CN103134436A - 全光谱超分辨率测量方法及非标记生物分子测量系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种全光谱超分辨率测量方法及非标记生物分子测量系统，其特征在于：在芯片上设置有300～4500nm不同厚度的薄膜层用于编码，然后对所述芯片采用探针蛋白进行点样，制作得到生物芯片；使所述生物芯片的探针蛋白和被测样品充分结合，被测样品中的被测对象通过特异性吸附到探针蛋白上；光强为I₀的光束垂直照射到所述生物芯片上；当光束垂直照射在仅覆盖有所述薄膜层的生物芯片上时，不同薄膜层的厚度产生不同的反射光谱，实现所述生物芯片的厚度编码，采用干涉极值法，根据光谱中极值点的波长解码出所述生物芯片的薄膜层的厚度t；光束垂直照射在与探针蛋白结合的被测对象时，薄膜层发生幅度为Δ的厚度变化，计算得到强度幅值差值并获得被测对象的厚度，本发明可以广泛应用在生物分子厚度测量中。

Description

全光谱超分辨率测量方法及非标记生物分子测量系统

技术领域

本发明涉及一种生物分子厚度测量方法及测量系统，特别是一种关于全光谱超分辨率测量方法及非标记生物分子测量系统。

背景技术

干涉原理由于其极高的灵敏度和精确度，目前已经被广泛应用于薄膜厚度的精确测量。最早的干涉仪是在1883年由美国物理学家迈克尔逊和莫雷合作研制的，取名为迈克尔逊干涉仪。20世纪90年代，随着微加工和数字成像技术的成熟，白光干涉仪开始出现。与传统的迈克尔逊干涉仪只用于测量位移不同，白光干涉仪主要用于测量薄膜厚度。白光干涉仪的测量臂与参考臂在分束镜的同一侧，故其长度差正好等于被测薄膜前反射面与后反射面之间微小距离的2倍，即薄膜厚度的2倍。现代的白光干涉仪虽然光路原理与迈克尔逊干涉仪相似，但是测量原理和光源要求上已经发生了很大的变化。测量原理方面，白光干涉仪不再依赖于参考光和测量光干涉形成的图案，而是依赖于两束光叠加后光谱的变化。白光干涉仪光栅将合成的光线分离出各个不同的光谱成份，观察光谱的漂移来计算薄膜的厚度；光源要求方面，白光干涉仪改用宽光谱照明，且由于测量臂与参考臂的长度差与薄膜厚度属于同一量级，所以对光源的相干性要求较低。

目前最先进的白光干涉仪已经可以实现<0.1nm的检测精度，不过其检测厚度范围非常窄（小于四分之一波长），是目前测量薄膜厚度的最精确方法，但是由于白光干涉仪所使用的大都是基于极值算法，并没有利用到整个光谱的信息，信噪比较低，较容易受到供电电压、震动、光源闪烁等外界条件的影响，所以通常白光干涉仪都需要非常稳定的工作环境。由于白光干涉仪对厚度变化具有极高的灵敏度，所以它一直被认作是一种非常有前途的非标记生物检测方法。在生物检测领域，相比于传统的荧光检测法，非标记检测法具有操作步骤简单，污染小等优势。目前已经有研究使用干涉仪来实时、非标记地检测有机分子的反应结果，但白光干涉仪的苛刻工作条件要求限制了这种仪器在即时检验（POCT）领域应用。此外，也有其他的非标记生物分子检测方法，如表面等离子共振(SPR)方法，电阻抗方法等，但是上述这些方法都遇到了耗材成本高昂、仪器复杂等问题，短期内也还无法在即时检验领域(POCT)得到应用。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种生产成本低廉、编码容量大、检测厚度范围宽、厚度检测精度高、操作简单的全光谱超分辨率测量方法及非标记生物分子测量系统，能够在日常生活中简单地实现即时检验。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种全光谱超分辨率测量方法，其包括以下步骤：1）在一芯片上设置有300～4500nm不同厚度的薄膜层用于编码，然后对所述芯片采用探针蛋白进行点样，制作得到一生物芯片；2）使所述生物芯片的探针蛋白和被测样品充分结合，被测样品中的被测对象通过特异性结合到探针蛋白上；3）一光强为I0的光束垂直照射到所述生物芯片上；4）当光束垂直照射在仅覆盖有所述薄膜层的生物芯片上时，不同薄膜层的厚度产生不同的反射光谱，实现所述生物芯片的厚度编码，并采用干涉极值法，根据光谱中极值点的波长解码出所述生物芯片的薄膜层的厚度t；5）光束在所述薄膜层的上表面和下表面分别发生反射，上表面反射光的光矢量为：

