CN103149188B - 一种荧光定量检测羟基自由基的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荧光定量检测羟基自由基的方法，特别是涉及一种以苯五甲酸为荧光探针的荧光定量检测羟基自由基的方法，具体步骤为：将捕捉剂苯五甲酸加入待测体系中，使其摩尔浓度为羟基自由基产生物摩尔浓度的1倍及1倍以上；检测待测体系荧光强度，由荧光强度计算此时待测体系中羟基自由基的产生量。苯五甲酸苯环结构仅含一个反应位点，与羟基自由基加成后生成唯一荧光性产物—羟基苯五甲酸，使定量检测更准确。本发明可在20～98℃对产生羟基自由基的体系(pH≥5)进行定量检测。本发明操作简单快速、专一性强、灵敏度高。有助于探究纺织化学、环境化学、制浆造纸等产生羟基自由基工艺体系的机理，从而更好地指导生态生产工艺。

Description

一种荧光定量检测羟基自由基的方法

技术领域

本发明涉及一种荧光定量检测羟基自由基的方法，特别是涉及一种以苯五甲酸为荧光探针的荧光定量检测羟基自由基的方法。

背景技术

活性氧是指比分子状态氧（空气中存在的氧）反应性更活泼的、含有氧原子的分子或自由基，如羟基自由基(HO^·)、超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)、单线态氧(¹O₂)及过羟基自由基(HOO^·)等。活性氧的测试涉及各个领域，包括纺织化学、造纸制浆、医学、食品、环境中。在上述含氧类自由基中,羟基自由基是水溶液中最强的氧化剂之一，可引发诱导产生链反应,主要通过电子转移、亲电加成、脱氢反应等途径无选择性地与各种有机化合物直接作用并最终将其降解为CO₂、H₂O等无害物质。

目前检测羟基自由基的方法主要包括分光光度法、电子自旋法(ESR)、化学发光法、电化学法、高效液相色谱法(HPLC)等(Zhou KQ,et al.,Food Chem.2006,95:446-457;Christopher J.,etal.,Anal.Chem.2011,83:261-268;Kilinc E.,et al.,Talanta,2005,65:876-881;Chao T,et al.,Anal.Chim.Acta2004,527:73–80;吴峰等，专利CN1412553A,2003-4-23)，但以上检测大部分在标准体系中进行，且都有不可避免的缺陷，难以实现快速准确检测。分光光度法仪器易为一般实验室采用，但测定的准确性较差，灵敏度较低，专一性不强；ESR仪器成本较高，灵敏度低，专一性不强；化学发光法经常产生人工活性氧干扰结果；电化学检测则有电极面积及定位的限制，抗干扰能力不强，选择性差，应用范围有限；高效液相色谱法(HPLC)操作复杂耗时，且固定相的存在会引起自由基的各种反应而使自由基猝灭。荧光分析法(Peter W.,et al.,Free RadicalBio.Med.,2007,43:995-1022)具有简单快速、灵敏度高、易于实现自动化、可视化和在线检测等特点，而且仪器廉价，在一般实验室中较常见，因此近年来在羟基自由基检测中备受关注。

荧光分析法检测羟基自由基的体系一般都需选用捕获剂，利用捕获剂与羟基自由基反应后底物荧光强度的改变，实现间接测定活性氧的浓度。目前采用的捕获剂有水杨基荧光酮(任凤莲等，分析化学，2001,29(1):60-62)和罗丹明6G(Jing F,et al.,J.Fluoresc.,2007,17:257–264)等荧光染料，利用羟基自由基的强氧化作用可使染料体系降解，荧光强度减弱，实现Fenton体系中羟基自由基的荧光检测。但此类荧光减弱型检测方法的选择性和重现性较差，不适合于复杂体系如纺织品前处理高温氧漂工艺体系中羟基自由基的检测。二甲基亚砜也为一种羟基自由基捕获剂，有人采用分光光度法(潘光建，中国造纸学报，2006,21(3):41-47)和荧光光度法(谷学新，分析科学学报，2002,18(6):460-462)研究了二甲基亚砜(DMSO)捕捉羟自由基的反应，但反应步骤较长，定量检测不准确。

