CN103145968A - 叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯及其制备方法与应用 - Google Patents
叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯及其制备方法和应用，所述叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯结构式如下所示，其中n=45～136。所述叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的制备方法包括以下步骤：称取叶酸和三乙胺，加入二甲亚砜溶解，加入二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，避光室温搅拌，过夜，过滤除去副产物；然后加入聚乙二醇单硬脂酸酯，加热溶解，反应过夜，获得粗品；将其置于透析袋中，用水透析，冻干即得叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯。所述叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯可应用于制备叶酸修饰的纳米载体抗肿瘤给药系统，提高药物的靶向性和疗效，改善药动学行为，降低毒性。
Description
（一）技术领域
本发明涉及叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯及其制备方法和在制备叶酸修饰的脂质体、聚合物纳米粒或固体脂质体纳米粒等纳米药物载体以及负载抗肿瘤药物的叶酸修饰的脂质体、聚合物纳米粒或固体脂质体纳米粒等纳米制剂中的应用。
（二）背景技术
肿瘤一直是直接威胁人类健康的重大疾病，肿瘤化疗由于药物本身缺乏分子靶向性，因而出现治愈率低、毒副作用巨大等重大治疗问题。通过合适的载体技术，将药物直接靶向病变组织（器官）、细胞是解决癌症化疗治愈率低和毒副作用的重要手段之一。目前国内外的科学家通过载体技术在肿瘤药物的组成（器官）和细胞靶向上取得了一定的进展，但并没有取得突破性的疗效，其本质在于绝大多数抗肿瘤药物的分子作用靶点位于细胞内，因此肿瘤细胞内药物分子作用靶点（亚细胞器）靶向性载体材料技术的研究开发是突破癌症化疗瓶颈的关键。
靶向载体的设计主要包括载体的病灶脏器靶向性，以及在此基础上穿越病灶脏器内的病灶细胞靶向，从而完成针对药物分子靶标的亚细胞器靶向。早期的组织器官靶向，利用微粒的小粒径被动靶向到肝等组织，通过“增强的透过及滞留效应”聚集到肿瘤组织等。当前，研究者利用肿瘤细胞表面某些受体（如叶酸受体）过度表达的特性，将配体修饰载体材料成功应用于肿瘤的靶向治疗，从而达到肿瘤细胞的靶向，提高细胞内的抗肿瘤药物浓度，增强抗肿瘤药物本身的疗效。脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒是极具发展潜力的靶向控释给药系统。但这些载体本身并不具备肿瘤组织和细胞的主动靶向功能。如果使用在肿瘤细胞表面有过度表达的某些受体的配体对该类载体进行修饰，将大大提高这些载体在抗肿瘤靶向治疗中的应用可能性。而使用这些载体对叶酸进行简单的物理包封，一方面在体内转动过程中会产生叶酸的大量渗漏，另一方面也有可能被包裹于载体材料内部或分布载体当中，从而影响叶酸的肿瘤细胞靶向效果。而将叶酸修饰在载体材料的表面，可避免出现这些现象。
（三）发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新的叶酸修饰物——叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯，该化合物生物相容性好，可直接作为靶向修饰物应用于制备脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒等纳米药物载体或负载抗肿瘤药物的叶酸修饰的脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒等纳米制剂，提高靶向性和药物疗效，降低毒性。
本发明的第二个目的是提供一种制备所述叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的方法，该方法原料来源简单并已广泛商业化，合成方便，适宜工业化大生产。
