CN103154272A

CN103154272A - 利用遗传标志物和阵列预测糖尿病相关并发症风险的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN103154272A
Application number: CN201180049234XA
Authority: CN
Inventors: 马青云; 苏咏仪; 伍楚贤; 陈重娥
Original assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date: 2010-08-25
Filing date: 2011-08-25
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2031-08-25
Also published as: US20130209447A1; WO2012025055A1; EP2609218A4; EP2609218B1; CN103154272B; EP2609218A1

Abstract

本发明公开了用于诊断个体中选自以下疾病、病症或疾病状况的遗传倾向的方法：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外。所述方法包括分析至少一种多核苷酸来检测单核苷酸多态性(SNP)，其中所述单核苷酸多态性的存在指示个体患有所述疾病、病症或疾病状况，处于患所述疾病、病症或疾病状况的风险中，或疑似患有所述疾病、病症或疾病状况。还公开了用于诊断所述疾病、病症或疾病状况的遗传倾向的阵列或试剂盒。

Description

利用遗传标志物和阵列预测糖尿病相关并发症风险的方法和试剂盒

发明领域

本发明涉及用于诊断或检测个体中疾病、疾病状况或病症，特别是糖尿病肾并发症，包括终末期肾病(ESRD)以及其他心血管疾病的个体遗传易感性的方法、试剂盒和阵列。

发明背景

糖尿病肾病是糖尿病患者发病和致死的主要原因。随着糖尿病在发展中国家和发达国家中日益流行，糖尿病目前是终末期肾病(ESRD)的主要致病原因。亚洲处于2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)的流行中¹²³。最近大规模的流行病学调查估计，在中国有9420万成年人受糖尿病侵袭，另外1亿4820万成人患有前驱糖尿病⁴。肾衰或ESRD是2型糖尿病患者致死的重要原因⁵⁶。特别是亚洲人群似乎处于糖尿病肾病(DKD)的风险中。在MAP研究中，患有2型糖尿病和高血压的亚洲人患者中，有40%存在微量白蛋白尿，20%存在大量白蛋白尿⁷。发展成ESRD可以通过积极降低多个目标而有效地减慢，包括血压、血糖控制、脂质参数以及调控肾素-血管紧张素系统的因子。然而，通常不可能预期哪个患有糖尿病的个体处于增加的发展成肾并发症，特别是ESRD的风险中。

蛋白激酶C(PKC)-β是参与细胞信号转导的重要分子，已涉及到糖尿病微血管并发症以及糖尿病心肌病的发展^14151617。在糖尿病动物模型中，已发现PKC-β的药理抑制在标准化血流动力学变化、细胞外基质(ECM)积累、肾小球损伤的组织学特征以及减轻蛋白尿症中是有效的¹⁸¹⁹²⁰。缺乏PKC-β的小鼠暴露于高血糖症时免受肾小球肥大、氧化应激和蛋白尿症²¹。在随机临床试验中，PKC-β的抑制剂降低了用ECEI或ARB最佳治疗的糖尿病患者中肾小球滤过率和蛋白尿的损失²²。这些数据支持了PKC-β在DKD发病机制中的重要作用。PKC-β的两种亚型——PKC-βI和PKC-βII都由染色体16短臂上的PKC-β1基因(PRKCB)编码。在PRKCB的启动子区携带2个单核苷酸多态性(SNP)的1型糖尿病患者(胰岛素依赖型糖尿病)具有肾病的风险增加²³ ²⁴。

简述

本发明人惊奇地发现，PKC-β1(PRKCB)基因及相关调控区中的某些单核苷酸多态性(SNP)与以下疾病的发展相关：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外。因而，SNP对于诊断个体疾病发展的遗传倾向的方法和试剂盒，以及进一步对于治疗或预防疾病的方法是有用的。

因此，本文一方面提供了用于诊断个体选自以下的疾病、病症或疾病状况的遗传倾向的方法：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外，所述方法包括分析至少一种多核苷酸来检测选自以下的遗传多态性：PKC-β1基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它们的任意组合，其中至少一种所述遗传多态性的存在指示个体患有所述疾病、病症或疾病状况，处于患所述疾病、病症或疾病状况的风险中，或疑似患有所述疾病、病症或疾病状况。

本文另一方面提供了用于诊断个体选自以下疾病、病症或疾病状况的遗传倾向的试剂盒或阵列：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，特别是由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外，所述试剂盒或阵列包括用于检测从个体获得的含有至少一种多核苷酸的样品的遗传多态性的试剂。

本文另一方面提供了用于治疗或预防具有本发明所检测的至少一种遗传多态性的个体中选自以下疾病、疾病状况或病症的方法：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，特别是由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外，所述方法包括给予所述个体抵消所述个体中任何一种所述多态性的效应的化合物，其中所述疾病、疾病状况或病症选自：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，特别是由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外。

在以下提供的详述和附图中将进一步显而易见本发明适用的范围。但是应当理解的是，以下详述和实施例，虽然表明了本发明的实施方案，但是仅以示例说明的方式给出，因为本领域技术人员根据以下详述显而易见本发明精神和范围内的各种变化或修饰。

本申请引用的所有出版物、专利、专利申请和其它参考文献都通过引用以其整体并入本文，如同每一单独的出版物、专利、专利申请和其它参考文献都被具体且单独地指明通过引用并入一样。

附图简述

图1.根据风险型等位基因数目的新发ESRD的累积概率，用常规风险因子[性别、年龄、糖尿病持续时间、收缩压和舒张压、HbA1c、总胆固醇、甘油三酯的自然对数、eGFR、AER的自然对数、视网膜病(有/无)和药物应用(是/否)]的平均值进行了调整。选择三个(显性模型rs3760106，隐性模型rs7404928和加性模型rs4787733)显著且独立的(r²<0.8)SNP来计算ESRD风险型等位基因的数目。风险型等位基因类别的携带者的总数目在括号内指明。每次随访时间点处于由基因型分等级的风险中的个体数目在下面的水平轴上指明。

定义

本文所使用的术语“患者”和“个体”并不限于人类，而是除了人类以外还意图包括所有脊椎动物。在本文公开的一些实施方案中，术语“患者”和“个体”是指世界上的任何人群或任何种族，如亚洲人血统，包括中国人血统或出身。在其他实施方案中，患者是2型糖尿病患者，如中国人血统的2型糖尿病患者。

本文所使用的术语“遗传倾向(genetic predisposition)”，“遗传易感性(genetic susceptibility)”以及“易感性”均指单独的个体患有特定疾病、病症或疾病状况，处于患特定疾病、病症或疾病状况的风险中，或疑似患有特定疾病、病症或疾病状况的可能性。例如，易感性或倾向增加的个体比平均个体患病的可能性高，而倾向降低的个体比平均个体患病的可能性低。

本文所使用的术语“基因”意指足以编码具有期望功能的转录本或蛋白的任何量的核酸材料。因而，其包括但不限于基因组DNA、cDNA、RNA以及经基因改造成在需要的条件下实现期望的表达水平的核酸。因此，其包括融合基因(编码融合蛋白)、完整的基因组基因以及融合至异源启动子、操纵子、增强子和/或其他转录调控序列的DNA序列。该术语指含有基因的整个转录区和全部调控区的整体。基因的转录区包括基因的全部外显子和内含子序列，包括选择性剪切的外显子和内含子，因而除了基因的多肽编码区之外，基因的转录区还包含转录的RNA中存在的调控区及5'和3'非翻译区。