另一类荧光增强型的常用捕获剂为苯甲酸和对苯二甲酸，这类捕捉剂普遍被认为可与羟基自由基反应生成稳定的2-羟基苯甲酸，通过检测羟基化产物的荧光可间接检测羟基自由基的产生情况。苯甲酸首先被用于羟基自由基的荧光检测，Vidrio等人利用苯甲酸荧光检测环境中颗粒物导致的羟基自由基产生量(Vidrio,E.,et al.,Environ.Sci.Technol.,2009,43,922-927)。检测原理是苯甲酸本身没有荧光，但在捕捉羟基自由基发生加成反应后，生成荧光性产物邻羟基苯甲酸，通过检测荧光强度，可间接测定羟基自由基。从分子结构上可以看出，苯甲酸分子中苯环上有5个反应位点，因此羟基自由基的加成反应没有选择性，但只有加成在邻位的羟基化衍生物才会产生荧光。由于苯甲酸分子的不对称结构，苯甲酸与羟基自由基加成反应也可得到不发荧光的间位和对位羟基化衍生物，也就是说发生了对荧光没有贡献的无效加成，这使得通过荧光强度测定并不能准确检测羟基自由基，捕捉效率低。

为了克服苯甲酸分子不对称结构导致的不能准确检测羟基自由基的缺陷，随后的研究发现使用分子结构对称的对苯二甲酸替代苯甲酸，这样保证了羟基的加成反应发生在邻位，生成荧光性的邻羟基对苯二甲酸，该方法因为引入对称性消除了苯甲酸中可能发生无效加成的缺陷，使得测定羟基自由基的准确度有了提高，成为目前广泛应用于生物环境中的羟基自由基荧光检测的方法。Tang等人(Tang B,et al.,Talanta,2005,65,769-775)利用对苯二甲酸为捕捉剂，进行了Fenton体系中羟基自由基的荧光检测；Page等人(Page,S.E.,et al.,J.Environ.Monit.,2010,12,1658-1665)基于以上反应体系研究了光化学反应中羟基自由基的产生情况。尽管对苯二甲酸分子中的对称可消除无效的间位和对位加成，但仍然存在有4个反应位点，加成反应并不能保证仅有单羟基化衍生物，因此反应所得到的羟基化产物并不唯一，可能会生成单羟基、双羟基、三羟基和四羟基化对苯二甲酸的多种衍生物。因为这些羟基化衍生物的荧光性能不同，显然这种荧光测定羟基自由基的方法具有重现性比较差的缺陷。因此亟需开发一种专一性、重现性、稳定性均好且可用于评价复杂体系如纺织品前处理氧漂工艺体系中羟基自由基产生情况的新型荧光探针。

发明内容

本发明克服了现有技术中的不足，提供一种选择性、稳定性、重现性、灵敏性高的荧光检测HO^·的新方法，为了克服以上苯甲酸和对苯二甲酸荧光测定HO^·的缺陷，本发明采用了苯五甲酸作为捕捉剂：苯五甲酸是一个不对称分子，其中苯环上只有一个可供HO^·加成的反应位点，捕获HO^·发生加成反应后，仅有一种结构确定的荧光性羟基化衍生物生成，也即生成了唯一的荧光性羟基化产物-羟基苯五甲酸，因而可通过测量荧光强度实现准确定量检测羟基自由基，弥补上述苯甲酸和对苯二甲酸系列中准确度低和重现性差的缺陷。通过ESI-MS分析反应体系，唯一羟基苯五甲酸得以确认；同时对苯二甲酸体系的ESI-MS分析结果则表明，有多种羟基化产物生成。本发明中涉及的苯五甲酸探针适用于一切羟基自由基产生的体系，通过测量羟基苯五甲酸的荧光强度，可计算出体系中产生的羟基自由基。

荧光性羟基化产物-羟基苯五甲酸即使在高温(80℃)碱性条件下稳定性也很高，长时间放置荧光信号无明显减弱。苯五甲酸对HO^·选择性很高，多次平行实验重现性好，灵敏度较高。另外本发明采用的苯五甲酸在广泛pH范围(pH≥4)水溶液中溶解性很好，保证了该方法在实际生产工艺中的应用范围。

本发明的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征是：所述方法的荧光探针为苯五甲酸，其分子结构式为