本发明的第三个目的是提供所述叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯在制备叶酸修饰的脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒等纳米药物载体以及负载抗肿瘤药物的叶酸修饰的脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒等纳米制剂中的应用，可作为靶向修饰物提高药物的靶向性和疗效，降低毒性。
下面对本发明的技术方案做具体说明。
本发明提供了一种叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯，其结构式为：
其中，n=45～136。
本发明也提供了所述叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的制备方法，所述叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯是由叶酸的羧基与聚乙二醇单硬脂酸酯的游离羟基耦合反应合成得到，具体包括如下步骤：
称取叶酸和三乙胺，加入二甲亚砜（DMSO）溶解，加入二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），避光室温搅拌，过夜，过滤除去副产物；然后加入聚乙二醇单硬脂酸酯，加热溶解，反应过夜，获得粗品；将其置于透析袋中，用水透析，冻干即得叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯。
本发明中，叶酸：二环己基碳二亚胺（DCC）：N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）：聚乙二醇单硬脂酸酯的质量比例为2～8：2～8：1～4：20～80，优选为5：6：2.6：50。三乙胺的体积用量以叶酸的质量计为0.5～2：1 mL/g，优选为1：1 mL/g。
作为优选，所述制备方法为：叶酸：二环己基碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺：聚乙二醇单硬脂酸酯的投料质量比例为5：6：2.6：50，三乙胺体积用量以叶酸的质量计为1 mL/g；精密称取叶酸和三乙胺，用DMSO溶解，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，避光室温搅拌，过夜，过滤除去副产物；然后加入聚乙二醇单硬脂酸酯，加热至35℃溶解，35℃反应过夜，获得粗品；将其倒入分子截留量为3500的透析袋中，置于装满水的烧杯中，搅拌，透析，冻干即得叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯。
本发明所述的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯可作为靶向修饰物用于制备叶酸修饰的脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒等纳米药物载体以及负载抗肿瘤药物的叶酸修饰的脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质体纳米粒等纳米制剂。
具体而言，本发明利用所述的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯制备得到了一种奥沙利铂叶酸靶向脂质体，与奥沙利铂注射液相比，血浆峰浓度提高了86%，血浆AUC提高了485%，消除率减少，药动学行为明显改善；靶向性明显增强（提高了123%），抑瘤效果明显增强。
本发明的有益效果是：
（1）本发明通过叶酸与聚乙二醇单硬脂酸酯耦合，合成具有全新化学结构的叶酸修饰物，该修饰物中的烷基链与载体材料具有良好的亲和性，可用于制备叶酸修饰的纳米载体给药系统，从而提高药物的抗肿瘤疗效。
（2）本发明所提供的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯通过肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体介导途径，可加速纳米载体的细胞摄取，从而提高纳米载体抗肿瘤给药系统的抗肿瘤疗效。