$\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)=\frac{16p}{n^2}\&CenterDot;e^{i\&CenterDot;({\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{\&alpha;}}+\mathrm{\&pi;})}---\left(1\right)$

下表面反射光的光矢量为：

$\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)=\frac{16p}{n^2}\&CenterDot;e^{i\&CenterDot;({\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{\&alpha;}}+\mathrm{\&pi;}+\frac{2\mathrm{tn}}{\mathrm{\&lambda;}})}---\left(2\right)$

式中，p为入射光矢量的幅值，θ_α是为入射光的初始相位，n为薄膜层的折射率，λ为入射光波长；两束反射光在所述薄膜层的上表面发生干涉，根据余弦定律，两束光干涉后合成的光强度幅值为：

${\left|R\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2={\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2+{\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2-2\&CenterDot;\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\cos \left(\frac{4\mathrm{\&pi;nt}}{\mathrm{\&lambda;}}\right)---\left(3\right)$

6）光束垂直照射在与探针蛋白结合的被测对象时，所述薄膜层发生幅度为Δ的厚度变化，合成的光强度幅值变为：

${\left|R^{\&prime;}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2={\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2+{\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2-2\&CenterDot;\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\cos \left(\frac{4\mathrm{\&pi;n}(t+\mathrm{\&Delta;})}{\mathrm{\&lambda;}}\right)---\left(4\right)$

7）利用步骤5）变化前的强度幅值减去步骤6）变化后的强度幅值：

|R(λ)|²-|R′(λ)|²=-2·|Rs(x)|·|Rr(x)|·(cos(4πntx)-cos(4πn(t+Δ)x))    (5)

公式（5）化简后得：

${\left|R\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2-{\left|R^{\&prime;}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2=-4\&CenterDot;\left|\mathrm{Rs}\left(x\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(x\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(x\right)\right|\&CenterDot;\sin (4\mathrm{\&pi;ntx}+\frac{4\mathrm{\&pi;n\&Delta;x}}{2})\&CenterDot;\sin \left(\frac{4\mathrm{\&pi;n\&Delta;x}}{2}\right)---\left(6\right)$

式中，

项为常量，探针蛋白结合被测对象所引起的光强度变化简化为公式（6）中的绝对值关于λ的积分：

$M\left(\mathrm{\&Delta;}\right)={\&Integral;}_{{\mathrm{\&lambda;}}_{\min }}^{{\mathrm{\&lambda;}}_{\max }}\left|\sin (\frac{4\mathrm{\&pi;n\&Delta;}}{2}\&CenterDot;\frac{1}{\mathrm{\&lambda;}})\right|\mathrm{d\&lambda;}---\left(7\right)$

式中，M(Δ)为不同厚度的薄膜层干涉光谱的差分的积分；

8）对公式（7）求解即可以从探针蛋白结合被测对象所引起的光强度变化，得到被测对象的厚度Δ。

所述步骤8）中对公式（7）求解获得被测对象的厚度Δ采用数值求解方法和直接求解方法中的一种。

所述生物芯片采用硅基材料、其他金属材料、非金属材料、化合物、高分子材料聚合物中的一种，所述硅基材料、其它金属材料、非金属材料、化合物、高分子材料聚合物制作成生物芯片后要求其表面光滑。

当所述芯片采用硅基材料时，采用其他金属材料、非金属材料、化合物或高分子材料聚合物通过镀膜、生长、键合或胶粘方法在所述硅基材料上形成所述薄膜层。

一种实现全光谱超分辨率测量方法的非标记生物分子测量系统，其特征在于：它包括一光源、一反射式光学显微成像系统、一生物芯片、一二维电动平移台、一光谱仪和一计算机；所述反射式光学显微成像系统包括一聚光准直镜、一分束镜、一物镜和一成像透镜，所述光谱仪的输入端与所述成像透镜焦点重合，所述光谱仪的输出端连接所述计算机，所述二维电动平移台放置在所述物镜正下方，所述生物芯片固定在所述二维电动平移台上部；所述光源发出的光经所述聚光准直镜准直成平行光后垂直入射到所述分束镜，经所述分束镜透射的光通过所述物镜会聚到所述生物芯片，经所述生物芯片反射的光发射到所述物镜准直成平行光后发送到所述分束镜，经所述分束镜反射的光垂直发射到所述成像透镜，所述光谱仪接收所述成像透镜焦点上单个像素的全光谱信息，并将检测结果发送到所述计算机，所述计算机通过控制所述二维电动平台的蛇形运动完成对所述生物芯片扫描，获得焦平面所有像素点的全光谱信息，并通过全光谱超分辨率测量方法对所有像素点的全光谱信号进行处理，得到吸附到所述生物芯片上被测对象的厚度。

