CN103131796A - 一种家蚕浓核病毒lamp可视化快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子诊断和鉴定技术领域，具体涉及一种家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包含四条LAMP引物、DNA抽提缓冲液、LAMP反应液、阳性对照品、阴性对照品和显色液，构成检测反应体系。采用煮沸沉淀法快速抽提待测样品模板DNA，在60~653℃的恒温条件下，快速扩增模板DNA，通过加入显色染料，在自然光下通过肉眼观察判读结果：反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕浓核病毒；反应产物变橙色，则不含家蚕浓核病毒。本发明的试剂盒具有敏感性高、特异性强、反应迅速、操作简单等特点，成本低廉、不需要特殊的仪器设备、反应结果易于观察判定，解决了家蚕浓核病毒检测时间长、工作量大、操作复杂等缺陷，能较好地满足疾病监测、现场应急以及生产样本检测的迫切需要。

Description

一种家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于分子诊断和鉴定技术领域，具体地，涉及一种家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒及其检测方法。 

背景技术

家蚕是鳞翅目模式昆虫，具有重要的经济价值，蚕丝及其织物是我国传统的出口创汇物质。家蚕浓核病毒（Bombyx mori densovirus，BmDNV）是我国蚕茧生产中普遍发生的病毒病的病原，严重威胁着蚕丝业的持续稳定生产。 

家蚕病毒病除血液型脓病发病较快外，均属慢性传染病。蚕在感病初期外观无任何症状，一般要在感病后4～5天才出现症状，但此时已接近晚期。病蚕是通过带病毒的蚕粪传染的，因此及早进行预知检测和诊断，并采取一定的防控措施，可防止病毒病的扩散与蔓延。 

目前家蚕浓核病毒的主要检测方法有特异病症观察法、免疫血清学方法、PCR方法等，其中免疫血清学采用双向免疫扩散法（DID）、对流免疫电泳法（CIEP）、酶联对流免疫电泳法（ELCIEP）、酶标组化法（IEHC）、可溶性酶-抗酶法（PAP）、斑点免疫结合测定法（DIBA）、生物素-亲和素系统检测法（ABS）以及胶乳凝集试验法（LTA）等方法进行检测，但这些方法存在病毒分离繁琐、代价高、灵敏性地、特异性差、确诊缓慢等因素，在生产检测诊断应用中存在一定的局限性。尽管PCR方法应用于浓核病毒的检测，在检测灵敏度上有一定的改进，但由于需要精密的仪器和设备配套使用，仍然无法满足蚕业生产和现场检测的需要（王裕兴，曹诒孙，钱元骏等. 酶对流免疫电泳对家蚕浓核病的早期诊断技术. 蚕业科学，1983，9(2):97-102）；钱元骏，胡雪芳，王红林. 家蚕病毒病血清诊断实用化研究. 蚕业科学，1984，10(3):155-157；Kageyasu S, Hayakawa T, Isawa H et al．Detection of the Silkworm-pathogenic virus genomes by PCR．Journal of Sericultural Science of Japan，1997，66(6):477-483；韩序，姚勤，高路等，家蚕浓核病毒（中国镇江株）在不同感受性宿主体内的复制. 生物工程学报，2007，23(1):145-151；付艳红，唐顺明，覃光星等.家蚕浓核病毒中国（镇江）株基因组的克隆及重组质粒转染家蚕对浓核病毒的拯救. 蚕业科学，2008，34(3):453-458；余蔚，姚勤，郭忠建等. 家蚕浓核病毒中国株非结构蛋白1(NS1)的表达. 微生物学报，2008，48(2):191-196）。 