本文所使用的术语“单核苷酸多态性”、“SNP”和“遗传多态性”是当基因组序列中诸如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)的核苷酸变成另一核苷酸时出现的DNA序列变异或遗传变体。SNP是DNA序列中的偶然变异；全人类中绝大部分DNA序列是相同的，如本发明蛋白激酶Cβ1基因的登录号RefSeq NM_002738。SNP或其他变体还可能存在于不含基因的基因组区域中。它们代表负责人类遗传变异性的基因组热点。术语SNP可以与术语“遗传变体”或“变体”交换使用，其存在于种群中至少一个个体的特定遗传基因座且区别于绝大部分DNA序列中相应的参考类型。

本文所使用的术语“单体型”指通常一起遗传的遗传变体或标志物(“等位基因”)的任意组合。单体型可包含两个或多个等位基因，并且包含单体型的基因组区的长度可在少数几百个碱基至多达好几百个千碱基之间变化。如本领域技术人员所认识到的，相同的单体型可以通过确定限定来自不同的核酸链的等位基因的单体型进行不同的描述。例如，由本发明的SNP标志物限定的单体型TTA与由另一条链确定等位基因的单体型TAA相同。本文所描述的单体型差异存在于具有增加的患前述疾病或并发症中的一种或多种风险的患者中。因此，这些单体型具有对肾病及其并发症的风险评估、诊断和预后的诊断价值。检测单体型可以通过本领域内用于检测多态性位点的核苷酸的已知方法来完成。

除非上下文明确指明并非如此，本申请使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数引用。特别是使用不定冠词时，除非上下文要求并非如此，说明书应被理解为考虑复数以及单数。

本文所使用的术语“约”或“大约”结合数字使用时，指所提到的数字的1、5或10%之内的任何数字。

在整篇说明书中提到“一个实施方案”或“实施方案”或“在另一实施方案中”或“一些实施方案”或“在某些实施方案中”，意指结合实施方案所描述的具体指示对象的特征、结构或特性包括于至少一个实施方案中。因而，整篇说明书中不同地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”或“在另一实施方案中”或“在一些实施方案中”未必全部指同一实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任意适合的方式结合。

实施方案详述

本文一方面提供了用于诊断个体中选自以下疾病、病症或疾病状况的遗传倾向的方法：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外。用于诊断个体中所述疾病、病症或疾病状况的遗传倾向的方法包括分析至少一种多核苷酸来检测选自以下的遗传多态性：PKC-β1基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它们的任意组合，其中至少一种所述遗传多态性的存在指示个体患有所述疾病、病症或疾病状况，处于患所述疾病、病症或疾病状况的风险中，或疑似患有所述疾病、病症或疾病状况。

在一实施方案中，所述方法还包括从个体获得含有至少一种多核苷酸的样品的步骤。在另一实施方案中，如果所述样品已被收集且是在个体之外，则可在体外实施所述方法。

在一些实施方案中，所述方法包括分析至少一种多核苷酸来检测选自以下的的至少一种遗传多态性：PKC-β1基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，以及rs4787733的A等位基因。

在一个实施方案中，所述方法包括检测由3种变体或SNP组成的单体型，所述3种变体或SNP如rs3760106，rs7404928和rs4787733的变体(即TTA)；rs2575390，rs7404928和rs4787733的变体(即GTA)。在另一优选的实施方案中，本发明的方法包括检测由3种变体或SNP组成的单体型，所述3种变体或SNP由rs3760106和rs2575390的变体以及rs7404928或rs4787733的另一变体组成。

在本文公开的另一实施方案中，所述方法包括检测由4种变体或SNP组成的单体型，所述4种变体或SNP分别是rs3760106，rs2575390，rs7404928和rs4787733。

本文另一方面提供了用于诊断个体中选自以下疾病、病症或疾病状况的遗传倾向的试剂盒或阵列：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，特别是由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外，所述试剂盒或阵列包含用于检测由所述个体获得的含有至少一种多核苷酸的样品的遗传多态性。

本文公开的又一方面提供了用于治疗或预防具有本发明检测的至少一种遗传多态性的个体选自以下疾病、疾病状况或病症的方法：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，特别是由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外。治疗或预防本文所公开的疾病、疾病状况或病症的方法包括给予个体抵消个体中任何一种所述多态性的效应的化合物，其中所述疾病、疾病状况或病症选自：糖尿病肾并发症，包括2型糖尿病或1型糖尿病的肾病，特别是由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外。

在本发明的治疗方法的实施方案中，所述化合物包括用于抑制至少一种所述SNP的因子，其选自抑制性RNA、抗体、反义核酸、以及用于降低血压、血糖控制、脂质参数的因子或药物，以及用于调控肾素-血管紧张素系统的因子或药物。本领域技术人员将意识到，能够治疗以上提及的疾病，减轻以上提及的疾病症状，或抑制DKD或ESRD进展的任何因子都可以用于给予个体。

虽然用数字表示的SNP染色体位置可能会随着注解目前人类基因组结构而变化，但是SNP识别信息如可变的等位基因和指定SNP的侧翼核苷酸序列将保持不变。本领域技术人员容易认识到，对存在于个体核酸的本文所列的一种或多种SNP中的核苷酸的分析，可以利用现有技术中分配至本文公开列举的SNP的rs ID的序列信息，通过能够确定存在于多态性位点中的核苷酸的任何方法或技术来进行。本领域显而易见的是，多态性中存在的核苷酸可以由任一核酸链或双链来确定。

本文公开的诊断试剂盒(如试剂盒)或阵列包含试剂或材料，以及任选地，用于评估一种或多种SNP以进行糖尿病相关并发症的风险评估、诊断或预后并优化治疗建议的方案或说明书。对试剂盒有用的试剂和材料包括但不限于，本文所描述的PCR引物，杂交探针和引物(如标记的探针或引物)，等位基因特异性寡核苷酸，用于SNP标志物基因分型的试剂，用于检测标记分子的试剂，限制酶(如用于RFLP分析)，DNA聚合酶，RNA聚合酶，DNA连接酶，标志物酶，能够与改变或未改变(天然)的多肽相结合的抗体，用于扩增来自一种或多种SNP的核酸片段的工具，用于分析一种或多种糖尿病并发症或ESRD相关的SNP的核酸序列的工具，或者用于分析由包含这种SNP的基因编码的多肽的一个或多个氨基酸残基序列的工具等。在一个实施方案中，诊断对糖尿病相关并发症或ESRD易感性的试剂盒包含用于检测存在于一种或多种SNP标志物中的核苷酸的引物和试剂，所述一种或多种SNP标志物选自个体核酸PKC-β1基因中的rs3760106，rs2575390，rs7404928和rs4787733。

与糖尿病相关的并发症

诊断患有糖尿病(尤其是2型糖尿病)的人群中，多于90%具有许多潜在的并发症。受糖尿病侵袭的人群中，一半死于由该疾病引发的并发症。

通过本发明的方法，试剂盒或阵列涉及，诊断或检测的并发症包括但不限于：

1.心血管疾病

心血管疾病是糖尿病相关死亡的主导原因。由于患有糖尿病的人群中卒中或心肌梗死的风险提高超过2倍，患有糖尿病的人群中的大部分死亡由被认为是主要的大血管并发症的心脏病或卒中导致。具有降低的估算肾小球滤过率(eGFR)的糖尿病(尤其是2型糖尿病)患者或个体将处于患心血管疾病，甚至是心衰的高风险中。

