料木素(50μM)加至顶端一侧。
如在其他细胞类型中所观察到的，在低温下温育FRT细胞和分离自患病CF患者的人支气管上皮细胞(CF-HBE)表明ΔF508-CFTR增加在质膜中的CFTR功能性密度。为确定纠正化合物的活性，在37℃下将细胞与试验化合物一起温育24-48小时，并随后在记录前洗涤3次。将cAMP和染料木素介导的经化合物处理的细胞中的ISC归一至37℃对照，并表达为野生型HBE的CFTR活性的百分比活性。相比37℃对照，用纠正化合物预温育细胞显著增加了所述cAMP和染料木素介导的ISC。
强化化合物的鉴定
典型的方案采用基底外侧至顶端膜Cl-浓度梯度。为了建立这种梯度，对基底外侧膜使用正常的套环，而顶端NaCl被等摩尔葡糖酸钠代替（用NaOH滴定至pH7.4），得到跨越上皮的大幅Cl-浓度梯度。向细胞培养插件顶端侧加入福司扣林(10μM)和所有供试化合物。比较假定△F508-CFTR强化剂与已知强化剂染料木素的功效。
2.碎片钳记录
利用如先前所描述的(Rae，J.，Cooper，K.，Gates，P.，&Watsky，M.(1991)J.Neurosci.Methods37，15-26)开孔-碎片记录技术，监测△F508-NIH3T3细胞中的总Cl-电流。利用Axopatch200B碎片-钳放大器(AxonInstrumentsInc.，FosterCity，CA)，在22℃下进行电压钳记录。吸移管溶液包含(mM)150N-甲基-D-葡萄糖胺(NMDG)-Cl、2MgCl2、2CaCl2、10EGTA、10HEPES和240μg/ml两性霉素-B(用HCl调节至pH为7.35)。细胞外培养基包含(mM)150NMDG-Cl、2MgCl2、2CaCl2、10HEPES(用HCl调节至pH为7.35)。利用装有Digidata1320A/D界面连接Clampex8(AxonInstrumentsInc.)的PC进行脉冲发生、数据获取和分析。为了活化△F508-CFTR，将10μM福司扣林和20μM染料木素加至所述浴中，并每30秒监测一次电流-电压关系。
纠正化合物的鉴定
为了确定纠正化合物在质膜中增加功能性ΔF508-CFTR密度的活性，在用所述纠正化合物处理24小时之后使用上述开孔-钳记录技术来测量电流密度。为了完全活化ΔF508-CFTR，将10μM福司扣林和20μM染料木素加至所述细胞。在该记录条件下，在27℃下温育24小时后的电流密度高于在37℃下温育24小时后观察到的电流密度。这些结果与低温温育对质膜中的ΔF508-CFTR密度的已知效果相符。为了确定纠正化合物对CFTR电流密度的效果，将所述细胞与10μM试验化合物在37℃下温育24小时，将电流密度与27℃和37℃的对照比较(%活性)。在记录之前用细胞外记录培养基洗涤细胞3次，除去任何余留的试验化合物。相比所述37℃对照，用10μM纠正化合物预温育显著增加所述cAMP和染料木素决定的电流。
强化化合物的鉴定
也利用开孔-碎片-记录技术研究了△F508-CFTR强化剂增加稳定表达△F508-CFTR的NIH3T3细胞中宏观△F508-CFTRCl-电流(I△F508)的能力。从光学测定法鉴定的强化剂引起I△F508的剂量-依赖性增加，效力和功效与光学测定法相似。在所有所检查的细胞中，强化剂施加之前和期间的反向电位为-30mV左右，它是所计算的ECl(-28mV)。
细胞培养
使用稳定表达△F508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞进行全细胞记录。在175cm2培养烧瓶中，将细胞供养在37℃下、在5%CO2和90%湿度中和Dulbecco氏改性Eagle培养基中，其中补充有2mM谷氨酰胺、10%胎牛血清、1XNEAA，β-ME、1X青霉素/链霉素和25mMHEPES。就全细胞记录而言，将2,500－5,000细胞接种在涂有聚-L-赖氨酸的玻璃盖片上，在27℃下培养24－48小时，然后用于测试强化剂活性；用或不用纠正化合物在37℃下温育，用于测量纠正剂的活性。
3.单通道记录
