CN103146496B - 一种微生物洗涤剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物洗涤剂的制备方法，属于微生物发酵领域。本发明制备方法包括如下步骤首先对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)进行发酵得到鼠李糖脂发酵液，用酸析法，得鼠李糖脂提取物；其次对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行发酵得到枯草芽孢杆菌发酵液，去除菌体，得抗菌脂肽发酵液；最后向抗菌脂肽发酵液中添加鼠李糖脂提取物、蔗糖脂肪酸酯、10000U/g生物脂肪酶和乙二胺四乙酸二钠，即得微生物洗涤剂成品。本发明提出的制备方法工艺简单、低碳、环保、无二次污染，洗涤剂本身可被完全降解；同时在组分中添加了极少量的脂肪酶等酶制剂，增强该餐具洗涤剂洗涤效果和效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，尤其是涉及一种微生物洗涤剂的制备方法。
背景技术
餐具洗涤剂是日常消费性用品，而且与我们的生活、健康息息相关。随着人们对食品安全意识的逐渐加强，餐具洗涤剂也被赋予了新的要求。人们已不仅仅满足于清洁不残留的最低要求，更需要环保安全，迅速分解油腻，快速去污、除菌，洗后洁白光亮如新等。
作为主力军的化学合成洗涤剂，其主要成分为以石油为原料化学合成而来表面活性剂，化学合成的表面活性剂在生产和使用过程中常常会带来严重的环境污染问题。据报道，一些疾病的发生，也可能与长期使用（化学合成）洗涤剂有一定的关系。此外，目前市售的洗涤剂中也越来越多的添加一些酶类物质，但受本身化学物质多的影响，不能解决环保、低碳、安全的弊端。
与此形成对比的是以生物表面活性剂为主要原料的生物洗涤剂，它在整个洗涤剂家族中成为后起之秀。生物表面活性剂是微生物或植物在一定条件下培养时，分泌出的具有一定表面活性的代谢产物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外，还拥有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等优点，其主要表现为以下优点：①选择性广，对环境友好；②庞大而复杂的化学结构使得表面活性和乳化能力更强；③分子结构类型多样，具有许多特殊的官能团，专一性强；④原料在自然界广泛存在且价廉；⑤发酵生产是典型的“绿色”工艺等。而一些微生物，如枯草芽孢杆菌，已有报道显示其既可以发酵生产蛋白酶、淀粉酶，又可以生产兼具良好表面活性物和抗菌功能的抗菌脂肽。
目前市售的生物表面活性剂存在的成本较高（主要是发酵后期提纯等工艺成本较高），难于推广等问题，亟需开发成本低、效果好、易于推广的生物表面活性剂本发明利用高效的微生物表面活性剂（糖脂为主要原料），结合极少量的特异微生物酶制剂生产安全、环保、工艺简单、成本较低和适应范围广的微生物餐具洗涤剂生产方法鲜见有报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的问题是提出一种微生物洗涤剂的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种微生物洗涤剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a）：鼠李糖脂提取物：对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)进行发酵得到鼠李糖脂发酵液，去除菌体，用酸析法，得鼠李糖脂提取物；
b）：抗菌脂肽发酵液的制备：对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行发酵得到枯草芽孢杆菌发酵液，去除菌体，得到抗菌脂肽发酵液；
c）：向所述抗菌脂肽发酵液中添加所述鼠李糖脂提取物、蔗糖脂肪酸酯、10000U/g生物脂肪酶和乙二胺四乙酸二钠，即得微生物洗涤剂成品。
优选地，所述步骤c中，鼠李糖脂提取物为5～15份，蔗糖脂肪酸酯1～10份，10000U/g生物脂肪酶0.01～0.05份，乙二胺四乙酸二钠0.5～1.5份。
优选地，所述步骤a中铜绿假单胞菌菌株活化培养基为牛肉膏2～4g，蛋白胨5～6g，NaCl5～6g，琼脂15～20g/L，pH7.0，培养条件为30～40℃，静置于培养箱内培养24～36h。