本发明采用的新型探针苯五甲酸捕捉HO^·后可生成唯一产物羟基苯五甲酸，反应方程式如下：

本发明的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，具体步骤为：将捕捉剂苯五甲酸加入待测体系中，使其摩尔浓度为羟基自由基产生物摩尔浓度的1倍以上，保证羟基自由基完全被捕捉；捕捉反应结束后调节待测体系pH为9～10，以与标准产物羟基苯五甲酸线性关系检测时的pH值一致；检测待测体系的荧光强度，根据荧光强度与羟基苯五甲酸浓度的线性关系及羟基自由基与羟基苯五甲酸的一一对应关系，由荧光强度计算出此时待测体系中羟基自由基的产生量。

作为优选的技术方案：

如上所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，所述苯五甲酸加入待测体系中的浓度为羟基自由基产生物浓度的1～3倍。苯五甲酸用量较少时导致羟基自由基捕捉不够充分，定量检测不准确，用量过多时则造成苯五甲酸不能被充分利用。

如上所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，利用羟基自由基加成后生成的唯一荧光性羟基化产物-羟基苯五甲酸与羟基自由基的一一对应关系，所述待测体系中定量检测的羟基自由基浓度范围为0.00414～5.52μmol/L，羟基自由基浓度大于5.52μmol/L时可通过稀释待测体系至其羟基自由基浓度在0.00414～5.52μmol/L范围内，再将稀释后待测体系的羟基自由基浓度乘以稀释的倍数即为原待测体系的羟基自由基浓度。

所述计算按照羟基自由基浓度与荧光强度的线性关系，为：

羟基自由基浓度为0.00414～0.4923μmol/L时，Y=353.68304X-0.02765，此时线性相关系数R²=0.99961；

羟基自由基浓度为0.4923～5.52μmol/L时，Y=204.17159X+79.88334，此时线性相关系数R²=0.99849；

其中

Y为荧光强度；荧光强度为一个相对数值，无单位，可用a.u.，即任意单位的意思；

X为羟基自由基浓度，单位为μmol/L。

R²为线性相关系数，是衡量变量之间线性相关程度的指标，R²越接近1，说明两变量之间的线性相关度越好。

如上所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，所述待测体系的适宜捕捉温度为20～98℃，pH≥5；所述待测体系的适宜检测温度为室温，pH范围为7～11。在酸性条件下检测待测体系时，产物羟基苯五甲酸发射波长会红移5～13nm左右，并且其荧光信号强度与中碱性条件下相比较弱，因此需在捕捉反应结束后调节待测体系pH为7～11，为与标准产物羟基苯五甲酸线性关系检测时的条件一致，调节待测体系pH为9～10，然后检测待测体系的荧光强度；中碱性条件(pH≥7)下检测产物羟基苯五甲酸的荧光信号强度、激发及发射波长较稳定。

如上所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，所述的检测荧光强度是采用荧光分光光度计。荧光法简单快速、灵敏度高，可在线检测，在实验室中易实现。

如上所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，所述荧光分光光度计的型号为F-7000。该荧光分光光度计灵敏度较高，信噪比800以上，检测时采用扫描速度为240nm/min，激发和发射狭缝宽度都为5.0nm，光电倍增管电压为400V。

如上所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，所述苯五甲酸溶于缓冲液或碱性溶液形成苯五甲酸溶液后加入至待测体系中。由于苯五甲酸微溶于水，应采用缓冲液或碱性溶液溶解后再用于捕捉体系(pH≥5)中产生的羟基自由基，因此在捕捉羟基自由基前应将苯五甲酸在缓冲液或者碱性溶液中充分溶解。

如上所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，所述溶解苯五甲酸的缓冲液为磷酸盐或硼酸盐溶液；所述溶解苯五甲酸的碱性溶液为NaOH或KOH溶液。缓冲溶液和碱性溶液是为充分溶解苯五甲酸提供碱性环境，以便于后续体系中羟基自由基的捕捉。

如上所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，所述的苯五甲酸溶液中苯五甲酸的浓度为10^-6～0.2mol/L。根据待测体系中羟基自由基产生物的浓度，取相应浓度的苯五甲酸溶液至待测体系中实现羟基自由基的充分捕捉，以准确定量检测。

有益效果

（1）可实现任何体系(pH≥5)如等离子体处理体系、双氧水漂白工艺体系、标准体系如Fenton体系中HO^·的准确定量检测。有助于探究纺织化学、环境化学、制浆造纸等产生HO^·工艺体系的机理，从而更好地指导生态生产工艺；