环介导核酸等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者Notomi等（2000）发明的一种新型体外等温扩增特异核酸判断的技术（Notomi T, Okayama H, Masubuchi H et al.. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 28(12): e63）。随着LAMP技术的发展，该技术已成功应用于人类和动植物病毒、细菌以及寄生虫等引起的疾病诊断和快速检测（杨丽，何晓青，韦玉梅等. 环介导等温扩增技术(LAMP)检测人星状病毒方法的建立及其在再生水检测中的应用.生态毒理学报,2011,6(6):600-606；Diaeldin A. Salih & Awadia M. Ali & Zhijie Liu et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification method for detection of Theileria lestoquardi. Parasitol Res.2012，（110）:533-538）。 

    LAMP法具有特异性强，敏感性高，操作简便，快速、高效等优点，通过肉眼观察产物颜色变化即可判断结果，从而简化了检测过程，不需要特殊仪器，检测时间也大大缩短，适宜于现场快速检测和诊断。目前尚未见应用LAMP法检测家蚕浓核病毒BmDNV的相关技术报道。 

发明内容

本发明的目的是克服现有家蚕浓核病毒BmDNV检测技术的不足，提供一种家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒。 

    本发明的另一个目的是提供一种家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒的检测方法。 

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的： 

    一种家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒，包括一对内侧引物DFI1/ DBI1和一对外侧引物DF1/ DB1，引物序列如SEQ ID NO:1~4所示。

进一步地，所述试剂盒还包含基因组DNA抽提缓冲液、LAMP反应液、阳性对照品为BmDNV模板DNA或含BmDNV靶基因DNA片段的质粒、阴性对照品为正常家蚕组织模板DNA和显色液； 

所述LAMP反应液除含有权利要求1所述引物还含有2×LAMP反应缓冲液、Bst DNA 聚合酶、密封液和无菌水。

优选地，所述2×LAMP反应缓冲液含有20 mM Tris-HCl，pH8.8；10 mM KCl；2 mM MgSO₄；20 mM（NH₄）₂SO₄；0.1% Triton X-100；2.8 mM dNTPs；1M甜菜碱；25mM MgCl₂。 

优选地，所述DNA抽提缓冲液含有10 mM Tris-Cl，pH8. 0；0. 1 M EDTA，pH 8. 0；0. 5% SDS（十二烷基硫酸钠）。 

优选地，所述阳性对照品为BmDNV模板DNA或含BmDNV靶基因DNA片段的质粒；阴性对照品为正常家蚕组织模板DNA。 

优选地，所述显色液为SYBR Green I 、EvaGreen或钙黄绿素。 

优选地，所述试剂盒的反应体系为： 

 

反应体系中引物的浓度可以根据具体反应来确定，优选方案中引物DFI1和DBI1 的浓度都为40pmol/μL；引物DF1和DB1的浓度都为5pmol/μL。

优选地，所述试剂盒的LAMP反应条件为60~65℃恒温反应20~90 min；然后 80~100℃，1~10 min灭活。 

优选地，所述密封液为甘油。 

一种利用如上所述试剂盒检测家蚕浓核病毒的方法，包括如下步骤： 

S1.提取待测样品DNA；

S2.在反应管中配置反应体系；

S3.向反应体系中加入密封液，在反应管盖内侧加入显色液；

S4.反应：将反应管60~65℃恒温反应20~90 min；然后 80~100℃，1~10 min灭活。

S5.结果判读：将显色液与反应产物混合；观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕浓核病毒；反应产物变为橙色，则不含有家蚕浓核病毒。 

本发明的有益效果是： 

本发明设计的四条特异的引物，实验证明具有特异敏感的优越性，有效克服了现有家蚕浓核病毒BmDNV的检测技术的敏感性问题，本发明的应用于家蚕浓核病毒BmDNV检测的试剂盒，可快速、灵敏地检测出目前生产上的家蚕浓核病毒，其操作简单、成本低廉、不需要复杂的仪器、反应结果易于观察判定，特异性强，能较好地满足疾病监测、现场应急以及生产样本检测的迫切需要。