（3）本发明利用所述的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯制得的奥沙利铂叶酸靶向脂质体，与奥沙利铂注射液相比，血浆峰浓度提高了86%，血浆AUC提高了485%，消除率减少，药动学行为明显改善；靶向性明显增强（提高了123%），抑瘤效果明显增强。
（4）本发明中叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的制备原料来源简单并已广泛商业化，合成方便，适宜工业化大生产。
（四）附图说明
图1为聚乙二醇单硬脂酸酯的红外光谱图。
图2为叶酸的红外光谱图。
图3为实施例1所得叶酸-聚乙二醇单硬脂酸酯的红外光谱图。
图4为实施例1所得叶酸-聚乙二醇单硬脂酸酯的核磁共振氢谱图。
图5、图6为实施例2所得奥沙利铂叶酸靶向脂质体的粒径分布图。
图7为实施例2所得奥沙利铂叶酸靶向脂质体的体外释放曲线。
图8实施例2所得奥沙利铂叶酸靶向脂质体对荷瘤裸鼠相对肿瘤增殖率（T/C）的影响。
图9为实施例2所得奥沙利铂叶酸靶向脂质体的肿瘤组织药物浓度曲线图。
图10为实施例2所得奥沙利铂叶酸靶向脂质体的血浆药物浓度曲线图。
（五）具体实施方式：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
实施例1：叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的合成
精密称取叶酸0.5 g，0.5 mL三乙胺，15 mL DMSO溶解，加入0.6g二环己基碳二亚胺（DCC）、0.26 g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），避光室温搅拌，过夜，过滤除去副产物。然后加入5g 聚乙二醇（分子量4000）单硬脂酸酯，加热至35℃溶解，35℃反应过夜，获得粗品。将其倒入分子截留量为3500的透析袋中，置装满水的500 mL烧杯中，搅拌，透析两天，冻干即得。
其合成路线如下：
合成后考察叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的红外光谱和核磁共振氢谱以研究其结构。图1为聚乙二醇单硬脂酸酯红吸收外图谱，3433 cm-1处为聚乙二醇单硬脂酸酯的羟基的伸缩振动峰，2882 cm-1处为聚乙二醇单硬脂酸酯的多个CH2伸缩振动产生的强特征吸收。图2为叶酸的红外吸收图谱，3323、3418、3546 cm-1处为N-H伸缩振动峰，1695 cm-1处为νC=O吸收，1606、1570、1405为苯环的骨架伸缩振动。图3与图1相比，3433 cm-1处聚乙二醇单硬脂酸酯的羟基产生的强而宽的伸缩振动吸收峰消失，在3328 cm-1处产生N-H伸缩振动峰；图3与图2相比，在2890 cm-1处出现νC-H强吸收，因为链接的聚乙二醇单硬脂酸酯有多个CH2基团。因此从图3可以初步确定叶酸-聚乙二醇单硬脂酸酯已经合成。将叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯溶于氘代二甲亚砜(DMSO-d6)中，检测其氢谱，1HNMR核磁共振频率均为400.00MHz，见图4。1HNMR图谱数据归属：δ0.91～0.94(m，CH3)，δ2.06～2.63(m，CH2)，δ2.90～3.47(m，OCH2)，δ4.42(m，OH)，δ6.56(m，NH2)，δ6.58～7.73(m，Ar-H)，δ6.83(m，NH)，δ8.56(s，Ar-H)，δ9.85 (s，COO-H)。结合红外光谱与核磁共振氢谱结果可以基本确定叶酸-聚乙二醇单硬脂酸酯已经合成。
实施例2：奥沙利铂叶酸靶向脂质体
取磷脂4 g，胆固醇667 mg溶于二氯甲烷60 mL中，加入20 mL含80 mg 奥沙利铂的水溶液，搅拌30 min，超声20 min，40℃旋转蒸发除去有机溶剂，待凝胶塌陷后，按组分加入含叶酸-聚乙二醇单硬脂酸酯 580 mg、F68 400mg的水溶液50 mL，继续蒸发30 min，高压均质400 bar，5 min，用水定容至100 mL，然后采用切向流超滤法分离游离奥沙利铂，用分子截留量为10K的切向流膜包进行超滤，用水作为置换液体，重复超滤3次，用超滤离心管法测其包封率和高效液相色谱法测定最后药物浓度，包封率为92.15%，粒径为102 nm，奥沙利铂浓度为615.38 μg·mL-1，加水调整脂质体混悬液中药物浓度至500 μg·mL-1即得。
实施例3：实验例2所得奥沙利铂叶酸靶向脂质体的粒径、pH值考察