所述计算机内设置有电动平移台控制单元、记录单元和计算单元，扫描开始时，所述电动平移台控制单元控制所述二维电动平移台移动到参考采样点，所述记录单元记录参考采样点的全光谱信息，计算单元根据参考采样点的全光谱信息估算出芯片薄膜层的厚度，所述电动平移台控制单元控制所述二维电动平台移动到第一个测量采样点，所述记录单元采集第一个测量采样点的光谱数据，所述计算单元将当前测量采样点的光谱与参考采样点的光谱相减，并将光谱差值取绝对值后全部加和得到第一个测量采样点的厚度值，依此类推，所述电动平移台控制单元控制所述二维电动平台移动到下一个测量采样点进行厚度测量，直至整个生物芯片扫描完毕，根据各测量采样点全光谱移动计算出的平均厚度变化量得到吸附到所述生物芯片上被测对象的厚度。

所述参考采样点的光谱是指生物芯片上没有覆盖被测对象的测量点的反射光，所述测量采样点的光谱是指生物芯片上覆盖有被测对象的测量点的反射光。

它还包括一光纤，所述光纤的一端固定在所述成像透镜的焦平面，所述光纤的另一端连接所述光谱仪的输入端。

根据被测对象的厚度Δ计算出被测样品中被测对象的浓度；进一步通过二维电动平移台的运动，实现对生物芯片上不同位置点的二维扫描检测，并采用全光谱差分数据厚度测量方法解析出被测对象的厚度信息，生成生物芯片上被测对象分布的三维结构信息和与空间位置对应的被测对象的浓度信息。

所述光源采用LED、卤钨灯、氙灯或其它白光光源；所述分束镜采用平面镜分光、二向色分光或分光棱镜；所述被测对象为生物分子、非生物分子、细胞、组织、病毒、微生物、细菌、微加工结构和纳米材料中的一种。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、现有的荧光标记测量系统测量时需要四步（将血样、尿样等被测样品点到芯片上，在室温下放置30分钟，使探针和被测样品充分结合；用PBST清洗芯片；加入显色二抗，在室温下放置30分钟；用PBST清洗芯片，吹干芯片，采用荧光扫描仪检测结果），而采用本发明的非标记生物分子测量系统将上述测量步骤简化为两步，省去了荧光标记的步骤，操作简单，检测速度更快，同时检测过程中完成了解码，大大降低了用户的使用门槛，实用性强。2、由于本发明的芯片根据需要可以实现对300～4500nm厚度范围的薄膜层进行编码/解码，编码精度优于10nm，编码容量可以达到420种，相比色彩编码和荧光编码有了非常大的提升。3、与现有的SPR、电阻抗芯片等非标记检测方法相比，本发明所使用的芯片材料为常用的硅基芯片，不需要SPR的贵重金属镀层，也不需要电阻抗芯片复杂的微加工工艺，大大降低了生产成本。4、从本发明的全光谱超分辨率测量方法可以通过测量微小厚度变化所引起的干涉光谱差值的巨大变化精确求解出厚度变化量，这种厚度变化在±50nm范围内近似为线性，具有非常高的检测精度和信噪比，对应生物分子层厚度的检测限（分辨率）达到1.0nm，可以在非实验室的环境下实现2nm精度的厚度检测，该测量系统对环境变化并不是特别敏感，这大大简化了仪器设计、降低了成本，同时也降低了测量系统的使用条件。本发明基于厚度的生物芯片测量方法得以在科研与日常生活中广泛应用，配合成熟的生物芯片技术，能够提供一种非常可靠且便捷的即时检验（POCT）方法。本发明具有极高的灵敏度和较低的实验环境要求，且能够对透明薄膜表面形态进行高精度三维成像测量，可以广泛应用在生物分子厚度测量中。

附图说明

图1是本发明的非标记生物分子测量系统的结构示意图；

图2是本发明的二维电动平移台扫描方向的示意图，箭头表示扫描方向；

图3是本发明的厚度测量原理示意图；a表示直接照射在硅片上的干涉光束；b表示照射在没有与生物分子（目标蛋白质）结合的探针蛋白上的光束；c表示照射在与生物分子结合的探针蛋白上的光束；

图4是本发明的光谱差分积分量与厚度变化之间的对应关系示意图，横坐标为Δ/nm，纵坐标为M(Δ)；

图5是本发明通过蚀刻工艺加工出的、用于标定的硅片的显微成像结果示意图；

图6是采用本发明的方法对用于标定的硅片进行重建的结果示意图；

图7是采用本发明的标定结果示意图，横坐标为实际厚度/nm，纵坐标为测量厚度/nm；

图8是本发明实施例中对经过免疫杂交反应后的硅基生物芯片表面的扫描重建结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

