CN103134793B - 高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器及其制备方法，制备步骤如下：(1)纳米二氧化钛材料的合成：硫酸钛与乙二胺四乙酸在磁力搅拌下反应制得纳米二氧化钛；(2)复合纳米材料的合成：二氧化钛纳米颗粒依次与硫化钠溶液和氯化镉溶液反应后溶于离子液体；(3)金纳米粒子的合成：柠檬酸钠溶液与氯金酸溶反应制得金纳米粒子；(4)传感器的组装：金纳米粒子滴加到ITO电极表面，置于氮气氛围内；将肿瘤细胞抗体修饰到电极的表面，置于孵育箱中备用。根据抗体上结合的癌细胞的数量与电致化学发光强度的线性变化来实现对癌细胞的检测。本发明具有操作简单、反应速度快、效果好、可再生强、选择性强、成本低的优点。

Description

高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器及其制备方法。
背景技术
癌症是威胁人类生命的重要疾病之一，而肝癌是癌症中较为常见的一种，因此如何早期检测和诊断肝癌成为全世界的研究热点之一。目前国内外的科学家利用各种方法检测癌细胞，包括ELISA法、化学发光方法、循环伏安法、融出伏安法和计时电流法等。然而，上述方法具有或者依赖于昂贵的分析仪器，或者分析检测时间长、操作繁琐等缺点。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供一种高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器及其制备方法，此传感器基于CdS/TiO2纳米复合材料制成，用于科研方面和临床医学方面，尤其是在生物分析领域，细胞、DNA的检测等方面有很强的应用前景。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器的制备方法，如下：
(1)纳米二氧化钛材料的合成：
在100mL三颈烧瓶中，将0.25-0.35g硫酸钛溶于90-100mL蒸馏水中，在磁力搅拌下，将浓度为0.025-0.05M乙二胺四乙酸10-20mL缓慢的加入到三颈瓶中待白色沉淀出现后，继续在室温反应2-2.5小时，离心，洗涤白色沉淀，60℃烘干6-6.5小时备用；以上反应除最后一步均在25℃室温条件下进行；
(2)复合纳米材料离子液体的合成：
将二氧化钛纳米颗粒超声清洗3-5分钟，并分散于超纯水中，达到浓度为5mg/mL，备用；在分散好的0.5-1mL的纳米二氧化钛材料中依次滴加浓度为0.2mol/mL的1-1.5mL的硫化钠溶液和浓度为0.2mol/mL的1-1.5mL氯化镉溶液，每次加入试剂后反应时间为3-5分钟，离心洗涤，制成复合纳米材料备用；反应过程中每次都要离心洗涤除去未反应的物质；将制备好的复合纳米材料0.05-0.1g分散到80μL-100μL的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的离子液体中，制成复合纳米材料离子液体混合物备用，使用之前需要再次超声分散均匀；以上反应均在25℃室温条件下进行；
(3)金纳米粒子的合成：
先用0.45μm的多孔滤膜将柠檬酸三钠溶液和氯金酸溶液过滤，将质量浓度为1％的1.00mL柠檬酸钠溶液与质量浓度0.01％的100mL氯金酸溶液混合于烧瓶中，100℃回流搅拌反应10分钟后，停止加热；在密封条件下，继续搅拌至恢复到25℃室温，备用；反应时间至少为2小时以上，确保得到30nm粒径分布均匀的金纳米颗粒；
(4)传感器的组装：将5-8μL复合纳米材料离子液体混合物滴加到已经清洗好的ITO电极表面，接着将制备好的金纳米粒子滴加到ITO电极表面，置于氮气氛围内；将10-5g/mL肿瘤细胞抗体5-8μL修饰到电极的表面，置于37摄氏度孵育箱中备用。
本发明还具有如下技术特征：
2、按以上方法制得的一种高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器。
通过癌细胞与抗体的特异性免疫反应，可以根据抗体上结合的癌细胞的数量与电致化学发光强度的线性变化来实现对癌细胞的检测。检测机理：与抗体结合的癌细胞的增多，会阻碍溶液中电子与电极上纳米材料之间的传递作用，即导致电极阻抗不断增加，进而使得在同样的电流激发条件下所产生的电致化学发光的光信号减弱。也就是，电极表面上结合的癌细胞的数量和电致化学发光信号降低的数值存在线性关系。依据该线性关系实现对癌细胞的高灵敏检测。