本研究采用激光粒度仪测定实施例2的奥沙利铂叶酸靶向脂质体的粒径及其分布，样品直接测定，其结果见图5；用水稀释100倍后，激光粒度测定仪测定样品粒径，结果见图6。样品稀释后，变异性小，粒径范围仍较窄、呈单峰分布。用pH计测得奥沙利铂叶酸靶向脂质体溶液的pH值为6.53±0.05（n=5）。
实施例4：实施例2所得奥沙利铂叶酸靶向脂质体的体外释放度实验
具体实验如下：精密量取实施例1的奥沙利铂叶酸靶向脂质体混悬液1mL，置透析袋中，两端用透析夹夹紧，加入到装有100 mL水溶液的烧杯中，在(37±0.5)℃恒温下以小杯法测定体外释药性能(100 r·min-1搅拌，间隔1h吸取透析液3 mL，然后补加3 mL水溶液)。HPLC分析，测定奥沙利铂浓度，并经浓度校正后，换算得到脂质体的释放度。取1 mL 奥沙利铂叶酸靶向脂质体混悬液，甲醇破乳，求得奥沙利铂总量。体外释放曲线见图7。体外释放曲线符合一级释放模型，释放回归方程为ln(1-Q)=-0.1653t-0.4628（R2=0.9768）。
实施例5：实施例2所得奥沙利铂叶酸靶向脂质体的药效学实验
首先进行HCT-116人结肠癌细胞株的复苏与培养，建立HCT-116人结肠癌荷瘤裸鼠模型，接种裸鼠自然生长，游标卡尺测量瘤体积，等肿瘤生长至50-75 mm3后将动物按瘤体积随机分3组，每组6只：模型对照组（尾静脉隔日注射5%葡萄糖注射液），奥沙利铂叶酸靶向脂质体组（给予奥沙利铂叶酸靶向脂质体，第一天至第八天2.5 mg/kg隔天一次，第九天至第十五天 5 mg/kg 每天一次），奥沙利铂注射液组（给予奥沙利铂注射液，第一天至第八天2.5 mg/kg隔天一次，第九天至第十五天 5 mg/kg 每天一次）。同时，各组裸鼠开始给药后使用自动读数游标卡尺测量瘤径，隔天测一次，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。根据测量的肿瘤体积结果计算出相对肿瘤体积（RTV）。抗肿瘤活性的评价指标采用相对肿瘤增殖率T/C（%）。结果发现，在移植肿瘤处于快速增长期时，给药后两组T/C均下降。在开始至第八天按2.5mg/kg隔天一次给药的情况下，第三天、第七天与第九天，靶向脂质体组与注射液组的T/C比较均没有显著性差异；在第五天，靶向脂质体的T/C与注射液组比较有显著性差异。在第十一天开始至结束，靶向脂质体的T/C与注射液组比较均有显著性差异，见图8。说明奥沙利铂叶酸靶向脂质体组与注射液组在提高剂量与增加给药次数后，抑瘤效果均增强，而靶向脂质体组增强效果比注射液组更明显，统计学上有显著性差异，提示奥沙利铂叶酸靶向脂质体抑瘤效果优于奥沙利铂注射液。
实施例6：实施例2所得奥沙利铂（OHP）叶酸靶向脂质体的靶向特性实验
以叶酸-聚乙二醇单硬脂酸酯为靶向修饰物，制备奥沙利铂叶酸靶向脂质体。再进行HCT-116人结肠癌细胞株的复苏与培养，建立HCT-116人结肠癌荷瘤裸鼠模型，接种裸鼠自然生长，游标卡尺测量瘤体积，等肿瘤生长至50-75 mm3后将动物按瘤体积随机分3组：空白对照组，用5%葡萄糖注射液，从尾静脉给药一次后取出肿瘤组织做空白对照，6只；奥沙利铂注射液组，用10 mg/kg奥沙利铂注射液，给药一次，36只；奥沙利铂叶酸靶向脂质体，用10 mg/kg奥沙利铂叶酸靶向脂质体，给药一次，36只。奥沙利铂注射液组与奥沙利铂叶酸靶向脂质体从尾静脉给药，给药后按不同时间点0.05，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，6，8，48 h处死，将裸鼠肿瘤块置-20℃冰箱保存，然后HPLC法检测药物浓度。结果发现，奥沙利铂叶酸靶向脂质体的AUC(0-48h)为62.79 μg/g*h，Cmax为8.458 μg/g。奥沙利铂注射液的AUC(0-48h)为28.099 μg/g*h，Cmax为2.016 μg/g。两组比较，奥沙利铂叶酸靶向脂质体的靶向效率（Re）为2.23，峰浓度比（Ce）为4.20。肿瘤组织药物浓度曲线见图9。与奥沙利铂注射液相比，奥沙利铂叶酸靶向脂质体的靶向性明显增强，提高了123%；峰浓度显著提高，提高了320%，说明叶酸-聚乙二醇单硬脂酸酯作为奥沙利铂脂质体的靶向修饰物提高了它的靶向效率。
实施例7：实施例2所得奥沙利铂（OHP）叶酸靶向脂质体的药动学实验