如图1、图2所示，本发明的非标记生物分子测量系统包括一光源1、一反射式光学显微成像系统2、一硅基生物芯片3、一二维电动平移台4、一光谱仪5和一计算机6，反射式光学显微成像系统2包括一聚光准直镜21、一分束镜22、一物镜23和一成像透镜24，光谱仪5的输入端与成像透镜24的焦点重合，光谱仪5的输出端连接计算机6；测量时，二维电动平移台4放置在物镜23的正下方，硅基生物芯片3固定在二维电动平移台4顶部，光源1发出的光经聚光准直镜21准直成平行光后垂直入射到分束镜22，经分束镜22透射的光通过物镜23会聚到硅基生物芯片3，经硅基生物芯片3反射的光发射到物镜23准直成平行光后发送到分束镜22，经分束镜22反射的光垂直发射到成像透镜24，光谱仪5接收成像透镜24焦点的单个像素的全光谱信息，并对接收信号的光谱成分进行检测，并将检测结果发送到计算机6，计算机6通过控制二维电动平台4的蛇形运动完成对硅基生物芯片3的整体扫描，获得成像透镜24焦平面所有像素点的全光谱信息，并通过全光谱超分辨率测量方法对所有像素点的全光谱信号进行处理，得到硅基生物芯片3上特异性结合的生物分子的厚度。

上述实施例中，它还可以包括一光纤，光纤的一端固定在成像透镜24的焦平面，光纤的另一端连接光谱仪5的输入端，光谱仪5通过光纤接收成像透镜24焦平面像素的全光谱信息。

上述实施例中，计算机6内设置有电动平移台控制单元、记录单元和计算单元。扫描开始时，电动平移台控制单元控制二维电动平移台4移动到参考采样点，记录单元记录参考采样点的全光谱信息，计算单元根据参考采样点的全光谱信息通过全光谱干涉极值法估算出硅基生物芯片的氧化层的厚度，根据硅基生物芯片的氧化层厚度可以为芯片解码，然后由电动平移台控制单元控制二维电动平台移动到第一个测量采样点，记录单元采集第一个测量采样点的光谱数据，计算单元将当前测量采样点的光谱与参考采样点的光谱相减，并将光谱差值取绝对值后全部加和（积分）得到第一个测量采样点的厚度值，依此类推，电动平移台控制单元控制二维电动平台移动到下一个测量采样点进行厚度测量，直至整个硅基生物芯片扫描完毕，根据各测量采样点光谱计算出的平均厚度变化量则可以推算出通过特异性吸附到硅基生物芯片上的生物分子的厚度；本发明定义参考采样点的光谱是指硅基生物芯片3上未吸附生物分子测量点的反射光，测量采样点的光谱是指硅基生物芯片3上吸附生物分子测量点的反射光。

上述各实施例中，硅基生物芯片3采用的材料是硅基材料，但是不局限于此材料，可以根据实际需要采用其他金属材料、非金属材料、化合物、高分子材料聚合物等制作成生物芯片，只要材料的表面光滑，能形成良好的光反射效果即可。硅基生物芯片3表面通过溅射或其他工艺生成二氧化硅氧化层，也可以采用其他金属材料、非金属材料、化合物、高分子材料聚合物通过镀膜、生长或键合、胶粘或其他紧密接触的方法形成薄膜层（干涉厚度编码层）。

上述各实施例中，光源1可以采用LED、卤钨灯、氙灯或其它白光光源、单色光源中的一种；分束镜22可以采用平面镜、二向色镜或分光棱镜；光谱仪5的光谱范围为1185nm～50um；被测对象为生物分子，但是不限于此，也可以对非生物分子、细胞、组织、病毒、微生物、细菌、微加工结构和纳米材料等被测对象进行厚度测量。

本发明基于干涉原理，通过测量光谱极值点波长实现测量厚度解码，进一步测量全光谱变化差分量以求解生物分子层厚度，本发明以硅基生物芯片作为实施例详细进行说明本发明的全光谱超分辨率测量方法的过程，其包括以下步骤：

1、在硅片上氧化出300～4500nm不同厚度的二氧化硅层用于编码，不同编码的二氧化硅层的厚度差距为10nm，即：（4500-300）/10=420，可以实现420的编码容量；对氧化后的硅片做硅烷化处理，并对硅烷化处理完成的氧化硅芯片采用探针蛋白进行点样，制作得到硅基生物芯片3；