附图说明

图1.四条LAMP引物设计的靶基因序列和位置示意图。 

图2.家蚕浓核病毒的LAMP可视化快速检测试剂盒检测不同浓度梯度的浓核病毒DNA敏感性结果；1~4 号管分别为稀释10⁵~10⁸倍后的BmDNV DNA；5.BmDNV DNA；6.正常家蚕组织DNA ；7.无菌水。 

图3.家蚕浓核病毒的LAMP可视化快速检测试剂盒不同反应时间的结果；1~5 分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min；6.正常家蚕组织；7 .无菌水。 

具体实施方式

    下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。 

实施例1 

家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

S1.家蚕浓核病毒LAMP检测所使用的引物的设计

依据NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上报道的 BmDNV-3的VD2 ssDNA基因组的核苷酸序列资料（Genbank登录号：DQ017269.1），使用在线软件：Primer ExplorerV4 Primer ExplorerV4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0 /index.html）设计引物，根据LAMP引物设计的原理，用DNAMAN软件（6.0.3.99 汉化版）对引物的二级结构进行挑选，最终选定1组引物用于检测BmDNV。引物序列如下：

    DF1：5'- ATAAACTCGAGTACCGCC -3'，引物序列如SEQ ID NO:1所示。

    DB1：5'- GATCTACGTCAGTGATAAGAGA -3'，引物序列如SEQ ID NO:2所示。 

    DFI1：5'- GTCACAAGGGCCGAATACCGCTTCAATGCCGCCTCAAG -3'，引物序列如SEQ ID NO:3所示。 

    DBI1：5'-GGTATCTGTCGAGGCTGCTACTTTGAAATTTTTGTCTGCCAT-3'，引物序列如SEQ ID NO:4所示。 

    引物的靶基因序列和位置信息如附图1所示。 

S2.感染家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA的提取: 

采用煮沸沉淀法，具体为取感染家蚕浓核病毒BmDNV的家蚕中肠于研钵中，加1 mL的灭菌水将中肠研磨充分后装于1.5 mL的灭菌离心管中，10000 r/ min离心10 min，取上清400μL于1.5 mL的灭菌离心管中，并加入400μL基因组DNA抽提缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8. 0；0.1 mol/L EDTA，pH 8. 0；0. 5% SDS（十二烷基苯磺酸钠），于100℃水浴锅中煮沸裂解10 min后，取出放于 -20℃冰箱中冷却至室温，10000 r/min离心5 min将变性的蛋白沉淀，另取上清700μL于1.5 mL的灭菌离心管中，并加入700μL预冷的异丙醇，置- 20 ℃冰箱中冰冻30 min促进沉淀形成；12000 r/min离心10 min沉淀DNA，并弃去上清；用1mL 70%（V/V）乙醇洗涤沉淀，然后尽量弃去乙醇，自然晾干，使乙醇挥发完全，但不能使沉淀过于干燥，否则很难溶解；加入20 μL TE 溶液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1mmol/L EDTA，pH 8.0）或无菌水溶解沉淀，-20℃保存备用。

S3.阳性对照品和阴性对照品的制备：利用常规方法提取家蚕浓核病毒DNA作为阳性对照，或者利用上游引物DF1、下游引物DB1为反应引物，以按常规方法提取的家蚕浓核病毒DNA为模板进行PCR扩增，反应条件：94℃，5min；94℃，30s；55.7℃，45s；72℃，45s；72℃10min，32个循环；扩增产物克隆入pUCm-T载体获得含有BmDNV靶基因DNA片段的重组质粒作为检测阳性对照品。按常规方法提取正常家蚕组织DNA作为阴性对照，本实施例使用常规方法提取正常家蚕的中肠组织DNA作为阴性对照品，使用正常家蚕的其它组织的DNA也可以作为阴性对照。 