以叶酸-聚乙二醇单硬脂酸酯为靶向修饰物，制备奥沙利铂叶酸靶向脂质体。再进行HCT-116人结肠癌细胞株的复苏与培养，建立HCT-116人结肠癌荷瘤裸鼠模型，接种裸鼠自然生长，游标卡尺测量瘤体积，等肿瘤生长至50-75 mm3后将动物按瘤体积随机分3组：空白对照组，用5%葡萄糖注射液，从尾静脉给药一次后取出肿瘤组织做空白对照，6只；奥沙利铂注射液组，用10 mg/kg奥沙利铂注射液，给药一次，36只；奥沙利铂叶酸靶向脂质体，用10 mg/kg奥沙利铂叶酸靶向脂质体，给药一次，36只。奥沙利铂注射液组与奥沙利铂叶酸靶向脂质体从尾静脉给药，给药后按不同时间点0.05，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，6，8，48 h摘眼球采血0.5～2 mL，用抗凝管收集。离心4000 r/min，10 min，取血浆，然后HPLC法检测药物浓度。血浆药物浓度曲线见图10。结果发现，OHP叶酸靶向脂质体的AUC(0-48h)为130.278 mg/L*h，CLz为0.077 L/h/kg，Cmax为26.56 mg/L。OHP注射液的AUC(0-48h)为22.271 mg/L*h，CLz为0.448 L/h/kg，Cmax为14.297 mg/L。相对于OHP注射液来说，OHP叶酸靶向脂质体的血浆峰浓度提高了86%，AUC(0-48h)提高了485%，消除率减少，药动学行为明显改善。
Claims (7)
1.叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯，具有以下结构式：
其中，n=45～136。
2.根据权利要求1所述的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：称取叶酸和三乙胺，加入二甲亚砜溶解，加入二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，避光室温搅拌，过夜，过滤除去副产物；然后加入聚乙二醇单硬脂酸酯，加热溶解，反应过夜，获得粗品；将其置于透析袋中，用水透析，冻干即得叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯。
3.根据权利要求1所述的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的制备方法，其特征在于叶酸：二环己基碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺：聚乙二醇单硬脂酸酯的投料质量比例为2～8：2～8：1～4：20～80，三乙胺的体积用量以叶酸的质量计为0.5～2mL/g。
4.根据权利要求1所述的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的制备方法，其特征在于叶酸：二环己基碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺：聚乙二醇单硬脂酸酯的投料质量比例为5：6：2.6：50，三乙胺的体积用量以叶酸的质量计为1mL/g。
5.根据权利要求1所述的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯的制备方法，其特征在于所述的制备方法为：控制叶酸：二环己基碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺：聚乙二醇单硬脂酸酯的投料质量比例为5：6：2.6：50，三乙胺的体积用量以叶酸的质量计为1mL/g；称取叶酸和三乙胺，用DMSO溶解，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，避光室温搅拌，过夜，过滤除去副产物；然后加入聚乙二醇单硬脂酸酯，加热至35℃溶解，35℃反应过夜，获得粗品；将粗品倒入分子截留量为3500的透析袋中，置于装满水的烧杯中，搅拌，透析，冻干即 得叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯。
6.根据权利要求1所述的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯在制备叶酸修饰的脂质体、聚合物纳米粒或固体脂质体纳米粒中的应用。
7.根据权利要求1所述的叶酸偶联聚乙二醇单硬脂酸酯在制备负载抗肿瘤药物的叶酸修饰的脂质体、聚合物纳米粒或固体脂质体纳米粒中的应用。
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