优选地，所述步骤a中铜绿假单胞菌的发酵培养基为大豆油5～7g/L，葵花籽油3～4g/L，NaNO30.5～0.6g/L，KH2PO40.05～0.1g/L，Na2HPO4·12H2O0.05～0.1g/L，MgSO4·7H2O0.005～0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01～0.02g/L，酵母膏0.01～0.02g/L，pH6.5～7.5，发酵罐的培养条件为接种量3～10%，搅拌速度200～300r/min，通气比0.2～1.0vvm，温度30～37℃，pH6.0～7.0，培养70～100h。
优选地，所述步骤b中枯草芽孢杆菌的发酵培养基为：葡萄糖1.8～2.0g/L，L-谷氨酸钠0.4～0.6g/L，MgSO40.04～0.06g/L，KCl0.04～0.06g/L，KH2PO40.08～0.1g/L，CuSO40.1～0.2mg/L，FeSO40.1～0.2mg/L，MnSO44.0～6.0mg/L，pH6.5～7.0，培养条件为接种量3～10%，搅拌速度200～300r/min，通气比0.2～1.0vvm，温度28～35℃，pH6.0～7.0，培养48～72h。
本发明的有益效果是：
1、本产品属于生物类产品，具安全性和可操作性，符合人们对饮食安全性的要求；
2、配方中的抗菌脂肽既是优良的生物表面活性剂，又具备抗菌活性等特点，这使其成为洗涤剂重要组分的同时，又充当了洗涤剂中的防腐剂、餐具防菌剂等重要角色；
3、产品的发酵后期没有进行复杂、昂贵的提纯工艺，既节约资源、降低生产成本，又最大限度的保留了微生物复杂的代谢产物，比如枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶、淀粉酶等酶类物质，这对洗涤效率和洗涤后废液的降解都有很好的促进作用；
4、在组分中，添加了极少量的脂肪酶等酶制剂，增强了洗涤的效果和效率；
5、本发明生产工艺简单，成本较低，低碳、环保，无二次污染，且洗涤剂本身可被完全降解。
具体实施方式
本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种微生物洗涤剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a）：鼠李糖脂提取物的制备：对铜绿假单胞菌进行发酵得到鼠李糖脂发酵液，用酸析法，去除菌体，得鼠李糖脂提取物；
b）：抗菌脂肽发酵液的制备：对枯草芽孢杆菌进行发酵得到枯草芽孢杆菌发酵液，去除菌体，得到抗菌脂肽发酵液；
c）：向抗菌脂肽发酵液中添加鼠李糖脂提取物、蔗糖脂肪酸酯、10000U/g生物脂肪酶和乙二胺四乙酸二钠，即得微生物洗涤剂成品。
步骤a中具体操作步骤为：通过对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)进行活化、种子罐到发酵罐的三级培养，制备鼠李糖脂发酵液，去除菌体后，利用酸析法，得到鼠李糖脂提取物。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)购自中国微生物菌种保藏中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No：4002。在本发明中，铜绿假单胞菌为常见的菌种，其有很多种，本发明人从中国微生物菌种保藏中心（CGMCC）购得多种铜绿假单胞菌，以本实施例中保藏编号为CGMCC No：4002的铜绿假单胞菌制得微生物洗涤剂性能最为优异。
将铜绿假单胞菌菌株保藏在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，在本实施例中培养基成分为：牛肉膏2g，蛋白胨5g，NaCl5g，琼脂15g/L，pH7.0，培养条件为温度30℃，静置于培养箱内培养16h。该菌株具有较强的生物表面活性剂生产能力。
经在培养箱内培养16h后，以3%的接种量接种至种子培养基中，种子培养基成分为：蔗糖4.0g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母膏0.1g/L，NaCl0.1g/L，pH7.0，种子罐的发酵条件为搅拌速度150r/min，通气比0.2vvm，温度35℃，pH6.5，培养18h。其中vvm是指每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值，发酵罐中的通气量一般以vvm计，其中的气体体积以标准状态计。
经过种子罐培养18h后，以5%的接种量接种至发酵罐培养基中，发酵罐培养基成分为：大豆油5g/L，葵花籽油3g/L，NaNO30.5g/L，KH2PO40.05g/L，Na2HPO4·12H2O0.05g/L，MgSO4·7H2O0.005g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，酵母膏0.01g/L，pH6.5，培养条件为：搅拌速度200r/min，通气比0.2vvm，温度30℃，pH6.5，培养70h。