S4.引物组DF₁/DB₁作为外部引物，DFI₁/DBI₁作为内部引物，LAMP反应液包括如下组分：2×LAMP反应缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH8.8；10 mM KCl；2 m M MgSO₄；20 mM（NH₄）₂SO₄；0.1% Triton X-100；2.8mM dNTPs；1M甜菜碱；25mM MgCl₂）；引物DFI₁/DBI₁（40 pmol/μL）和引物DF₁/DB₁(5pmol/μL)；阳性对照品；阴性对照品；BstDNA 聚合酶（8U/μL）；密封液甘油；显色液（SYBR Green I）；无菌水。 

LAMP试剂盒反应体系： 

 S5. 反应：将反应管置于恒温水浴箱或恒温金属浴中，63℃恒温放置40~60 min；然后 95℃，放置2 min灭活。

    S6. 结果判读：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，说明待测样品含有家蚕浓核病毒；反应产物变为橙色，则不含家蚕浓核病毒。 

S7.LAMP引物检测家蚕浓核病毒DNA，确定引物的可靠性和有效性。 

S8.LAMP引物的反应时间筛选、特异性、灵敏性的检测，确定检测最佳反应时间、最低检测限。 

本发明的最佳反应时间为30~60min，结果判定方法为在反应产物中加入显色液，通过肉眼鉴别产物颜色的变化进行检测。反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕浓核病毒；反应产物变为橙色，则不含家蚕浓核病毒。 

将基因组DNA抽提缓冲液、2×LAMP反应缓冲液、引物、阳性对照品；阴性对照品；Bst DNA 聚合酶（8U/μL）；密封液甘油；显色液（SYBR Green I）；无菌水分管组装成盒即为家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒。 

显色液也可以采用EvaGreen或钙黄绿素。 

实施例2

     应用参照实施例1制备得到的家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒进行检测检测不同浓度梯度的浓核病毒DNA敏感性

本实施例以家蚕浓核病毒BmDNV（由华南农业大学亚热带蚕病防控岗位专家实验室经常规的桑叶添食继代繁殖获得，也可以采用本领域其他实验室所提供的家蚕浓核病毒BmDNV）为材料，以煮沸沉淀法提取的DNA为模板。EDTA购自北京鼎国生物技术有限公司；异丙醇由天津大茂化学试剂厂出品；无水乙醇由天津大茂化学试剂厂出品。

    S1.煮沸沉淀法抽提家蚕浓核病毒BmDNV模板DNA： 

取一条感染家蚕浓核病毒BmDNV的家蚕样品（例如感染所述病毒的死蚕）中肠于研钵中，加1mL的灭菌水将中肠研磨充分后装于1.5mL的灭菌离心管中，10000 r/ min离心10 min，取上清400 μL于1.5mL的灭菌离心管中，并加入400μL抽提缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，pH 8. 0；0.1 mol/L EDTA，pH 8. 0；0. 5% SDS，其余体积用水补足），于100℃水浴锅中煮沸裂解10 min后，取出放于 -20℃冰箱中冷却至室温，10000 r/min离心5 min将变性的蛋白沉淀，另取上清700μL于1.5mL的灭菌离心管中，并加入700μL预冷的异丙醇，置- 20 ℃冰箱中冰冻30 min促进沉淀形成；12000 r/min离心10 min沉淀DNA，并弃去上清；用1mL70%乙醇洗涤沉淀，然后尽量弃去乙醇，自然晾干，使乙醇挥发完全，但不能使沉淀过于干燥，否则很难溶解；加入20μL TE 溶液（10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1mmol/L EDTA，pH 8.0）或灭菌ddH2O溶解沉淀， -20℃保存备用。

    S2.将已测定浓度为15ng/μL的BmDNV ssDNA，进行10倍梯度稀释 

按浓度进行10倍梯度稀释，操作如下：在操作环境良好的情况下，取8个PCR管，每个PCR管中先加入灭菌的去离子水45μL，将盖子盖上，以免各梯度交叉污染，并按从高到低逐个稀释。取5μL初始浓度为的标准品加入到第一个PCR 管中，用移液器反复吸吹后再用振荡器震荡10s使其充分混匀，此时浓度是1.5ng/μL。用离心机瞬时离心后，按照上述方法进行逐个稀释，直至稀释10⁸倍后为止，此时浓度为0.15fg/μL。