2.糖尿病肾病

肾脏停止运作时出现终末期肾病(ESRD)，这最终导致需要移植或定期透析，这两项都是极其昂贵的方法。糖尿病占由于肾脏的微血管损伤而引起的ESRD病例的大约50%。

3.糖尿病视网膜病变

糖尿病还是人失明的主要原因。糖尿病视网膜病变被认为是微血管并发症的一种类型。

4.糖尿病神经病变

估计多于50%的患有糖尿病的人群还可能遭受神经系统损伤，引起足或手感觉受损或疼痛，减慢胃消化食物，腕管综合征及其他神经问题。糖尿病神经病变的重症通常与外周血管大血管和微血管疾病相结合，患者可能必须进行下肢截肢。

怀孕，昏迷和对机会性感染疾病的急性易感性的并发症同样是昂贵的糖尿病相关疾病。

在本发明优选的实施方案中，所涉及的并发症选自诸如ESRD的糖尿病肾并发症和心血管疾病。

样品的制备

PKC-β1基因中可能影响疾病易感性的遗传变体或SNP的存在通过从这种变体的单个个体筛选至少一种核酸序列来确定。

核酸序列可以是DNA或RNA。为了测定基因组DNA，可以使用含有基因组DNA的几乎任何生物样品(如不纯的红细胞)。例如，但并非限制，基因组DNA可以方便地获自血液、精液、唾液、泪液、尿液、排泄物、汗液、口腔细胞、皮肤或毛发。为了利用cDNA或mRNA测定，靶核酸必须获自表达该靶序列的细胞或组织。一种优选的DNA来源和含量是3至30ml的抗凝全血，因为由这种样品中的白细胞可以提取足够的DNA来进行本文考虑的多次重复分析。

本文描述的许多方法需要扩增来自靶样品的DNA。这可以通过本领域已知的任何方法来完成，但是优选通过聚合酶链式反应(PCR)。进行PCR的条件优化必须由各反应来确定，并且可以由本领域普通技术人员无需过多试验即可完成。通常，进行PCR的方法可见于Ausbel etal.,eds.,Short Protocols in Molecular Biology,3.sup.rd ed.,Wiley,1995;andInnis et al.,eds.,PCR Protocols,Academic Press,1990中。

其它扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)(参见Wu and Wallace,Genomics,4:560-569,1989;Landegren et al.,Science,241:1077-1080,1988)，转录扩增(Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173-1177,1989)，自主序列复制(Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874-1878,1990)，以及基于核酸的序列扩增(NASBA)。后面两种扩增方法涉及基于等温转录的等温反应，其分别以大约30或100比1的比率产生作为扩增产物的单链RNA(ssRNA)和双链DNA(dsDNA)。

多态性检测

多态性检测涉及为了诊断或流行病学的目的，确定个体中存在哪种形式的多态性。检测技术包括基于PCR的技术或涉及在MassARRAY平台(Sequenom,San Diego,California)上通过MALDI-TOF质谱分析来检测引物延伸的多重产物的方法。已开发了几种方法来检测已知的SNP。这些测定中的许多已由Landegren等(Genome Res.,8:769-776,1998)综述，在此仅进行简要的回顾。

一种测定被称为阵列杂交测定，其实例是多重等位基因特异性的诊断测定(MASDA)(美国专利号5,834,181;Shuber et al.,Hum.Molec.Genet.,6:337-347,1997)。

对影响限制性位点的SNP的高通量筛选可以通过微量滴定阵列对角线凝胶电泳(MADGE)来实现(Day and Humphries,Anal.Biochem.,222:389-395,1994)。

其它的SNP测定取决于聚合酶和连接酶的错配特征。这允许利用特异设计的寡核苷酸，通过被称为PCR扩增特异性等位基因(PASA)(Sommer et al.,Mayo Clin.Proc.,64:1361-13721989;Sarker et al.,Anal.Biochem.1990)，等位基因特异性扩增(ASA)，等位基因特异性PCR以及扩增阻碍突变系统(ARMS)(Newton et al.,Nuc.Acids Res.,1989;Nichols et al.,Genomics,1989;Wu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989)的多种方法，使用PCR快速检测DNA中的单个碱基变化。

通过DNA连接酶连接能与靶DNA序列杂交的两段寡核苷酸对接近连接位点，特别是3'末端的错配非常灵敏。已在寡核苷酸连接测定(OLA;Landegren et al.,Science,241:1077-1080,1988)和连接酶链式反应(LCR;Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189-193,1991)中利用这种灵敏性。

SNP检测的被称为微测序的另一方法中，使用由聚合酶以靶标依赖的方式在紧接单一引物的下游(3')添加特异性核苷酸来确定存在哪种等位基因(美国专利号5,846,710)。

以上讨论的检测SNP的方法仅是示例性的，并不意图穷举。本领域的普通技术人员能够预见在本发明的范围和精神之内的其它检测SNP的方法。

SNP

在本发明中，选择PRKCB基因(登录号：NM_002738)来确定个体中疾病、疾病状况或病症的易感性，特别是本文所述的疾病、病症或疾病状况的易感性。在一实施方案中，包含rs3760106,rs2575390，rs7404928和rs4787733中的至少一种的标签SNP负责个体中所述疾病、病症或疾病状况的易感性。本文所述的方法，试剂盒和阵列涉及检测rs3760106,rs2575390,rs7404928和rs4787733的遗传基因座的SNP。在一个实施方案中，本文所述的方法，试剂盒和阵列涉及检测包含rs3760106,rs2575390,rs4787733和rs7404928中的至少一种，至少两种或至少三种的遗传基因座的SNP。

SNP与对疾病、疾病状况或病症的遗传倾向相关，所述疾病、疾病状况或病症包括但不限于非胰岛素依赖型糖尿病，胰岛素依赖型糖尿病，由非胰岛素依赖型糖尿病引起的终末期肾病，由非胰岛素依赖型糖尿病引起的高血压，由非胰岛素依赖型糖尿病的高血压引起的终末期肾病，由非胰岛素依赖型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，以及由胰岛素依赖型糖尿病引起的终末期肾病。

虽然本文公开的方法或试剂盒可以用于从患有或不患有糖尿病的个体获得的样品，但是优选用于患有2型糖尿病的个体。个体可以是任何种族群，如亚洲人，包括中国血统。

对年龄和性别进行调整之后，我们惊奇地发现具有遗传易感性的风险随着风险基因型或SNP的数目增加而逐步且显著地增加。与具有0或1种风险基因型的那些患者相比，具有3或4种风险基因型或SNP的患者对DKD或ESRD的风险增加1.5-2.0倍。具体地，由3种变体(如rs3760106,rs7404928和rs4787733)组成的单体型的应用，表明与具有0或1种风险基因型的那些个体相比，携带赋予风险的单体型(如rs3760106,rs7404928和rs4787733的TTA)的个体与终末期肾病的风险增加大约1.5至2.0倍或更高(对于rs3760106,rs7404928和rs4787733的TTA，大约1.89倍)相关，而3种各自变体的保护型(如rs3760106,rs7404928和rs4787733的CCG)等位基因的携带者免于发展成糖尿病肾并发症。

发展成终末期肾病的风险随着PRKCB基因中风险型等位基因数目的增加而增加。例如，与具有0或1种风险型等位基因的患者相比，具有4种风险型等位基因(即rs3760106,rs2575390,rs4787733和rs7404928)的患者对终末期肾病的调整风险高于6倍(95%CI,2.00-18.31)。与携带0或1种风险型等位基因的个体相比，携带4种风险型等位基因的个体中终末期肾病的发生率增加。例如，终末期肾病的发生率为：具有0或1种风险型等位基因的个体中，每年4.4/1000人(95%CI,0.5-8.2)，相比携带4种风险型等位基因(即rs3760106,rs2575390,rs4787733和rs7404928)的个体中，每年20.0/1000人(95%CI,8.8-31.1)。