去除菌体后，利用酸析法，得到鼠李糖脂提取物。
在本发明中，酸析法是指通过调整发酵液的pH值，如将pH调整到2.0，使得发酵液中某些特定产物析出的方法。其具体步骤：1、将发酵液通过活性炭，去除有色物、蛋白等杂质；2、将发酵液pH调制2.0，析出鼠李糖脂；3、离心获得沉淀物。
步骤b中具体操作步骤为：通过对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行活化、种子罐到发酵罐的三级培养，制备枯草芽孢杆菌发酵液，去除菌体后，制得抗菌脂肽发酵液。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)购自中国微生物菌种保藏中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No：2283。在本发明中，枯草芽孢杆菌为常见的菌种，其有很多种，本发明人从中国微生物菌种保藏中心（CGMCC）购得多种铜绿假单胞菌，以本实施例中保藏编号为CGMCC No：2283的铜绿假单胞菌制得微生物洗涤剂性能最为优异。
将枯草芽孢杆菌菌株保藏在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，在本实施例中培养基成分为：牛肉膏2g，蛋白胨5g，NaCl5g，琼脂15g/L，pH7.0，培养条件为温度30℃，静置于培养箱内培养18h。
经在培养箱内培养18h后，以3%的接种量接种至种子培养基中，种子培养基成分为：葡萄糖8.0g/L，蛋白胨5g/L，Na2HPO41.5g/L，NaH2PO41.5g/L，NaCl0.1g/L，pH6.5，种子罐发酵条件为搅拌速度150r/min，通气比0.2vvm，温度28℃，pH7.0，培养18h。
经过种子罐培养18h后，以5%的接种量接种至发酵罐培养基中，发酵罐培养基成分为：葡萄糖1.8g/L，L-谷氨酸钠0.4g/L，MgSO40.04g/L，KCl0.04g/L，KH2PO40.08g/L，CuSO40.1mg/L，FeSO40.1mg/L，MnSO44.0mg/L，pH6.5，发酵罐培养条件为搅拌速度200r/min，通气比0.2vvm，温度28℃，pH6.0，培养72h。
步骤c具体操作步骤为在抗菌脂肽发酵液中添加鼠李糖脂提取物5～15份，蔗糖脂肪酸酯（C14～C18）1～10份，10000U/g生物脂肪酶0.05～0.5份，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na）0.5～1.5份，即得微生物洗涤剂成品；在本实施例中优选各个组分添加量为鼠李糖脂提取物10份、蔗糖脂肪酸酯2份、10000U/g生物脂肪酶0.1份，50000U/gα-淀粉酶0.05份，EDTA-Na0.5份，即得微生物洗涤剂成品。在本步骤中，鼠李糖脂提取物和蔗糖脂肪酸酯均为表面活性剂，生物脂肪酶为催化剂，EDTA-Na为螯合剂。
步骤c反应在室温下进行即可，最后得到的微生物洗涤剂为无色液体。此反应过程要求试验条件不苛刻，适于大规模生产和推广。
实施例2
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤a中，菌株活化培养基成分为：牛肉膏3g，蛋白胨6g，NaCl6g，琼脂20g/L，pH7.0，菌株活化的培养条件为温度35℃，静置于培养箱内培养24h；
经在培养箱内培养24h后，以5%的接种量接种至种子培养基中，种子培养基成分为：蔗糖5.0g/L，蛋白胨0.6g/L，酵母膏0.15g/L，NaCl0.15g/L，pH7.0，种子罐发酵条件为搅拌速度180r/min，通气比0.75vvm，温度37℃，pH7.0，培养24h。
经过种子罐培养24h后，以10%的接种量接种至发酵罐中，发酵罐培养基成分为：大豆油6g/L，葵花籽油3g/L，NaNO30.6g/L，KH2PO40.075g/L，Na2HPO4·12H2O0.08g/L，MgSO4·7H2O0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，酵母膏0.01g/L，pH7.0，发酵罐培养条件为搅拌速度250r/min，通气比0.8vvm，温度35℃，pH6.0，培养80h。
步骤b中，菌株活化培养基成分为：牛肉膏3g，蛋白胨6g，NaCl5g，琼脂18g/L，pH7.0，活化菌株培养条件为温度35℃，静置于培养箱内培养24h；