（2）苯五甲酸对捕捉HO^·具有高选择性，并且生成结构确定的唯一产物羟基苯五甲酸，使定量检测更准确；

（3）即使在高温碱性条件下，苯五甲酸捕捉HO^·后产生的羟基化产物稳定性高，多次平行试验重现性高，灵敏度较高；

（4）荧光检测易于实现，操作简单快速。

附图说明

图1是羟基自由基浓度(0.00414～0.4923μmol/L)与荧光强度的线性关系

图2是羟基自由基浓度(0.4923～5.52μmol/L)与荧光强度的线性关系

图3、4是苯五甲酸捕捉Fenton体系中产生的HO^·前后荧光光谱

图5～8是介质阻挡放电等离子体处理染料模拟废水产生的HO^·量及其对应的脱色率

图9是苯五甲酸捕捉类Fenton体系产生的HO^·前后荧光光谱

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下面结合实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1：Fenton体系(Fe²⁺/H₂O₂)是典型的产生HO^·的标准体系，本实施例采用苯五甲酸检测了Fenton体系中产生HO^·的情况。将捕捉剂苯五甲酸加入Fenton体系中，其中苯五甲酸溶液(20μmol/L)，Fe(II)(8μmol/L)，H₂O₂(6.6μmol/L)，磷酸盐缓冲液(0.02mol/L,pH7.4)。将待测体系于室温下反应30min后，调节待测体系pH为9，检测苯五甲酸捕捉Fenton体系产生的HO^·前后荧光光谱如图3所示。图3中，曲线1、2分别为苯五甲酸/H₂O₂体系和苯五甲酸/Fe²⁺体系，在435nm处几乎无荧光信号，曲线3为苯五甲酸/Fe²⁺/H₂O₂体系，在435nm处荧光信号明显提高，说明室温下仅含有苯五甲酸/Fe²⁺或苯五甲酸/H₂O₂的体系中无HO^·生成，而Fe²⁺/H₂O₂体系中产生了0.3337μmol/LHO^·，由此可得，苯五甲酸可以选择性捕捉HO^·，并可通过测定荧光强度实现HO^·准确定量检测。

实施例2：将捕捉剂苯五甲酸加入Fenton体系中，其中苯五甲酸溶液(1μmol/L)，Fe(II)(8μmol/L)，H₂O₂(1μmol/L)，硼酸盐缓冲液(0.02mol/L,pH7.4)。将待测体系于室温下反应30min后，调节待测体系pH为10，检测苯五甲酸捕捉Fenton体系产生的HO^·前后荧光光谱如图4所示。图4中，曲线1为苯五甲酸/Fe²⁺体系，在435nm处几乎无荧光信号，曲线2为苯五甲酸/Fe²⁺/H₂O₂体系，其荧光强度增大，此时体系中产生了0.01540μmol/LHO^·。

实施例3：将捕捉剂苯五甲酸加入介质阻挡放电等离子体处理废水体系中，其中苯五甲酸溶液(300μmol/L)，磷酸盐缓冲液(0.02mol/L,pH5.0)。本发明采用CTP-2000K型DBD等离子体发生装置放电，电压100V，放电间隙为6mm，处理待测体系不同时间，调节待测体系pH为9.6，分别检测处理不同时间后待测体系的荧光强度，如图5中小图所示。随着等离子体处理时间的延长，待测体系中产生的HO^·量随之增大，在处理时间超过8min后，待测体系中捕捉HO^·反应趋于平衡。

实施例4：将捕捉剂苯五甲酸加入介质阻挡放电等离子体处理废水体系中，其中苯五甲酸溶液(400μmol/L)，磷酸盐缓冲液(0.02mol/L,pH7.4)。采用CTP-2000K型DBD等离子体发生装置放电，电压100V，放电间隙为6mm，处理待测体系不同时间，调节待测体系pH为9.8，分别检测处理不同时间后待测体系的荧光强度，如图6中小图所示。以酸性黄117(0.1g/L）模拟染料废水，其他条件同上，但不含有苯五甲酸溶液，采用介质阻挡放电等离子体处理后，得到不同时间内酸性黄117脱色率及对应的HO^·产生量如图6所示。图6中，随着等离子体处理时间的延长，待测体系中产生的HO^·量增大（曲线1），HO^·的强氧化性可降解染料中不饱和共轭发色基团，形成各种小分子物质甚至将其氧化为二氧化碳。因此酸性黄117脱色率（曲线2）随HO^·浓度的增加迅速增大，在5min时可达到80%。