应当理解的是，可将以上提及的一种或多种基因型用于开发与其它已知的用于预测糖尿病并发症风险的临床、生化和遗传学联合使用的阵列，所述糖尿病并发症包括中国血统或世界其他种族的糖尿病患者的肾病和ESRD，并且通过包括集中监测、药物和非药物治疗的多层面方法，这些基因型或其等同的阵列可用于鉴定糖尿病和/或糖尿病ESRD风险个体的风险改变。

本发明将通过以下实施例作进一步的描述。

实施例

方法

研究参与者

我们的研究群体由来自香港糖尿病登记处(Hong Kong DiabetesRegistry,HKDR)于1995至1998年登记的1338名不相关的2型糖尿病患者组成。所有个体具有居住在香港的中国南方汉族血统。将典型的1型糖尿病患者(定义为急性表现出糖尿病酮酸症，重度酮尿症(>3+)，或诊断1年内持续需要胰岛素)排除在外。此外，将具有不完整的临床信息(N=4)，随访期少于3年(N=145)，基线需要透析(N=1)，或登记时患有ESRD(N=16)[定义为估算肾小球滤过率(eGFR)小于15ml/分钟/1.73m²]的患者排除在外。已描述了研究设计、确定、研究个体的入选标准和基因分型⁶²⁷。对于本研究，包括总共1172名不相关的2型糖尿病患者(平均(±SD)年龄56.0±11.9岁，41.3%男性，疾病持续8.5±6.7年)。

验证群体由来自香港糖尿病登记处招募的其他个体组成。以与原始群体相同的方式将包括在重复群体中的个体招募至登记处，但是招募从1998年开始。将登记时患有慢性肾病的患者排除在验证群体之外。为了横向研究PRKCB基因型与肾功能定量测定结果之间的相关性，我们从上海糖尿病研究所(Shanghai Diabetes Institute)的住院患者数据库招募了1,892名不相关的中国人2型糖尿病患者²⁸。本研究经过香港中文大学临床研究道德委员会和上海交通大学道德委员会批准。获得所有参与者的书面知情同意书。

临床研究和结果

禁食过夜之后的早晨，对所有研究参与者进行检查。对包括体重和身高，腰围和血压的人体测量参数进行了测量。采集空腹血样测量血糖、HbA_1C和血脂概况(总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，HDL和LDL胆固醇)。高血压定义为血压≥130/85mmHg或使用抗高血压药物[不包括血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体阻断剂(ARB)]，或者使用ACEI或ARB。使用定时的尿液收集物(4或24小时)来测定尿白蛋白排泄率(AER)。利用通过以下进一步为中国人调整的肾脏病饮食修正(MDRD)开发的简短公式来评估肾小球滤过率(eGFR)：eGFR=186×[S_CR×0.011]^-1.154×[年龄]^-0.203×[0.742如果是女性]×[1.233如果是中国人]，其中S_CR是以μmol/l表示的血清肌酐，1.233是为中国人群调整的系数²⁹。同时记录所有研究个体的药物使用，包括口服降血糖剂和胰岛素治疗。抗高血压药物包括指明用于高血压的所有种类的药物，除了ACEI/ARB。降血脂药物包括他汀类和贝特类药物。

于2005年7月30日，根据医院管理局中央计算机系统(HospitalAuthority Central Computer)的数据库(其记录了所有公共医院的住院信息)审查所有临床终点，包括入院和死亡。这些数据库，包括香港死亡登记，通过唯一的识别号码——香港身份证号(这是对全部香港居民的强制要求并供所有政府部门和主要组织使用)来匹配。按照国际疾病分类第9版修订代码，ESRD被定义为1)由糖尿病伴有肾脏损害(代码250.4)，慢性肾衰竭(代码585)或不明确的肾衰竭(代码586)引起的死亡，或2)非致命性慢性肾衰竭(代码585)或不明确的肾衰竭(代码586)，或3)透析(ICD-9程序代码：39.95)或腹膜透析(ICD-9程序代码：54.98)，或4)随访eGFR<15ml/分钟/1.73m²。

在验证群体中，我们将慢性肾病(CKD)定义为1)由糖尿病伴有肾脏损害(Code250.4)，慢性肾衰竭(代码585)或不明确的肾衰竭(代码586)引起的死亡(仅原则上诊断)，或2)非致命性慢性肾衰竭(代码585)或不明确的肾衰竭(代码586)，或3)透析(ICD-9程序代码：39.95)或腹膜透析(ICD-9程序代码：54.98)，或4)随访eGFR<60ml/分钟/1.73m²。对于验证群体，以前面所述用于原始群体相同的方法，于2008年12月31日，根据医院管理局中央计算机系统的数据库，审查所有临床终点，包括入院和死亡。

基因分型

基于特异针对汉族(CHB)人群的III期HapMap数据库(HapMap发布27[2009年2月],NCBI Build36;dbSNP b126)，我们从跨越PRKCB(登录号:NM_002738)上游和下游2kb的388kb区域(染色体16:23,752,823-24,141,063bp)选择了18个SNP。这些SNP中，利用Haploview(v4.1)程序中的Tagger算法选择r²<0.8且最小等位基因频率(MAF)≥0.05的12个标签SNP(rs7404928,rs3785394,rs3785391,rs120908,rs4788423,rs4787733,rs198198,rs380932,rs429342,rs1015408,rs3785380,rs3785378)。根据“常见疾病-常见变体假说”，假定常见疾病具有常见的病因变体(具有最小等位基因频率(MAF)≥0.05的变体)，因而我们集中于研究本研究中的常见遗传变体的效应。此外，具有r²≥0.8的SNP由于它们的信息80%重叠而被认为是多余的，因此仅选择它们中的一个将更合算。此外，我们选择了具有来自前期研究的暗示性的相关证据的6个SNP(rs3760106,rs2575390,rs3900007,rs3900008,rs432998和rs3729904)²³²⁴，所以利用基因组DNA，于2009年对所有研究个体的总共18个SNP进行了基因分型。

在麦吉尔大学(McGill University)和魁北克基因组创新研究中心(Genome Quebec Innovation Centre)，利用引物延伸多重产物并通过Sequenom MassARRAY平台(San Diego,CA,USA)的MALDI-TOF质谱检测进行了基因分型。所有SNP符合代-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡定律(P>0.05)，如由PLINK精确检验所评估³¹。总的基因型检出率(callrate)是99.3%。基因分型精确度通过在14个重复盲样中显示>99.6%的总一致率来验证。利用MassARRAY iPLEX系统(MassARRAYCompact Analyzer,Sequenom,San Diego,CA,USA)对来自上海的样品进行基因分型。

生物信息学分析和功能注释

为注释PRKCB内被基因分型的基因座的可能潜在的功能，通过以下可利用的生物信息学工具，对染色质结构，进化保守序列，CpG岛和反式调控元件的数据进行评估。从dbSNP130对这些SNP的基因组位置(Ensembl Build40,NBCI v36,hg18)进行作图，并在加州大学圣克鲁兹分校(University of California Santa Cruz)人类基因组浏览器上进行追踪。在UCSC基因组浏览器上选择CpG岛，UW组蛋白修饰区32和PRKCB编码区的数据。通过cisRED数据库鉴定启动子区的保守序列³³。由PReMOD预测基因中的转录调控元件³⁴。

统计学分析

所有数据酌情以百分比，平均值±SD或中值(四分位距)来表示。由于偏态分布，甘油三酯和AER被转换为自然对数。通过卡方检验(针对分类变量)和非配对学生t-检验或Wilcoxon秩和检验(针对连续变量)进行组间比较。