本发明的方法利用合成的纳米复合材料的电致化学发光性质，成功的组装了癌细胞的生物传感器，实现了对肝癌细胞的灵敏检测，具有操作简单、反应速度快、效果好、可再生强、选择性强、成本低等优点。该方法还通过改变修饰的抗体种类实现对多种肝癌细胞的检测，可用于科研方面和临床医学方面，尤其是在生物分析领域，细胞、DNA的检测等方面有很强的应用前景。
附图说明
图1为HepG2肝癌细胞的线性检测曲线；
图2为CEA肠癌细胞的线性检测曲线。
具体实施方式
下面结合附图举例详细说明本发明的具体实施方式。
实施例1：
基于纳米复合材料的高灵敏检测HepG2肝癌细胞的电致化学发光传感器制作方法：
(1)纳米二氧化钛材料的合成：先将0.25g硫酸钛溶于90mL蒸馏水中，在磁力搅拌下，将浓度为0.025M，10mL乙二胺四乙酸缓慢的加入到硫酸钛溶液中待白色沉淀出现后，继续反应2小时，离心，洗涤，60摄氏度烘干6小时，备用。以上反应除最后一步均是在室温25℃条件下进行的。
(2)复合纳米材料离子液体的合成：将二氧化钛纳米颗粒超声清洗5分钟，并分散于浓度为5mg/mL超纯水中，备用。在清洗好的0.5mL的二氧化钛纳米材料中依次滴加1mL浓度为0.2mol/mL的硫化钠溶液和1mL浓度为0.2mol/mL氯化镉溶液，每次加入试剂后反应时间为3分钟，离心洗涤，备用。反应过程中每次都要离心洗涤除去未反应的物质。将制备好0.05g的复合纳米材料分散到80μL的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体中，制成复合纳米材料离子液体混合物备用，使用之前再次超声分散均匀即可。以上反应均在室温25℃条件下进行的。
(3)金纳米粒子的合成：先用0.45μm的多孔滤膜将柠檬酸钠溶液和氯金酸溶液过滤，将1.00mL1％柠檬酸钠溶液与100mL0.01％氯金酸溶液混合于烧瓶中，100℃回流搅拌反应十分钟后，停止加热。在密封条件下，继续搅拌至恢复到室温25℃，备用。反应时间至少为2小时以上，确保得到粒径分布均匀的30nm左右的金纳米颗粒。
(4)生物传感器的组装：将复合纳米材料和离子液体的混合物5μL滴加到已经清洗好的ITO电极(氧化铟锡导电玻璃)表面，接着将制备好的金纳米粒子滴加到电极表面，置于氮气氛围内。将HepG2肝癌细胞对应的抗体10-5g/mL修饰到电极的表面，置于37摄氏度孵育箱中备用。
(5)对HepG2肝癌细胞的检测：通过HepG2肝癌细胞与抗体的特异性免疫反应，可以根据抗体上结合的HepG2肝癌细胞的数量与电致化学发光强度的线性变化来实现对HepG2肝癌细胞的检测。由于HepG2肝癌细胞与抗体的结合会对电极和溶液中的电子转移产生阻碍作用，使得电致化学发光信号降低，从而实现了对HepG2肝癌细胞的定量检测。
通过HepG2肝癌细胞抗体的特异性免疫反应，可以根据抗体上结合的HepG2肝癌细胞的数量与电致化学发光强度的线性变化来实现对HepG2肝癌细胞的检测。检测机理：与抗体结合的HepG2肝癌细胞的增多，会阻碍溶液中电子与电极上纳米材料之间的传递作用，即导致电极阻抗不断增加，进而使得在同样的电流激发条件下所产生的电致化学发光的光信号减弱。也就是，电极表面上结合的HepG2肝癌细胞的数量和电致化学发光信号降低的数值存在线性关系。依据该线性关系实现对HepG2肝癌细胞的高灵敏检测。
基于纳米复合材料的这种检测方法能够实现对HepG2肝癌细胞的灵敏检测，实验结果表明电致化学发光信号的强度与肝癌细胞的浓度的对数在400-10000个/mL范围内成线性关系。根据该线性关系，可以对HepG2肝癌细胞进行定量检测。(如图1所示)
实施例2
基于纳米复合材料的高灵敏检测肠癌细胞的电致化学发光传感器制作方法
(1)纳米二氧化钛材料的合成：在100mL三颈烧瓶中，将0.35g硫酸钛溶于100mL蒸馏水中，在磁力搅拌下，将浓度为0.05M，20mL EDTA缓慢的加入到三颈瓶中带白色沉淀出现后，继续在室温反应2.5小时，离心，洗涤，60℃烘干6.5小时备用。以上反应除最后一步均在室温(25℃)条件下进行的。