    S3.配制反应体系 

以正常家蚕中肠组织DNA为阴性对照，以BmDNV模板DNA或含BmDNV靶基因DNA片段的质粒为阳性对照，以无菌水为空白对照，每个样品使用 200μL的反应管，采用25μL反应体系，如下表所述：

建议：对于N个样品，应配制（N+4）倍体积的反应液（包括空白对照、阴性对照、阳性对照各一个，以免分装耗费误差），保证各反应管分装均匀。

    S4. 加样：分装后，分别依次向反应管加入2μL 的无菌水（空白对照）、正常家蚕组织DNA（阴性对照）、BmDNV模板DNA或含BmDNV靶基因DNA片段的质粒（阳性对照）、稀释后的不同浓度DNA；然后加入甘油20μL密封，在反应管管盖内侧加入1μL显色液，将管盖盖紧（小心注意避免显色液掉入反应液中）。 

    S5. 反应：将反应管置于恒温水浴箱或恒温金属浴中，63℃恒温放置40~60 min；然后 95℃，放置2 min灭活。 

    S6. 结果判读：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，说明待测样品含有家蚕浓核病毒；反应产物变为橙色，则不含家蚕浓核病毒。 

    S7. 检测结果：结果如附图2所示。对照结果正常，结果可信，试剂盒能够检测到浓度为1.5fg/μL 的BmDNV DNA，即将原浓度为15ng/μL的DNA进行10⁷倍稀释后，仍能够有效检测到BmDNV的DNA。 

实施例3 

应用参照实施例1制备得到的家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒进行检测检测家蚕浓核病毒BmDNV不同反应时间的筛选

S1.提取家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA；

生物材料：家蚕浓核病毒，由华南农业大学蚕桑生物技术实验室经桑叶添食家蚕继代繁殖（按照常规实验方法，将一定浓度的病毒液涂布在新鲜桑叶的叶背，然后喂食家蚕，使家蚕感染得病）；EDTA购自北京鼎国生物技术有限公司；异丙醇由天津大茂化学试剂厂出品；无水乙醇由天津大茂化学试剂厂出品。

    步骤S1所述家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA的提取采用煮沸沉淀法，取感染家蚕浓核病毒BmDNV的家蚕中肠于研钵中，加1mL的灭菌水将中肠研磨充分后装于1.5 mL的灭菌离心管中，10000 r/ min离心10 min，取上清400 μL于1.5mL的灭菌离心管中，并加入400 μL抽提缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8. 0；0.1 mol/L EDTA，pH 8. 0；0. 5% SDS），于100℃水浴锅中煮沸裂解10 min后，取出放于 -20℃冰箱中冷却至室温，10000 r/min离心5 min将变性的蛋白沉淀，另取上清700 μL于1.5 mL的灭菌离心管中，并加入700 μL预冷的异丙醇，置-20℃冰箱中冰冻30min促进沉淀形成；12000 r/min离心10 min沉淀DNA，并弃去上清；用1 mL 70%（V/V）乙醇洗涤沉淀，然后尽量弃去乙醇，自然晾干，使乙醇挥发完全，但不能使沉淀过于干燥，否则很难溶解；加入20 μL TE 溶液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1mmol/L EDTA，pH 8.0）或无菌水溶解沉淀，-20℃保存备用。 

    S2.反应时间分别选取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min。 

    S3.配制反应体系 

以正常家蚕组织DNA为阴性对照，以BmDNV模板DNA或含BmDNV靶基因DNA片段的质粒为阳性对照，以无菌水为空白对照，每个样品使用 200μL的反应管，采用25μL反应体系，如下表所述：