借助在先描述的切除的内侧外翻的膜片记录(Dalemans，W.，Barbry，P.，Champigny，G.，Jallat，S.，Dott，K.，Dreyer，D.，Crystal，R.G.，Pavirani，A.，Lecocq，J-P.，Lazdunski，M.(1991)Nature354，526-528)用Axopatch200B碎片钳放大器(AxonInstrumentsInc.)来观察表达于NIH3T3细胞中的野生型CFTR和温度纠正的△F508-CFTR的门控活性。吸移管包含(mM)：150NMDG、150天冬氨酸、5CaCl2、2MgCl2和10HEPES(用Tris碱将pH调至7.35)。浴包含(mM)：150NMDG-Cl、2MgCl2、5EGTA、10TES和14Tris碱(用HCl将pH调至7.35)。切除后加入1mMMg-ATP、75nMcAMP-依赖性蛋白激酶催化性亚单位(PKA；PromegaCorp.Madison，WI)和10mMNaF，活化野生型CFTR和△F508-CFTR，抑制阻止电流减少的蛋白磷酸酶。吸移管电位维持在80mV。分析含有(2个活动通道的膜片的通道活动。在实验过程期间同时开放的最大数量决定了活动通道的数量。为了测定单通道电流幅度，在100Hz下“离线”过滤从120秒△F508-CFTR活性记录的数据，然后用于构建全点幅度直方图，利用Bio-Patch分析软件(Bio-LogicComp.France)用多高斯函数拟合。从120秒通道活动测定总微观电流和开放概率(PO)。PO是利用Bio-Patch软件或者从PO=I/i(N)测定的，其中I=平均电流，i=单通道电流幅度，N=碎片中活动通道的数量。
细胞培养
使用稳定表达△F508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞进行切除膜片钳记录。在175cm2培养烧瓶中，将细胞供养在37℃下、在5%CO2和90%湿度中和Dulbecco氏改性Eagle培养基中，其中补充有2mM谷氨酰胺、10%胎牛血清、1XNEAA，β-ME、1X青霉素/链霉素和25mMHEPES。就单通道记录而言，将2,500－5,000细胞接种在涂有聚-L-赖氨酸的玻璃盖片上，在27℃下培养24－48小时备用。
发现表1化合物在前文所描述测试的测定中显示纠正活性。
本发明化合物可用作ATP结合盒转运蛋白调控剂。使用前文描述的方法测定本发明化合物的活性EC50s，示于表5。
表5

Claims (8)

1.选自下列的化合物：
。
2.药物组合物，包含
(i)权利要求1的化合物；和
(ii)药学上可接受的载体。
3.权利要求2的组合物，进一步包含其它药剂，选自粘液溶解剂、支气管扩张剂、抗生素、抗感染剂、抗炎剂、CFTR纠正剂和营养剂。
4.根据权利要求1的化合物在制备用于调控细胞膜中的CFTR转运蛋白的药物中的用途。
5.用于体外或体内测量生物样品中CFTR转运蛋白或其片段活性的药盒，包含：
(i)包含权利要求1的化合物的第一组合物；和
(ii)关于如下内容的说明书：
a)使该组合物与该生物样品接触；
b)测量所述CFTR转运蛋白或其片段的活性。
6.权利要求1的化合物在制备用于治疗牵涉CFTR转运蛋白活性的病症、疾病或疾患的药物中的用途。
7.权利要求6的用途，其中所述病症、疾病或疾患选自囊性纤维化、遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷、1型遗传性血管水肿、脂质加工缺陷、1型乳糜微粒血、无β脂蛋白血症、溶酶体贮存疾病、粘多糖病、Sandhof/Tay-Sachs、Crigler-NajjarII型、多内分泌病/高胰岛素血、糖尿病、拉伦侏儒、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退、黑素瘤、聚糖病CDG1型、遗传性肺气肿、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血、ACT缺陷、尿崩症(di)、夏-马-图三氏综合征、佩-梅二氏病、神经变性疾病、若干聚谷氨酰胺神经病学疾患以及海绵状脑病、COPD、干眼病和斯耶格伦氏病。
8.权利要求6的用途，其中所述病症、疾病或疾患选自C蛋白缺陷、家族性高胆固醇血、I-细胞疾病/假性Hurler、后叶激素运载蛋白性di、肾原性DI、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、皮克氏病、亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓肌肉萎缩、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩和肌强直性营养不良、遗传性克-雅二氏病、法布里氏病和斯-施二氏综合征。
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