2、使硅基生物芯片3的探针蛋白和被测样品充分结合，被测样品中的生物分子通过特异性吸附到探针蛋白上；

3、光源1发出光强为I₀的光束垂直照射到硅基生物芯片3上；

4、当光束垂直照射在仅仅覆盖有二氧化硅层的硅基生物芯片3上时，采用全光谱干涉极值法测量硅基生物芯片的二氧化硅层的厚度，其过程为：

如图3中光束a所示，光束垂直照射到仅仅覆盖有平整二氧化硅层的硅片上，光束会在二氧化硅层（薄膜）的上表面和下表面发生两次反射，两次反射的光线叠加后产生干涉，两束光的光程差Δ₁为二氧化硅层的厚度d的两倍乘以二氧化硅的折射率n（n约为1.47），即Δ₁＝2d×n；当光源采用宽带白光时，光谱中波长为光程差1/K(K为整数)的成分的反射率会达到极大值，同理，光谱中波长为光程差1/（K+0.5）分量的成分的反射率会达到极小值，利用极大值与极小值的位置就可以大致估计出二氧化硅层的厚度，采用上述全光谱干涉极值法可以快速的检测出二氧化硅层的厚度用于解码。

5、光束在二氧化硅层的上表面和下表面分别发生反射，假定入射光的光矢量为

其中，p为入射光矢量的幅值，θ_α是入射光的初始相位，根据菲涅尔定理和半波损失原理，当入射光波长为λ时，上表面反射光的光矢量为：

$\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)=\frac{16p}{n^2}\&CenterDot;e^{i\&CenterDot;({\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{\&alpha;}}+\mathrm{\&pi;})}---\left(1\right)$

下表面反射光的光矢量为：

$\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)=\frac{16p}{n^2}\&CenterDot;e^{i\&CenterDot;({\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{\&alpha;}}+\mathrm{\&pi;}+\frac{2\mathrm{tn}}{\mathrm{\&lambda;}})}---\left(2\right)$

式中，t为二氧化硅层的厚度加上点在硅片上的探针的厚度。

两束反射光在二氧化氧化层的上表面发生干涉，根据余弦定律，两束光干涉后合成的光强度幅值：

${\left|R\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2={\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2+{\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2-2\&CenterDot;\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\cos \left(\frac{4\mathrm{\&pi;nt}}{\mathrm{\&lambda;}}\right)---\left(3\right)$

6、光束垂直照射在与探针蛋白结合的生物分子上时，二氧化硅层发生幅度为Δ的厚度变化（Δ为生物分子的厚度），合成的光强度幅值变为：

${\left|R^{\&prime;}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2={\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2+{\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2-2\&CenterDot;\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\cos \left(\frac{4\mathrm{\&pi;n}(t+\mathrm{\&Delta;})}{\mathrm{\&lambda;}}\right)---\left(4\right)$

7、利用步骤5变化前的强度幅值减去步骤6变化后的强度幅值，假设

|R(λ)|²-|R′(λ)|²=-2·|Rs(x)|·|Rr(x)|·(cos(4πntx)-cos(4πn(t+Δ)x))  (5)

将公式（5）化简后得：

${\left|R\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2-{\left|R^{\&prime;}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2=-4\&CenterDot;\left|\mathrm{Rs}\left(x\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(x\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(x\right)\right|\&CenterDot;\sin (4\mathrm{\&pi;ntx}+\frac{4\mathrm{\&pi;n\&Delta;x}}{2})\&CenterDot;\sin \left(\frac{4\mathrm{\&pi;n\&Delta;x}}{2}\right)---\left(6\right)$

式中，-4·|Rs(x)|·|Rr(x)|与Δ无关，与Δ相比t较大，不同的t值对应厚度编码信息，由上面的全光谱干涉极值法极大值与极小值的位置已经直接解码出了二氧化硅层的厚度t，所以

项也可以近似看成是常量，因此，探针蛋白结合生物分子所引起的光强度变化可以简化为（6）式最后一项

的绝对值关于λ的积分：

$M\left(\mathrm{\&Delta;}\right)={\&Integral;}_{{\mathrm{\&lambda;}}_{\min }}^{{\mathrm{\&lambda;}}_{\max }}\left|\sin (\frac{4\mathrm{\&pi;n\&Delta;}}{2}\&CenterDot;\frac{1}{\mathrm{\&lambda;}})\right|\mathrm{d\&lambda;}---\left(7\right)$

式中，M(Δ)为不同厚度的薄膜层干涉光谱差分的积分。

8、求解公式（7），即可以从探针蛋白结合生物分子所引起的光强度变化得到生物分子的厚度Δ，其中二氧化硅层的厚度包括了探针蛋白的厚度，探针蛋白的厚度是已知的。对公式（7）求解获得生物分子的厚度Δ可以采用数值方法求解，也可以采用直接精确求解或其他求解方法，在此不作限制。