经在培养箱内培养24h后，以5%的接种量接种至种子培养基中，种子培养基成分为：葡萄糖9.0g/L，蛋白胨8g/L，Na2HPO41.5g/L，NaH2PO41.5g/L，NaCl0.2g/L，pH6.5；种子罐发酵条件为搅拌速度180r/min，通气比1vvm，温度28℃，pH7.0，培养24h。
经过种子培养罐培养24h后，以10%的接种量接种至发酵罐中，发酵罐培养基成分为：葡萄糖2.0g/L，L-谷氨酸钠0.5g/L，MgSO40.05g/L，KCl0.05g/L，KH2PO40.09g/L，CuSO40.1mg/L，FeSO40.1mg/L，MnSO45.0mg/L，pH6.5，发酵罐培养条件为搅拌速度250r/min，通气比0.8vvm，温度30℃，pH6.5，培养60h。
步骤c中各组分的添加量为鼠李糖脂提取物8份，蔗糖脂肪酸酯2.5份，10000U/g生物脂肪酶0.2份，EDTA-Na0.8份，即得微生物洗涤剂成品。
实施例3
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤a中，菌株活化培养基成分为：牛肉膏4g，蛋白胨5g，NaCl5g，琼脂15g/L，pH7.0，活化菌株培养条件为温度37℃，静置于培养箱内培养24h。
经在培养箱内培养24h后，以5%的接种量接种至种子培养基中，种子培养基成分为：蔗糖4.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母膏0.1g/L，NaCl0.1g/L，pH7.0，种子罐发酵条件为搅拌速度250r/min，通气比1.0vvm，温度37℃，pH7.0，培养18h。
经过种子培养罐培养24h后，以8%的接种量接种至发酵罐中，发酵罐培养基成分为：大豆油7g/L，葵花籽油4g/L，NaNO30.55g/L，KH2PO40.1g/L，Na2HPO4·12H2O0.1g/L，MgSO4·7H2O0.01g/L，FeSO4·7H2O0.02g/L，酵母膏0.02g/L，pH7.0，发酵罐培养条件为搅拌速度300r/min，通气比0.8vvm，温度37℃，pH7.0，培养100h。
步骤b中，菌株活化培养基成分为：牛肉膏4g，蛋白胨5g，NaCl5g，琼脂20g/L，pH7.0，培养条件为温度37℃，静置于培养箱内培养24h。
经在培养箱内培养24h后，以5%的接种量接种至种子培养基中，种子培养基成分为：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨8g/L，Na2HPO42g/L，NaH2PO42g/L，NaCl0.2g/L，pH6.5，种子罐发酵条件为搅拌速度180r/min，通气比1.0vvm，温度34℃，pH7.0，培养18h。
经过种子培养罐培养24h后，以10%的接种量接种至发酵罐中，发酵罐培养基成分为：葡萄糖1.8g/L，L-谷氨酸钠0.5g/L，MgSO40.05g/L，KCl0.05g/L，KH2PO40.1g/L，CuSO40.2mg/L，FeSO40.2mg/L，MnSO45.0mg/L，pH7.0，发酵罐培养条件为搅拌速度300r/min，通气比1.0vvm，温度35℃，pH7.0，培养48h。
步骤c中各组分的添加量为鼠李糖脂提取物6份，蔗糖脂肪酸酯3份，10000U/g生物脂肪酶0.4份，EDTA-Na1.0份，即得微生物洗涤剂成品。
实施例4
与实施例2相同，不同之处在于：
步骤c中各组分的添加量为鼠李糖脂提取物5份，蔗糖脂肪酸酯1份，10000U/g生物脂肪酶0.05份，EDTA-Na0.5份，即得微生物洗涤剂成品。
实施例5
与实施例2相同，不同之处在于：
步骤c中各组分的添加量为鼠李糖脂提取物15份，蔗糖脂肪酸酯10份，10000U/g生物脂肪酶0.5份，EDTA-Na1.5份，即得微生物洗涤剂成品。
实施例6
对实施例1～5制得微生物洗涤剂测试其去油效率。
具体操作步骤为：以牛油:猪油:植物油=1:1:2的比例配置成混合油，并加入其总质量5%的单硬脂酸甘油酯，180℃加热10min后，边搅拌，边冷却，作为人工污垢。准备大小一致的碗碟50个，分成5组，编号为1#、2#、3#、4#和5#，洗净后晾干，称重，记录初始重量m0待用。25℃下，将混合油油温加热至45℃左右，取1g左右，倒入50个碗碟中，尽量使其分布均匀，室温晾置2h，称重，记录重量m1。在去污机中，准备洗涤用水，30℃下，浸泡1min，分别洗涤1、2、3、4、5、6min后，取出碗碟，并晾干3小时，称重，记录重量m2。
以本发明实施例1～5为试验组，比较去油效率，其具体计算公式为：
表1为实施例1～5制得微生物洗涤剂，在不同洗涤时间条件下去油效率对比表，见表1。
表1
由表1可以看出，实施例2制得微生物洗涤剂去油效率相对其他实施例来说最高，此实施例为最佳实施例。
实施例7