加性、显性和隐性遗传模型的PRKCB多态性与ESRD之间的关系通过调整基线常规风险因子的Cox比例风险回归模型来检验，所述常规风险因子包括性别、年龄、糖尿病持续时间、收缩压和舒张压、HbA_1c、总胆固醇、甘油三酯和AER的自然对数、eGFR、视网膜病(有/无)和药物应用(是/否)。加性模型假定偶见等位基因施加累加效应，所以具有0、1或2个风险型等位基因的携带者分别会无效应、有一些效应及具有最大的病因效应。显性模型假定具有偶见等位基因(纯合子和杂合子)的所有携带者会有病因效应，而隐性模型假定只有具有两个偶见等位基因(纯合子)的携带者会有病因效应。显示具有95%置信区间(CI)的风险比(HR)。我们利用排列法而不是错误发现率法对加性、显性和隐性遗传模型的SNP的多重比较进行了校正。选择从这三个模型获得的最大检验统计量(MAX统计量)³⁵。由于在零假设下MAX统计量的分布是未知的，对所有18个SNP进行基因分型的10,000次排列之后，通过MAX统计量的经验分布来评估实验性显著性。

利用Haploview，计算所有样品的配对连锁不平衡量。利用Haploview中执行的单体型特异性检验来比较患有新发终末期肾病的患者和未患有新发终末期肾病的患者之间的单体型频率。对具有各种单体型的ESRD的风险相关性而计算具有95%置信区间(CI)的风险比(HR)。为评估配对SNP之间对结果变量的相互作用效应，应用Cox比例风险回归模型，包括具有协变量的SNP的主要效应和相互作用效应。

ESRD风险的三种PRKCB多态性(显性模型rs3760106，隐性模型rs7404928及加性模型rs4787733)的联合效应通过基线调整常规风险因子的Kaplan-Meier曲线来显示，其中评估了根据风险型等位基因数目的新发事件的累积概率。趋势的显著性利用携带的风险型等位基因的类别作为自变量，通过Cox回归来检验。

除非指明并非如此，利用SAS v.9.1(SAS Institute,Cary,NC,USA)或Windows v.15的SPSS(SPSS,Chicago,IL,USA)进行所有的统计学分析。双尾P值<0.05被认为是统计上显著的。我们利用遗传力计算器评估了后面的研究力³⁶。假定显性模型具有0.07的最小等位基因频率，我们的样本大小具有95%的能力来检测α水平0.05处ESRD的最低HR2.25。

结果

遗传变体的鉴定

我们对1172名2型糖尿病患者跨越PRKCB基因的18个SNP进行基因分型，包括启动子区的4个SNP，编码外显子的2个SNP和非编码内含子区的6个SNP(表2)。SNP的基因结构和位置示于图1中。在我们的群体中，除了4对SNP(rs3760106和rs2575390;rs3900007和rs3900008;rs3785394和rs3785391;rs3785380和rs3785378)，所有SNP处于中度连锁不平衡，具有r²<0.8。与HapMap CHB群体相比，在我们的群体中，后面两对SNP显示更强的LD(对于rs3785394和rs3785391，本研究中r²=0.81，HapMap CHB数据中r²=0.78；对于rs3785380和rs3785378，本研究中r²=0.94，HapMap CHB数据中r²=0.78)。

研究参与者的临床特征

研究期间，90名患者发展成了ESRD。对ESRD的平均随访期是7.9±1.9年。患有新发ESRD的患者年纪更大且具有更高的HbA_1C,TC,TG水平，LDL-C，收缩压和舒张压，AER，高血压比率以及视网膜病，并且与未患新发ESRD的患者相比，基线更有可能用胰岛素、ACEI和降脂药物治疗。此外，患有新发ESRD的患者有更低的eGFR(表1)。

PRKCB变体与ESRD之间的相关性

rs3760106的T-等位基因和rs2575390的G-等位基因的最小频率(r²=0.99)在患有(12.2%)与未患(7%)伴随性ESRD的患者之间明显不同。

在常规风险因子调整之后的Cox回归模型中，4个SNP与ESRD显著相关(P<0.05)(表2)。rs3760106的T等位基因和紧密连锁的SNPrs2575390(r²=0.98)的G等位基因与ESRD的风险增加强烈相关(显性模型中对于rs3760106，HR(95%C.I.)=2.25(1.31–3.87)，P=0.0034；显性模型中对于rs2575390，HR(95%C.I.)=2.26(1.31–3.88)，P=0.0033)。我们还观察到ESRD与rs7404928的常见TT基因型(隐性模型中，HR(95%C.I.)=1.59(1.01–2.52),P=0.0471)和rs4787733的主要A-等位基因(加性模型中，HR(95%C.I.)=1.78(1.03–3.09),P=0.0399)的较小的相关性。rs3760106(P=0.0299)和rs2575390(P=0.0298)的2个SNP在多重比较校正之后仍然显著。

与单一SNP相关性相比，3个显著且独立的SNP(r²<0.8)(rs3760106,rs7404928和rs4787733)的单体型分析显示相似的效应值(表3)。仅由赋予风险(TTA)和保护型(CCG)等位基因构建的单体型对ESRD分别赋予增加(HR(95%C.I.)=1.89(1.12–3.21),P=0.0159)和降低(HR(95%C.I.)=0.38(0.13–1.16),P=0.0758)的趋势。

PRKCB变体的累加效应和ESRD的发展

我们还检测了PRKCB多态性对ESRD可能的双向上位性，但是未能观测到相互作用的任何证据(数据未示出)。然而，在三个(显性模型rs3760106，隐性模型rs7404928以及加性模型rs4787733)显著且独立的(r²<0.8)SNP的联合效应分析中，随着风险型等位基因(对于ESRD，P=0.0007)数目的增加，ESRD风险显著增加(图1和表4)。与具有一个或没有风险型等位基因的患者相比，具有四个风险型等位基因的患者对ESRD的调整风险是6.044(95%C.I.2.00–18.31)。除了存在PRKCB风险变体之外，鉴定ESRD发展的其他独立的风险因子是HbA1c提高，eGFR降低，对数转换的AER提高以及存在视网膜病(表4)。在我们的基线处没有ESRD的个体群体中，在最多9年的随访期间，90名个体(7.7%)出现新的ESRD事件，形成9.7/1,000人-年(95%CI=7.7–11.7)的年发生率。与携带4个风险型等位基因的个体(群体中的6.9%)的发生率是20.0/1,000(95%CI=8.8–31.1)相比，携带0或1个风险型等位基因的个体(群体中的12.3%)的发生率是4.4/1,000人-年(95%CI=0.5–8.2)。

PRKCB中变体的验证和糖尿病肾病的发展

为了验证PRKCB多态性与糖尿病肾病之间的相关性，我们检测了来自香港糖尿病登记处的其他个体中PRKCB变体的影响。验证群体中的所有个体在原始发现群体之后招募。验证群体中患者的基线特征总结在表1中。与原始群体相比，验证群体中患者年龄更大，具有明显更短的糖尿病和随访持续时间，并且由ACE抑制剂治疗的患者明显更多。因此，在该群体中，与原始群体相比，在随访期间发展成ESRD的患者比例更低(总共3677名个体中的253名个体，6.9%)。为了检测该群体中PRKCB变体对DKD发展的影响，我们从该群体中选择了具有早发性疾病的患者(定义为发病年龄<45岁，其在基线处没有慢性肾病)，并且鉴别出在随访期间向慢性肾病发展的患者。该患者群体中基因分型的特征总结在表1中。在随访期间，总共1049名患者中的151名(14.3%)发展成CKD。发现在该群体中，rs3760106变体的T等位基因和rs2575390变体的G等位基因与CKD的发展显著相关，分别具有1.68(95%CI1.1-2.57)和1.62(95%CI1.07-2.47)的HR(表2)。虽然rs7404928和rs4787733变体与慢性肾病的相关性未达到统计显著性，但是利用与原始发现群体相同的遗传模型，处于风险中的变体在同一方向增加发展成肾功能障碍的风险。