如图4所示，对公式（7）进行积分的结果进行分析：当|Δ|≤50nm的时候，Δ与积分值基本成线性关系，所以当|Δ|≤50nm可以采用上述积分值估计厚度变化Δ。

如图5、图6所示，为了进一步说明本发明的全光谱超分辨率测量方法的精度，本发明采用光刻套刻法制作了用于标定的硅片，硅片上共刻蚀出五个厚度，由椭圆偏振仪测量出厚度，分别为924.7nm,929.8nm,933.7nm,944.9nm和955.7nm，其余未蚀刻部分的二氧化硅层的厚度为985.0nm，采用本发明的全光谱差分数据厚度测量方法对硅片表面进行重建，得到表面形貌的重建数据（如图5所示），并将重建后得到的厚度与椭圆偏振仪测出的厚度进行对比。从图7中可以看出，本发明的全光谱差分数据厚度测量方法与标准厚度之间基本成线性关系，其斜率约为20873，厚度检测限（分辨率）约为1.0nm。

本发明的硅基生物芯片3可以采用现有的方法进行制备，其它材料的生物芯片可以按照现有方法进行制备，在此不再赘述：首先在硅片上氧化出不同厚度的二氧化硅层，各二氧化硅层厚度的差距保持在10nm，然后将氧化后的硅片切成边长为1mm左右的小片，对切成的小片氧化硅片做硅烷化处理（修饰），使小片氧化硅片对探针蛋白质具有较强的吸附能力，然后对氧化硅芯片进行点样，所有氧化硅片经过修饰和点样后，成为一块可以长期保存的硅基生物芯片3。

硅烷化处理的具体方法为：

1、将所有小片氧化硅片置于丙酮中，采用摇床进行摇晃清洗，每次清洗10分钟，共清洗3次；

2、采用干净的镊子将氧化硅片一一取出，置于干净的铝箔纸上晾干10分钟，晾干后将所有氧化硅片置于盛有环氧修饰试剂的烧杯中，用铝箔纸和橡皮筋将烧杯封口；

3、将烧杯置于摇床中，在55摄氏度的温度下，用90RPM左右的速率摇晃36个小时，使其充分反应；

4、采用干净的镊子将环氧修饰后的氧化硅片一一取出，放在干净的铝箔纸上晾干；

5、采用双面胶将环氧修饰后的所有氧化硅片整齐地贴在一片载玻片上，以备点样。环氧修饰处理后的氧化硅片对蛋白质有非常强的亲和力，从而可以实现蛋白点样。

点样流程为：

1、将探针蛋白用含有10%甘油的PBS（磷酸缓冲液）缓冲液稀释到目标浓度，混匀后作为点样液；

2、采用现有的商用生物芯片点样仪例如

将点样液均匀地点置到每一氧化硅片上，根据实际需要，可以根据氧化硅片厚度不同，在每一氧化硅片上点的不同探针，从而实现探针的编码；

3、将点样后的所有氧化硅片一起放在真空烘箱中真空烘干16个小时；

4、将所有氧化硅片浸泡在10mg/mL的BSA（牛血清白蛋白）溶液中封闭30分钟，封闭后用PBST（含0.1%Tween的磷酸缓冲液）洗液摇晃清洗10分钟，清洗后用干燥氮气吹干；

5、将点样后的所有氧化硅片用真空带包装，储存在4度冰箱里。

综上所述，本发明的非标记生物分子测量系统使用过程如下：

1、将血样、尿样等被测样品点到制作完成的硅基生物芯片3上，在室温下放置30分钟（如使用血液，则需要加入抗凝剂），使硅基生物芯片3的探针蛋白和被测样品充分结合；

2、采用PBST清洗硅基生物芯片3。

3、采用本发明的非标记生物分子测量系统测量硅基生物芯片3各个点的厚度，通过本发明的全光谱差分反演方法得到吸附到硅基生物芯片3上生物分子的厚度，并根据探针蛋白类型、浓度和点样液的浓度，通过得到的厚度值，并根据厚度值计算出被测样品中吸附到硅基生物芯片3上生物分子的浓度（1ng的蛋白质铺在1平方毫米的面积上的厚度大约为1nm），进一步通过二维电动平移台的运动，实现对硅基生物芯片上不同位置点的二维扫描检测，并采用全光谱差分数据厚度测量方法解析出生物分子层的厚度信息，生成硅基生物芯片上生物分子分布的三维结构信息和与空间位置对应的被测对象的浓度信息，进而给出辅助诊断结果。