不同洗涤时间条件下，将实施例2制得微生物洗涤剂与现有市售餐具洗涤剂去油效率做对比，其具体操作步骤为：以牛油:猪油:植物油=1:1:2的比例配置成混合油，并加入其总质量5%的单硬脂酸甘油酯，180℃加热10min后，边搅拌，边冷却，作为人工污垢。准备大小一致的碗碟30个，分成3组，洗净后晾干，称重，记录初始重量m0待用。25℃下，将混合油油温加热至45℃左右，取1g左右，倒入30个碗碟中，尽量使其分布均匀，室温晾置2h，称重，记录重量m1。在去污机中，准备洗涤用水，30℃下，浸泡1min，分别洗涤1、2、3、4、5、6min后，取出碗碟，并晾干3小时，称重，记录重量m2。以实施例2制得微生物洗涤剂为试验组，市售餐具洗涤剂为对照组，在本实施例中对照组1洗涤剂选取市售雕牌洗洁精，对照组2洗涤剂选取市售多益得生物酵素，比较去油效率，其具体计算公式为：
表2为试验组、对照组1和对照组2，在不同洗涤时间条件下去油效率对比表，见表2。
表2
由表2可以看出，实施例2制得微生物洗涤剂的去油效率明显高于两种市售餐具洗涤剂。
实施例8
不同温度下，实施例2制得微生物洗涤剂与市售餐具洗涤剂去油效果的对比。
具体操作步骤为：以牛油:猪油:植物油=1:1:2的比例配置成混合油，并加入其总质量5%的单硬脂酸甘油酯，180℃加热10min后，边搅拌，边冷却，作为人工污垢。取大小相似的餐碟，洗净、晾干后，每个餐碟内滴入混合油1ml，涂抹均匀后，置于盛有总质量0.5%洗涤液的池中，浸泡5min，过清水，比较不同温度下，油渍去除情况，以市售普通餐具洗涤剂为对照组1，市售生物餐具洗涤剂为对照组2，在本实施例中对照组1洗涤剂选取市售雕牌洗洁精，对照组2洗涤剂选取市售多益得生物酵素，实施例2制得微生物洗涤剂为试验组，表3为不同温度下，试验组与对照组1、对照组2去油效果对比表，见表3。（备注：“-”表示清水冲洗后仍出现油斑；“+”表示清水冲洗后无油斑；“+”、“-”同时出现，说明有的碗碟洗净了，有的仍有油斑。）
表3
由表3可以看出，在20℃以上，实施例2制得微生物洗涤剂的洗涤效果与对照组1和对照组的洗涤效果相当，但在5～20℃，实施例2制得微生物洗涤剂对植物油的洗涤效果优于对照组1和对照组2。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种微生物洗涤剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)：鼠李糖脂提取物：对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)进行发酵得到鼠李糖脂发酵液，去除菌体，用酸析法，得鼠李糖脂提取物；
b)：抗菌脂肽发酵液的制备：对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行发酵得到枯草芽孢杆菌发酵液，去除菌体，得到抗菌脂肽发酵液；
c)：向所述抗菌脂肽发酵液中添加所述鼠李糖脂提取物、蔗糖脂肪酸酯、10000U/g生物脂肪酶和乙二胺四乙酸二钠，即得微生物洗涤剂成品，其中，鼠李糖脂提取物为5～15份，蔗糖脂肪酸酯1～10份，10000U/g生物脂肪酶0.01～0.05份，乙二胺四乙酸二钠0.5～1.5份。
2.如权利要求1所述的微生物洗涤剂的制备方法，其特征在于：所述步骤a中铜绿假单胞菌的发酵培养基为大豆油5～7g/L，葵花籽油3～4g/L，NaNO30.5～0.6g/L，KH2PO40.05～0.1g/L，Na2HPO4·12H2O0.05～0.1g/L，MgSO4·7H2O0.005～0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01～0.02g/L，酵母膏0.01～0.02g/L，pH6.5～7.5，发酵罐的培养条件为接种量3～10％，搅拌速度200～300r/min，通气比0.2～1.0vvm，温度30～37℃，pH6.0～7.0，培养70～100h。
3.如权利要求1所述的微生物洗涤剂的制备方法，其特征在于：所述步骤b中枯草芽孢杆菌的发酵培养基为：葡萄糖1.8～2.0g/L，L-谷氨酸钠0.4～0.6g/L，MgSO40.04～0.06g/L，KCl0.04～0.06g/L，KH2PO40.08～0.1g/L，CuSO40.1～0.2mg/L，FeSO40.1～0.2mg/L，MnSO44.0～6.0mg/L，pH6.5～7.0，培养条件为接种量3～10％，搅拌速度200～300r/min，通气比0.2～1.0vvm，温度28～35℃，pH6.0～7.0，培养48～72h。
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