建议：对于N个样品，应配制（N+4）倍体积的反应液（包括空白对照、阴性对照、阳性对照各一个，以免分装耗费误差），保证各反应管分装均匀。

    S4.加样：分装后，分别依次向反应管加入2μL 的无菌水（空白对照）、BmDNV模板DNA或含BmDNV靶基因DNA片段的质粒（阳性对照）、家蚕中肠组织DNA（阴性对照）、向设置为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min的反应管的加入BmDNV DNA；然后加入甘油20μL密封，在反应管管盖内侧加入1μL显色液，将管盖盖紧（小心注意避免显色液掉入反应液中）。 

    S5.反应：将反应管置于恒温水浴箱或恒温金属浴中，63℃恒温，分别在放置10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后终止各反应；然后 95℃，放置2 min灭活。 

    S6.结果判读：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，说明待测样品含有家蚕浓核病毒；反应产物变为橙色，则不含家蚕浓核病毒。 

S7.检测结果：结果如附图3所示，对照结果正常，结果可行。试剂盒在反应进行20min后即能够检测到BmDNV的DNA。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒及其检测方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  DF1

 

<400>  1

ataaactcga gtaccgcc                                                   18

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  DB1

 

<400>  2

gatctacgtc agtgataaga ga                                              22

 

 

<210>  3

<211>  38

<212>  DNA

<213>  DFI1

 

<400>  3

gtcacaaggg ccgaataccg cttcaatgcc gcctcaag                             38

 

 

<210>  4

<211>  42

<212>  DNA

<213>  DBI1

 

<400>  4

ggtatctgtc gaggctgcta ctttgaaatt tttgtctgcc at                        42

Claims (10)

1.一种家蚕浓核病毒LAMP可视化快速检测试剂盒，其特征在于，包括一对内侧引物DFI1/ DBI1和一对外侧引物DF1/ DB1，引物序列如SEQ ID NO:1~4所示。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含基因组DNA抽提缓冲液、LAMP反应液、阳性对照品、阴性对照品显色液；

所述LAMP反应液除含有权利要求1所述引物还含有2×LAMP反应缓冲液、Bst DNA 聚合酶、密封液和无菌水。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述2×LAMP反应缓冲液含有20 mM Tris-HCl，pH8.8；10 mM KCl；2 mM MgSO₄；20 mM（NH₄）₂SO₄；0.1% Triton X-100；2.8 mM dNTPs；1M甜菜碱；25mM MgCl₂。

4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述DNA抽提缓冲液含有10 mM Tris-Cl，pH8. 0；0. 1 M EDTA，pH 8. 0；0. 5% SDS（十二烷基硫酸钠）。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为BmDNV模板DNA或含BmDNV靶基因DNA片段的质粒、阴性对照品为正常家蚕组织模板DNA。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述显色液为SYBR Green I 、EvaGreen或钙黄绿素。

7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：

2×LAMP反应缓冲液                    12.5μL；

DFI1/ DBI1（40pmol/μL）               1μL；

DF1/ DB1(5 pmol/μL)                   0.5μL；

Bst DNA 聚合酶（8U/μL）              1μL；

模板DNA                              2μL；

无菌水                                 8.0μL。

8.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的LAMP反应条件为60~65℃恒温反应20~90 min；然后 80~100℃，1~10 min灭活。

9.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述密封液为甘油。

10.一种用权利要求1至9任一项所述试剂盒检测家蚕浓核病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样品DNA；

S2.在反应管中配置反应体系；

S3.向反应体系中加入密封液，在反应管盖内侧加入显色液；

S4.反应：将反应管60~65℃恒温放置20~90 min；然后 80~100℃，放置1~10 min灭活；

S5.结果判读：将显色液与反应产物混合；观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕浓核病毒；反应产物变为橙色，则不含有家蚕浓核病毒。

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