PRKCB变体与eGFR之间的关系

为了更好地理解PRKCB遗传变体与肾功能障碍发展之间的关系，我们在独立的横向群体(在上海招募的2型糖尿病中国患者)中，进一步检测了PRKCB中的遗传变体与基线肾功能之间的关系(表3)。调整年龄、性别和BMI之后，我们未发现PRKCB变体与基线eGFR(p=0.66-0.82)或CKD(定义为eGFR<60ml/分钟/1.73m²,n=195)(p=0.27-0.53)之间的相关性。这类似于基于来自我们基因分型患者的基线eGFR的所有横向数据的分析的分析。

PRKCB中涉及的遗传变体的功能注释

我们对所鉴别的遗传变体的功能意义进行了广泛的生物信息学分析。已知这些变体中的一种——rs3760106位于转录因子Sp1的潜在结合位点，这提示DNA与结合蛋白之间可能的相互作用²³。进一步的生物信息学分析(总结在表4中)表明，rs3760106、rs2575390和rs3900007全部位于PRKCB启动子的保守序列之内，而rs2575390和rs3900007位于组蛋白修饰位点(H3K27me3)之内并由此可改变基因的转录活性。rs7404928和rs4787733变体同样位于推测具有功能意义的DNA区之内，所述DNA区可改变调控因子的结合并由此导致基因转录改变(表4)。

讨论

在本文随访8年的2型糖尿病患者中，我们发现PRKCB基因的遗传变体不依赖于其它已知的风险因子而预测伴随性ESRD的发展，在赋予风险等位基因中具有联合效应。尽管在基线处对视网膜病、蛋白尿症、肾功能、风险因子控制及使用包括ACEI的药物进行校正，然而仍存在这些相关性。我们的研究优势包括相对长的随访持续时间，临床参数和药物应用的详细记录，以及利用ESRD作为估量DKD的结果。因而我们一致的结果表明，PRKCB基因中的遗传变异对于2型糖尿病患者(如中国患者)发展成DKD的风险是重要的决定因素。

我们对PRKCB变体数目的增加在预测糖尿病肾病中的累加效应的新发现是出乎预料的，尤其是考虑到变体中的几个处于非编码区中。如通过我们的生物信息学所预测的，这可反映出这些变体对其他转录因子的结合效应或其他后生效应。在本文中，我们的结果表明，PRKCB多态性与ESRD的风险相关性不依赖于糖血症控制，这提示可能涉及其他非血糖途径。

总之，我们的发现表明肾病与PRKCB的风险相关性可由相互作用的途径介导，包括但不限于高血糖症，以及增加的氧化应激导致肾小管损伤和间质纤维化。

我们的研究设计检测了PRKCB变体与肾功能障碍发展之间的相关性。此外，考虑到我们对高血糖症与蛋白激酶C-β活化之间的相互作用的生物学理解，可以预期PRKCB变体对于患有糖尿病的个体的影响是特异性的。

考虑到PKC-β在DKD和其他糖尿病血管并发症的发病机理中的重要作用，开发了PKC-β的选择性抑制剂——鲁伯斯塔(Ruboxistaurin，RBX)。该药在几种动物模型中标准化了与糖尿病相关的血流动力学变化、ECM积累以及肾小球损伤的组织学特征¹⁸¹⁹²⁰。在2期临床试验中，包括用ARB或ACEI最佳治疗的123名患有DKD的2型糖尿病患者，用RBX治疗进一步降低了尿液TGF-β水平，减少了肾小球滤过率损失的比率以及减少蛋白尿²²⁵⁷。参与RBX临床试验的糖尿病周围神经病变患者中的肾病标志物的初步分析还表明，研究期间改进了肾参数⁵⁸⁵⁹。考虑到诸如DKD的复杂疾病的表型和遗传异质性，检测PRKCB基因型与对PBX的临床反应之间的相互作用是有意义的，如最近在具有ACE插入/缺失多态性的个体中对ARB的临床反应的病例中所证明的⁶⁰。

总之，我们发现PRKCB基因的遗传变体不依赖于混杂因素而预测伴随性ESRD，所述混杂因素特别是蛋白尿症、糖血症、视网膜病及其他风险因子控制。

参考文献

1.Ramachandran A,Ma RC,Snehalatha C.Diabetes in Asia.Lancet.Jan302010;375(9712):408-418.

2.Chan JC,Malik V,Jia W,et al.Diabetes in Asia:epidemiology,risk factors,and pathophysiology.Jama.May272009;301(20):2129-2140.

3.Yoon KH,Lee JH,Kim JW,et al.Epidemic obesity and type2diabetes inAsia.Lancet.Nov112006;368(9548):1681-1688.

4.Yang W,Lu J,Weng J,et al.Prevalence of diabetes among men and womenin China.N Engl J Med.Mar252010;362(12):1090-1101.

5.Ritz E,Rychlik I,Locatelli F,Halimi S.End-stage renal failure in type2diabetes:A medical catastrophe of worldwide dimensions.Am J Kidney Dis.Nov1999;34(5):795-808.

6.Yang X,So WY,Tong PC,et al.Development and validation of an all-causemortality risk score in type2diabetes.Arch Intern Med.Mar102008;168(5):451-457.

7.Wu AY,Kong NC,de Leon FA,et al.An alarmingly high prevalence ofdiabetic nephropathy in Asian type2diabetic patients:the MicroAlbuminuria Prevalence(MAP)Study.Diabetologia.Jan2005;48(1):17-26.

8.Morrish NJ,Wang SL,Stevens LK,Fuller JH,Keen H.Mortality and causesof death in the WHO Multinational Study of Vascular Disease in Diabetes.Diabetologia.Sep2001;44Suppl2:S14-21.

9.Karter AJ,Ferrara A,Liu JY,Moffet HH,Ackerson LM,Selby JV.Ethnicdisparities in diabetic complications in an insured population.Jama.May152002;287(19):2519-2527.

10.Yang XL,So WY,Kong AP,et al.End-stage renal disease risk equations forHong Kong Chinese patients with type2diabetes:Hong Kong Diabetes Registry.Diabetologia.Oct2006;49(10):2299-2308.

11.Yang XL,So WY,Kong AP,et al.Modified end-stage renal disease risk scorefor Chinese type2diabetic patients--the Hong Kong Diabetes Registry.Diabetologia.Jun2007;50(6):1348-1350.

12.Soldatos G,Cooper ME.Diabetic nephropathy:important pathophysiologicmechanisms.Diabetes Res Clin Pract.Nov132008;82Suppl1:S75-79.

13.Freedman BI,Bostrom M,Daeihagh P,Bowden DW.Genetic factors indiabetic nephropathy.Clin J Am Soc Nephrol.Nov2007;2(6):1306-1316.

14.Sheetz MJ,King GL.Molecular understanding of hyperglycemia's adverseeffects for diabetic complications.Jama.Nov272002;288(20):2579-2588.