(2)复合纳米材料离子液体的合成：将二氧化钛纳米颗粒超声清洗5分钟，并分散于超纯水中，达到浓度为5mg/mL，备用；在分散好的1mL的纳米二氧化钛材料中依次滴加浓度为0.2mol/mL1.5mL的硫化钠溶液和浓度为0.2mol/mL的1.5mL氯化镉溶液，每次加入试剂后反应时间为5分钟，离心洗涤，制成复合纳米材料备用；反应过程中每次都要离心洗涤除去未反应的物质；将制备好的复合纳米材料0.1g分散到100μL的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的离子液体中，制成复合纳米材料离子液体混合物备用，使用之前需要再次超声分散均匀；以上反应均在25℃室温条件下进行；
(3)金纳米粒子的合成：先用0.45μm的多孔滤膜将柠檬酸钠溶液和氯金酸溶液过滤，将质量浓度为1％的1.00mL柠檬酸钠溶液与质量浓度0.01％的100mL氯金酸溶液混合于烧瓶中，100℃回流搅拌反应10分钟后，停止加热；在密封条件下，继续搅拌至恢复到25℃室温，备用；反应时间至少为2小时以上，确保得到30nm粒径分布均匀的金纳米颗粒；
(4)生物传感器的组装：将复合纳米材料和离子液体的混合物5μL滴加到已经清洗好的ITO电极(氧化铟锡导电玻璃)表面，接着将制备好的金纳米粒子滴加到电极表面，置于氮气氛围内。将肠癌CEA抗体10-5g/mL修饰到电极的表面，置于37摄氏度孵育箱中备用。
(5)对肠癌细胞的检测：通过肠癌细胞与抗体的特异性免疫反应，可以根据抗体上结合的肠癌细胞的数量与电致化学发光强度的线性变化来实现对肠癌细胞的检测。由于肠癌细胞与抗体的结合会对电极和溶液中的电子转移产生阻碍作用，使得电致化学发光信号降低，从而实现了对肠癌细胞的定量检测。
基于CdS/TiO2纳米复合材料的这种检测方法能够实现对肠癌细胞的灵敏检测，实验结果表明电致化学发光信号的强度与肠癌细胞的浓度的对数在400-10000个/mL范围内成线性关系。根据该线性关系，可以对肠癌细胞进行定量检测。(如图2所示。)
如果要改变检测肿瘤细胞的种类，则需在电极表面上修饰与目标肿瘤细胞特异性结合的对应抗体即可。

Claims (2)

1.一种高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，方法如下：
(1)纳米二氧化钛材料的合成：
在100mL三颈烧瓶中，将0.25～0.35g硫酸钛溶于90～100mL蒸馏水中，在磁力搅拌下，将浓度为0.025～0.05M乙二胺四乙酸10～20mL缓慢的加入到三颈烧瓶中待白色沉淀出现后，继续在室温反应2～2.5小时，离心，洗涤白色沉淀，60℃烘干6～6.5小时备用；以上反应除最后一步均在25℃室温条件下进行；
(2)复合纳米材料离子液体的合成：
将二氧化钛纳米颗粒超声清洗3～5分钟，并分散于超纯水中，达到浓度为5mg/mL，备用；在分散好的0.5～1mL的二氧化钛纳米颗粒中依次滴加浓度为0.2mol/mL的1～1.5mL的硫化钠溶液和浓度为0.2mol/mL的1～1.5mL氯化镉溶液，每次加入试剂后反应时间为3～5分钟，离心洗涤，制成复合纳米材料备用；反应过程中每次都要离心洗涤除去未反应的物质；将制备好的复合纳米材料0.05～0.1g分散到80μL～100μL的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的离子液体中，制成复合纳米材料离子液体混合物备用，使用之前需要再次超声分散均匀；以上反应均在25℃室温条件下进行；
(3)金纳米粒子的合成：
先用0.45μm的多孔滤膜将柠檬酸钠溶液和氯金酸溶液过滤，将质量浓度为1％的1.00mL柠檬酸钠溶液与质量浓度0.01％的100mL氯金酸溶液混合于烧瓶中，100℃回流搅拌反应10分钟后，停止加热；在密封条件下，继续搅拌至恢复到25℃室温，备用；反应时间至少为2小时以上，确保得到30nm粒径分布均匀的金纳米颗粒；
(4)传感器的组装：将5～8μL复合纳米材料离子液体混合物滴加到已经清洗好的ITO电极表面，接着将制备好的金纳米粒子滴加到ITO电极表面，置于氮气氛围内；将10-5g/mL肿瘤细胞抗体5～8μL修饰到电极的表面，置于37摄氏度孵育箱中备用。
2.根据权利要求1所述的一种高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器的制备方法制得的一种高灵敏检测癌细胞的电致化学发光传感器。
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