实施例5：将捕捉剂苯五甲酸加入介质阻挡放电等离子体处理废水体系中，其中苯五甲酸溶液(0.2mol/L），硼酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH8.4）。采用CTP-2000K型DBD等离子体发生装置放电，电压100V，放电间隙为6mm，处理待测体系不同时间，调节待测体系pH为9.3，分别检测处理不同时间后待测体系的荧光强度，如图7中小图所示。以酸性红249模拟染料废水，其他条件同上，但不含有苯五甲酸溶液，采用介质阻挡放电等离子体处理后，得到不同时间内酸性红249脱色率及对应的HO^·产生量如图7所示。酸性红249脱色率（曲线2）随HO^·浓度（曲线1）的增加也迅速增大，在5min时可达到75%。

实施例6：将捕捉剂苯五甲酸加入介质阻挡放电等离子体处理废水体系中，其中苯五甲酸溶液(350μmol/L），KOH溶液(1mmol/L）。采用CTP-2000K型DBD等离子体发生装置放电，电压100V，放电间隙为6mm，处理待测体系不同时间，调节待测体系pH为9.5，分别检测处理不同时间后待测体系的荧光强度，如图8中小图所示。分别以酸性黄117、酸性红249模拟染料废水，其他条件同上，但不含有苯五甲酸溶液，采用介质阻挡放电等离子体处理后，得到不同时间内酸性黄117、酸性红249脱色率及对应的HO^·产生量如图8所示，酸性黄117（曲线2）、酸性红249（曲线3）脱色率随HO^·浓度的增加（曲线1）都迅速增大，且酸性黄117比酸性红249脱色率稍高。

实施例7：将捕捉剂苯五甲酸加入类Fenton体系(Co²⁺/H₂O₂）中，其中苯五甲酸溶液600μmol/L,Co(II)120μmol/L,H₂O₂550μmol/L，磷酸盐缓冲液(0.02mol/L,pH6.5），将待测体系分别于室温、98℃下反应40min后，冷却至室温，调节待测体系pH为9.2，检测到苯五甲酸捕捉类Fenton体系产生的HO^·前后荧光光谱如图9所示。曲线1为苯五甲酸/Co²⁺空白体系，在435nm处无荧光信号，说明空白体系中无HO^·生成，而加入H₂O₂后的待测体系在室温下产生了0.08730μmol/LHO^·（曲线2所示），在98℃下产生了0.1459μmol/LHO^·（曲线3），说明温度也可促进HO^·的产生。

Claims (9)

1.一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征是：所述方法的荧光探针为苯五甲酸，其分子结构式为

2.根据权利要求1所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征在于，具体步骤为：将捕捉剂苯五甲酸加入待测体系中，使其摩尔浓度为羟基自由基产生物摩尔浓度的1倍及1倍以上；捕捉反应结束后调节待测体系pH为9～10；检测待测体系的荧光强度，根据荧光强度与羟基苯五甲酸浓度的线性关系及羟基自由基与羟基苯五甲酸的一一对应关系，由荧光强度计算出此时待测体系中羟基自由基的产生量。

3.根据权利要求2所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征在于，所述苯五甲酸加入待测体系中的摩尔浓度为羟基自由基产生物摩尔浓度的1～3倍。

4.根据权利要求2所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征在于，所述待测体系的温度范围为20～98℃，pH≥5。

5.根据权利要求2所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征在于，所述的检测荧光强度是采用荧光分光光度计。

6.根据权利要求5所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征在于，所述荧光分光光度计的型号为F-7000。

7.根据权利要求2所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征在于，所述苯五甲酸溶于缓冲液或碱性溶液形成苯五甲酸溶液后加入到待测体系中。

8.根据权利要求7所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐或硼酸盐溶液；所述碱性溶液为NaOH或KOH溶液。

9.根据权利要求7所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征在于，所述的苯五甲酸溶液中苯五甲酸的浓度为10^-6～0.2mol/L。