15.He Z,Ma RC,King GL.Role of Protein Kinase C Isoforms in DiabeticVascular Dysfunction.In:Marso SP,Stern DM,eds.Diabetes and Cardiovascular Disease.Philadelphia,USA:Lippincott Williams&Wilkins;2004:37-54.

16.Ma RC,Isshiki K,King GL.Protein kinase C and diabetic nephropathy:aperspective on its inhibition.In:Morgensen CE,ed.The Kidney and Hypertension inDiabetes Mellitus.6th edition ed.Boston:Kluver Academic Press;2004.

17.Noh H,King GL.The role of protein kinase C activation in diabeticnephropathy.Kidney Int Suppl.Aug2007(106):S49-53.

18.Ishii H,Jirousek MR,Koya D,et al.Amelioration of vascular dysfunctions indiabetic rats by an oral PKC beta inhibitor.Science.May31996;272(5262):728-731.

19.Koya D,Jirousek MR,Lin YW,Ishii H,Kuboki K,King GL.Characterization of protein kinase C beta isoform activation on the gene expression oftransforming growth factor-beta,extracellular matrix components,and prostanoids in theglomeruli of diabetic rats.J Clin Invest.Jul11997;100(1):115-126.

20.Koya D,Haneda M,Nakagawa H,et al.Amelioration of accelerated diabeticmesangial expansion by treatment with a PKC beta inhibitor in diabetic db/db mice,arodent model for type2diabetes.Faseb J.Mar2000;14(3):439-447.

21.Ohshiro Y,Ma RC,Yasuda Y,et al.Reduction of diabetes-induced oxidativestress,fibrotic cytokine expression,and renal dysfunction in protein kinase Cbeta-nullmice.Diabetes.Nov2006;55(11):3112-3120.

22.Tuttle KR,Bakris GL,Toto RD,McGill JB,Hu K,Anderson PW.The effectof ruboxistaurin on nephropathy in type2diabetes.Diabetes Care.Nov2005;28(11):2686-2690.

23.Araki S,Ng DP,Krolewski B,et al.Identification of a common risk haplotypefor diabetic nephropathy at the protein kinase C-beta1(PRKCB1)gene locus.J Am SocNephrol.Aug2003;14(8):2015-2024.

24.Araki S,Haneda M,Sugimoto T,et al.Polymorphisms of the protein kinaseC-beta gene(PRKCB1)accelerate kidney disease in type2diabetes without overtproteinuria.Diabetes Care.Apr2006;29(4):864-868.

25.Ng MC,Park KS,Oh B,et al.Implication of genetic variants near TCF7L2,SLC30A8,HHEX,CDKAL1,CDKN2A/B,IGF2BP2,and FTO in type2diabetes andobesity in6,719Asians.Diabetes.Aug2008;57(8):2226-2233.

26.Luk AO,So WY,Ma RC,et al.Metabolic syndrome predicts new onset ofchronic kidney disease in5,829patients with type2diabetes:a5-year prospective analysisof the Hong Kong Diabetes Registry.Diabetes Care.Dec2008;31(12):2357-2361.

27.Yang X,So WY,Kong AP,et al.Development and validation of stroke riskequation for Hong Kong Chinese patients with type2diabetes:the Hong Kong DiabetesRegistry.Diabetes Care.Jan2007;30(1):65-70.

28.Hu C,Wang C,Zhang R,et al.Association of genetic variants of NOS1APwith type2diabetes in a Chinese population.Diabetologia.Feb;53(2):290-298.

29.Ma YC,Zuo L,Chen JH,et al.Modified glomerular filtration rate estimatingequation for Chinese patients with chronic kidney disease.J Am Soc Nephrol.Oct2006;17(10):2937-2944.

30.Barrett JC,Fry B,Maller J,Daly MJ.Haploview:analysis and visualizationof LD and haplotype maps.Bioinformatics.Jan152005;21(2):263-265.

31.Purcell S,Neale B,Todd-Brown K,et al.PLINK:a tool set for whole-genomeassociation and population-based linkage analyses.Am J Hum Genet.Sep2007;81(3):559-575.

32.Sabo PJ,Hawrylycz M,Wallace JC,et al.Discovery of functional noncodingelements by digital analysis of chromatin structure.Proc Natl Acad Sci U S A.Nov302004;101(48):16837-16842.

33.Robertson G,Bilenky M,Lin K,et al.cisRED:a database system forgenome-scale computational discovery of regulatory elements.Nucleic Acids Res.Jan12006;34(Database issue):D68-73.

34.Ferretti V,Poitras C,Bergeron D,Coulombe B,Robert F,Blanchette M.PReMod:a database of genome-wide mammalian cis-regulatory module predictions.Nucleic Acids Res.Jan2007;35(Database issue):D122-126.

35.Sladek R,Rocheleau G,Rung J,et al.A genome-wide association studyidentifies novel risk loci for type2diabetes.Nature.Feb222007;445(7130):881-885.

36.Purcell S,Cherny SS,Sham PC.Genetic Power Calculator:design of linkageand association genetic mapping studies of complex traits.Bioinformatics.Jan2003;19(1):149-150.

37.Toyoda M,Suzuki D,Honma M,et al.High expression of PKC-MAPKpathway mRNAs correlates with glomerular lesions in human diabetic nephropathy.Kidney Int.Sep2004;66(3):1107-1114.

38.Langham RG,Kelly DJ,Gow RM,et al.Increased renal gene transcription ofprotein kinase C-beta in human diabetic nephropathy:relationship to long-term glycaemiccontrol.Diabetologia.Apr2008;51(4):668-674.

39.Kramer HJ,Nguyen QD,Curhan G,Hsu CY.Renal insufficiency in theabsence of albuminuria and retinopathy among adults with type2diabetes mellitus.Jama.Jun252003;289(24):3273-3277.

40.MacIsaac RJ,Tsalamandris C,Panagiotopoulos S,Smith TJ,McNeil KJ,Jerums G.Nonalbuminuric renal insufficiency in type2diabetes.Diabetes Care.Jan2004;27(1):195-200.

41.Fioretto P,Caramori ML,Mauer M.The kidney in diabetes:dynamicpathways of injury and repair.The Camillo Golgi Lecture2007.Diabetologia.Aug2008;51(8):1347-1355.

42.Fioretto P,Mauer M,Brocco E,et al.Patterns of renal injury in NIDDMpatients with microalbuminuria.Diabetologia.Dec1996;39(12):1569-1576.

43.Kelly DJ,Edgley AJ,Zhang Y,et al.Protein kinase C-beta inhibitionattenuates the progression of nephropathy in non-diabetic kidney disease.Nephrol DialTransplant.Jun2009;24(6):1782-1790.

44.Chan JC,So WY,Yeung CY,et al.Effects of structured versus usual care onrenal endpoint in type2diabetes:the SURE study:a randomized multicenter translationalstudy.Diabetes Care.Jun2009;32(6):977-982.

45.Song XY,Lee SY,Ma RC,et al.Phenotype-genotype interactions on renalfunction in type2diabetes:an analysis using structural equation modelling.Diabetologia.Aug2009;52(8):1543-1553.

46.Sarafidis PA,Ruilope LM.Insulin resistance,hyperinsulinemia,and renalinjury:mechanisms and implications.Am J Nephrol.2006;26(3):232-244.

47.Forbes JM,Coughlan MT,Cooper ME.Oxidative stress as a major culprit inkidney disease in diabetes.Diabetes.Jun2008;57(6):1446-1454.

48.Etoh T,Inoguchi T,Kakimoto M,et al.Increased expression of NAD(P)Hoxidase subunits,NOX4and p22phox,in the kidney of streptozotocin-induced diabetic ratsand its reversibity by interventive insulin treatment.Diabetologia.Oct2003;46(10):1428-1437.