如图3所示，下面通过硅基生物芯片3检测特定抗体的实施例进一步具体说明本发明的检测过程：将某一被测样品点到硅基生物芯片3上，被测样品中存在不能与抗原（探针蛋白）匹配的抗体和能与抗原匹配的抗体；光束1同时照射在硅基生物芯片3上形成三种不同的干涉合成光：一种是直接照射在没有抗原修饰的氧化硅基底上的干涉合成光a，另一种是照射在由不能与抗原匹配的抗体修饰的氧化硅基底上的干涉合成光b，第三种是照射在能与抗原匹配的抗体修饰的氧化硅基底上的干涉合成光c，由于硅基生物芯片的探针蛋白结合上特定抗体后，厚度会发生变化（一般是变厚10nm左右，随点样浓度变化），通过本发明扫描整张硅基生物芯片，计算出抗体的厚度变化量，进而可以推测出被测样品中能够与硅基生物芯片抗原结合的抗体的浓度，例如：实验中采用一块4x4点阵的芯片按照上述硅基生物芯片的制作过程分别点上1mg/mL的BSA（阴性对照），人IgG，鼠IgG和兔IgG，并用1mg/mL的人二抗（能与人IgG特异性结合的抗体）与硅基生物芯片3在室温下孵育30分钟，然后采用在本发明的非标记生物分子测量系统进行成像，成像结果如图8所示，从结果中可见，点有人IgG的一行的厚度增量明显高于其他行，这种方法快速而又简单，非常适合日常科研与其它高精度测厚使用。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中所有光学器件可以根据实际情况采用外部支架进行固定，在此不作限定，各部件的结构和连接方式等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (10)

1.一种全光谱超分辨率测量方法，其包括以下步骤：

1）在一芯片上设置有300～4500nm不同厚度的薄膜层用于编码，然后对所述芯片采用探针蛋白进行点样，制作得到一生物芯片；

2）使所述生物芯片的探针蛋白和被测样品充分结合，被测样品中的被测对象通过特异性结合到探针蛋白上；

3）一光强为I0的光束垂直照射到所述生物芯片上；

4）当光束垂直照射在仅覆盖有所述薄膜层的生物芯片上时，不同薄膜层的厚度产生不同的反射光谱，实现所述生物芯片的厚度编码，并采用干涉极值法，根据光谱中极值点的波长解码出所述生物芯片的薄膜层的厚度t；

5）光束在所述薄膜层的上表面和下表面分别发生反射，上表面反射光的光矢量为：

$\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)=\frac{16p}{n^2}\&CenterDot;e^{i\&CenterDot;({\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{\&alpha;}}+\mathrm{\&pi;})}---\left(1\right)$

下表面反射光的光矢量为：

$\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)=\frac{16p}{n^2}\&CenterDot;e^{i\&CenterDot;({\mathrm{\&theta;}}_{\mathrm{\&alpha;}}+\mathrm{\&pi;}+\frac{2\mathrm{tn}}{\mathrm{\&lambda;}})}---\left(2\right)$

式中，p为入射光矢量的幅值，θ_α是为入射光的初始相位，n为薄膜层的折射率，λ为入射光波长；两束反射光在所述薄膜层的上表面发生干涉，根据余弦定律，两束光干涉后合成的光强度幅值为：

${\left|R\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2={\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2+{\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2-2\&CenterDot;\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\cos \left(\frac{4\mathrm{\&pi;nt}}{\mathrm{\&lambda;}}\right)---\left(3\right)$

6）光束垂直照射在与探针蛋白结合的被测对象时，所述薄膜层发生幅度为Δ的厚度变化，合成的光强度幅值变为：

${\left|R^{\&prime;}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2={\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2+{\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2-2\&CenterDot;\left|\mathrm{Rs}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|\&CenterDot;\cos \left(\frac{4\mathrm{\&pi;n}(t+\mathrm{\&Delta;})}{\mathrm{\&lambda;}}\right)---\left(4\right)$

7）利用步骤5）变化前的强度幅值减去步骤6）变化后的强度幅值：

|R(λ)|²-|R′(λ)|²=-2·|Rs(x)|·|Rr(x)|·(cos(4πntx)-cos(4πn(t+Δ)x))  (5)

公式（5）化简后得：

${\left|R\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2-{\left|R^{\&prime;}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)\right|}^2=-4\&CenterDot;\left|\mathrm{Rs}\left(x\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(x\right)\right|\&CenterDot;\left|\mathrm{Rr}\left(x\right)\right|\&CenterDot;\sin (4\mathrm{\&pi;ntx}+\frac{4\mathrm{\&pi;n\&Delta;x}}{2})\&CenterDot;\sin \left(\frac{4\mathrm{\&pi;n\&Delta;x}}{2}\right)---\left(6\right)$

式中，

项为常量，探针蛋白结合被测对象所引起的光强度变化简化为公式（6）中

的绝对值关于λ的积分：

$M\left(\mathrm{\&Delta;}\right)={\&Integral;}_{{\mathrm{\&lambda;}}_{\min }}^{{\mathrm{\&lambda;}}_{\max }}\left|\sin (\frac{4\mathrm{\&pi;n\&Delta;}}{2}\&CenterDot;\frac{1}{\mathrm{\&lambda;}})\right|\mathrm{d\&lambda;}---\left(7\right)$