49.Asaba K,Tojo A,Onozato ML,et al.Effects of NADPH oxidase inhibitor indiabetic nephropathy.Kidney Int.May2005;67(5):1890-1898.

50.Gorin Y,Block K,Hernandez J,et al.Nox4NAD(P)H oxidase mediateshypertrophy and fibronectin expression in the diabetic kidney.J Biol Chem.Nov252005;280(47):39616-39626.

51.Gao L,Mann GE.Vascular NAD(P)H oxidase activation in diabetes:adouble-edged sword in redox signalling.Cardiovasc Res.Apr12009;82(1):9-20.

52.Kottgen A,Glazer NL,Dehghan A,et al.Multiple loci associated with indicesof renal function and chronic kidney disease.Nat Genet.May2010;42(5):376-84.

53.Kottgen A,Pattaro C,Boger CA,et al.New loci associated with kidneyfunction and chronic kidney disease.Nat Genet.May2010;42(5):376-384.

54.Chambers JC,Zhao J,Terracciano CM,et al.Genetic variation in SCN10Ainfluences cardiac conduction.Nat Genet.Feb2010;42(2):149-152.

55.Dupuis J,Langenberg C,Prokopenko I,et al.New genetic loci implicated infasting glucose homeostasis and their impact on type2diabetes risk.Nat Genet.Feb;42(2):105-116.

56.Rothman KJ,Greenland S.Causation and causal inference in epidemiology.Am J Public Health.2005;95Suppl1:S144-150.

57.Gilbert RE,Kim SA,Tuttle KR,et al.Effect of ruboxistaurin on urinarytransforming growth factor-beta in patients with diabetic nephropathy and type2diabetes.Diabetes Care.Apr2007;30(4):995-996.

58.Tuttle KR,Bastyr EJ,McGill JB,Cheng CL,Anderson PW.Albuminuria andkidney function in a long-term study of ruboxistaurin for diabetic nephropathy.J Am SocNephrol.2007;18:48A.

59.Tuttle KR.Protein kinase C-beta inhibition for diabetic kidney disease.Diabetes Res Clin Pract.Nov132008;82Suppl1:S70-74.

60.Parving HH,de Zeeuw D,Cooper ME,et al.ACE gene polymorphism andlosartan treatment in type2diabetic patients with nephropathy.J Am Soc Nephrol.Apr2008;19(4):771-779.

表1.中国2型糖尿病患者中根据向ESRD发展分等级的基线临床特征和生化概况

数据以N，平均值±SD或中值(四分位距)示出。

表2中国2型糖尿病患者中ESRD风险的PRKCB SNP的基因型分布和PRKCB多态性的风险比

风险比是指赋予风险的等位基因。P值由调整基线常规风险因子[性别、年龄和糖尿病持续时间、收缩压和舒张压、HbA_1c、总胆固醇、甘油三酯的自然对数、eGFR、AER的自然对数、视网膜病(有/无)和药物应用(是/否)]的Cox比例风险回归计算。斜体是指MAX统计中考虑的遗传模型。^a多重比较校正之后的显著性SNP。

表3中国2型糖尿病患者中由PRKCB区中的三个显著性SNP组成的单体型与ESRD终点之间的相关性

利用Haploview，通过单体型特异性检验(1df)比较新发ESRD患者与无新发ESRD患者之间的单体型。分别由rs3760106,rs7404928和rs4787733的风险型和保护型等位基因构建“TTA”和“CCG”。

表42型糖尿病中ESRD预测因子的风险比的Cox-回归分析

选择三个(显性模型rs3760106，隐性模型rs7404928和加性模型rs4787733)显著且独立的(r²<0.8)SNP来计算ESRD风险型等位基因的数目

Claims

1.用于诊断个体中疾病、病症或疾病状况的遗传倾向的方法，包括分析至少一种多核苷酸来检测选自以下的至少一种单核苷酸多态性(SNP)：PKC-β1基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它们的组合，

其中所述单核苷酸多态性的存在指示所述个体患有所述疾病、病症或疾病状况，处于患所述疾病、病症或疾病状况的风险中，或疑似患有所述疾病、病症或疾病状况，

其中所述疾病、病症或疾病状况包括糖尿病肾并发症，其选自由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；2型糖尿病或1型糖尿病的肾病；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测由3种变体或SNP组成的单体型，所述3种变体或SNP包括rs3760106，rs7404928和rs4787733的变体；rs2575390，rs7404928和rs4787733的变体；或rs3760106和rs2575390的变体，加上rs7404928或rs4787733之一的变体。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测由4种变体或SNP组成的单体型，所述4种变体或SNP分别是rs3760106，rs2575390，rs7404928和rs4787733的变体。

4.如权利要求1所述的方法，其还包括从所述个体获得样品的步骤。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述样品选自血液、精液、唾液、泪液、尿液、排泄物、汗液、口腔细胞、皮肤、毛发或含有所述个体的核苷酸的其它组织。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述个体患有2型糖尿病。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或疾病状况是ESRD。

8.用于诊断个体中疾病、病症或疾病状况的遗传倾向的试剂盒或阵列，其包含用于检测从所述个体获得的含有至少一种多核苷酸的样品的至少一种单核苷酸多态性的试剂，

其中所述单核苷酸多态性选自：PKC-β1基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它们的组合，

9.如权利要求8所述的试剂盒或阵列，其中所述试剂盒或阵列包含用于检测由3种变体或SNP组成的单体型的试剂，所述3种变体或SNP包括rs3760106，rs7404928和rs4787733的变体；rs2575390，rs7404928和rs4787733的变体；或rs3760106和rs2575390的变体，加上rs7404928或rs4787733之一的变体。

10.如权利要求8所述的试剂盒或阵列，其中所述试剂盒或阵列包含用于检测由4种变体或SNP组成的单体型的试剂，所述4种变体或SNP分别是rs3760106，rs2575390，rs7404928和rs4787733的变体。

11.如权利要求8所述的试剂盒或阵列，其中所述样品选自血液、精液、唾液、泪液、尿液、排泄物、汗液、口腔细胞、皮肤、毛发或含有所述个体的核苷酸的其它组织。

12.如权利要求8至11中任一项所述的试剂盒或阵列，其中所述个体患有2型糖尿病。

13.治疗或预防具有选自以下至少一种单核苷酸多态性(SNP)的个体中疾病、疾病状况或病症的方法：PKC-β1基因中的rs3760106的T等位基因，rs2575390的G等位基因，rs7404928的TT基因型，rs4787733的A等位基因以及它们的组合，所述方法包括给予所述个体抵消所述个体中任何一种所述多态性的效应的化合物，

其中所述疾病、疾病状况或病症包括糖尿病肾并发症，其选自由2型糖尿病引起的终末期肾病(ESRD)，由2型糖尿病高血压引起的ESRD，由1型糖尿病引起的ESRD；2型糖尿病或1型糖尿病的肾病；由2型糖尿病或1型糖尿病引起的心血管疾病，如由2型糖尿病或1型糖尿病引起的动脉粥样硬化性周围血管病，高血压，缺血性心肌病和心肌梗死；以及由2型糖尿病引起的脑血管意外，并且其中所述化合物包括能够抑制至少一种所述SNP的因子，且所述因子选自抑制性RNA、抗体、反义核酸、以及用于降低血压、血糖控制、脂质参数的因子或药物，以及用于调控肾素-血管紧张素系统的因子或药物。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述疾病、病症或疾病状况是ESRD。