式中，M(Δ)为不同厚度的薄膜层干涉光谱的差分的积分；

8）对公式（7）求解即可以从探针蛋白结合被测对象所引起的光强度变化，得到被测对象的厚度Δ。

2.如权利要求1所述的全光谱超分辨率测量方法，其特征在于：所述步骤8）中对公式（7）求解获得被测对象的厚度Δ采用数值求解方法和直接求解方法中的一种。

3.如权利要求1或2所述的全光谱超分辨率测量方法，其特征在于：所述生物芯片采用硅基材料、其他金属材料、非金属材料、化合物、高分子材料聚合物中的一种，所述硅基材料、其它金属材料、非金属材料、化合物、高分子材料聚合物制作成生物芯片后要求其表面光滑。

4.如权利要求3所述的全光谱超分辨率测量方法，其特征在于：当所述芯片采用硅基材料时，采用其他金属材料、非金属材料、化合物或高分子材料聚合物通过镀膜、生长、键合或胶粘方法在所述硅基材料上形成所述薄膜层。

5.一种实现如权利要求1～4任一项所述方法的非标记生物分子测量系统，其特征在于：它包括一光源、一反射式光学显微成像系统、一生物芯片、一二维电动平移台、一光谱仪和一计算机；所述反射式光学显微成像系统包括一聚光准直镜、一分束镜、一物镜和一成像透镜，所述光谱仪的输入端与所述成像透镜焦点重合，所述光谱仪的输出端连接所述计算机，所述二维电动平移台放置在所述物镜正下方，所述生物芯片固定在所述二维电动平移台上部；

所述光源发出的光经所述聚光准直镜准直成平行光后垂直入射到所述分束镜，经所述分束镜透射的光通过所述物镜会聚到所述生物芯片，经所述生物芯片反射的光发射到所述物镜准直成平行光后发送到所述分束镜，经所述分束镜反射的光垂直发射到所述成像透镜，所述光谱仪接收所述成像透镜焦点上单个像素的全光谱信息，并将检测结果发送到所述计算机，所述计算机通过控制所述二维电动平台的蛇形运动完成对所述生物芯片扫描，获得焦平面所有像素点的全光谱信息，并通过全光谱超分辨率测量方法对所有像素点的全光谱信号进行处理，得到吸附到所述生物芯片上被测对象的厚度。

6.如权利要求5所述的非标记生物分子测量系统，其特征在于：所述计算机内设置有电动平移台控制单元、记录单元和计算单元，扫描开始时，所述电动平移台控制单元控制所述二维电动平移台移动到参考采样点，所述记录单元记录参考采样点的全光谱信息，计算单元根据参考采样点的全光谱信息估算出芯片薄膜层的厚度，所述电动平移台控制单元控制所述二维电动平台移动到第一个测量采样点，所述记录单元采集第一个测量采样点的光谱数据，所述计算单元将当前测量采样点的光谱与参考采样点的光谱相减，并将光谱差值取绝对值后全部加和得到第一个测量采样点的厚度值，依此类推，所述电动平移台控制单元控制所述二维电动平台移动到下一个测量采样点进行厚度测量，直至整个生物芯片扫描完毕，根据各测量采样点全光谱移动计算出的平均厚度变化量得到吸附到所述生物芯片上被测对象的厚度。

7.如权利要求6所述的非标记生物分子测量系统，其特征在于：所述参考采样点的光谱是指生物芯片上没有覆盖被测对象的测量点的反射光，所述测量采样点的光谱是指生物芯片上覆盖有被测对象的测量点的反射光。

8.如权利要求5或6或7所述的非标记生物分子测量系统，其特征在于：它还包括一光纤，所述光纤的一端固定在所述成像透镜的焦平面，所述光纤的另一端连接所述光谱仪的输入端。

9.如权利要求5～8任一项所述的非标记生物分子测量系统，其特征在于：根据被测对象的厚度Δ计算出被测样品中被测对象的浓度；进一步通过二维电动平移台的运动，实现对生物芯片上不同位置点的二维扫描检测，并采用全光谱差分数据厚度测量方法解析出被测对象的厚度信息，生成生物芯片上被测对象分布的三维结构信息和与空间位置对应的被测对象的浓度信息。

10.如权利要求5～9任一项所述的非标记生物分子测量系统，其特征在于：所述光源采用LED、卤钨灯、氙灯或其它白光光源；所述分束镜采用平面镜分光、二向色分光或分光棱镜；所述被测对象为生物分子、非生物分子、细胞、组织、病毒、微生物、细菌、微加工结构和纳米材料中的一种。

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