CN103127554B - 一种用于皮肤组织工程的纳米纤维双层支架制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于皮肤组织工程的纳米纤维双层支架制备方法，属于生物医用材料技术领域。采用聚乳酸、壳聚糖、聚己内酯作为支架材料，利用热致相分离和高压静电纺丝技术相结合的方法制备具有纳米纤维结构的多孔双层网络支架。该双层支架的底层为通过热致相分离法制备的聚乳酸纳米纤维支架，其纤维直径在200－750nm之间；表层为通过静电纺丝法制备的壳聚糖-聚己内酯复合纳米纤维膜，其纤维直径在200nm左右。该支架在微观结构上仿生人体皮肤的表皮和真皮双层结构，可应用于人体皮肤的修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于皮肤组织工程的纳米纤维双层支架制备方法，属于生物医用材料技术领域。
背景技术
生物医用材料研究和制备的主要目的是利用各种天然或合成的材料制成人工器官或医疗器械，以替代和修复人体受损的组织器官，最终实现组织器官的正常生理功能。
皮肤作为人体最大的器官，起着保护人体免受外界物体入侵的作用。皮肤的损伤可导致细菌、病原体的入侵，严重者可导致死亡。因此在过去的三十年中，生物医用材料和组织工程领域大量开展了皮肤支架的研究。至今已有多种商品化产品问世，如Integra, Dermagraft等（Priya 等，Tissue Engineering Part B,Reviews,2008;14:105-118）。
人体皮肤为双层结构，由表皮和真皮组成。表皮主要由致密的角化细胞组成，起防护作用；真皮主要由成纤细胞及其分泌的胶原蛋白组成，有较好的弹性和机械强度，在皮肤再生过程中起重要的作用。所以，从仿生的角度看，皮肤支架应为双层结构。商品化的Integra就是由胶原和硅酮制成的双层皮肤替代物（Metcalfe 等, Biomaterials,2007;28:5100-13）；Franco等制备了壳聚糖/明胶水凝胶与聚己内酯/PLGA膜的双层支架（Franco 等, Journal of Materials Science: Materials in Medicine,2011;22:2207-18）； Ma等制备了胶原/壳聚糖的多孔支架与硅酮膜的双层皮肤替代物（Ma 等, Journal of Materials Science: Materials in Medicine,2007;18:2185-91）；中国专利CN101254313公开了一种双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法；美国专利6773723公开了一种胶原/透明质酸的双层皮肤支架。上述双层支架应用于皮肤的修复，取得了良好的效果。但目前文献和公开专利中采用的双层支架多为微米多孔结构，且采用单一的方法制备。最新的组织工程支架研究表明，纳米纤维结构的支架能提供更多的细胞吸附位点，促进细胞的生长（Khang等,Biomaterials,2012;33:5997-6007），因此，纳米纤维的双层支架对于皮肤的修复是一种更好的选择。
发明内容
本发明的主要目的是通过热致相分离和静电纺丝的复合技术，制备聚乳酸/壳聚糖-聚己内酯纳米纤维双层仿生支架。通过优化支架的组成和微观结构，制得生物学性能优良的皮肤组织工程支架，以用于人体皮肤的修复。
本发明的纳米纤维双层支架的制备方法具体如下。
(1) 配制聚乳酸的四氢呋喃溶液，质量浓度在5－10％之间。搅拌均匀后放入预冷的成型模具中。
(2) 在－18 ℃条件下，将溶液冷冻12小时以上，制得聚乳酸凝胶。在4℃条件下水置换2天，去除四氢呋喃。
(3) 将水置换后的聚乳酸凝胶再次在－18 ℃条件下冷冻12小时后，在－60 ℃，压力低于30 Pa的条件下冷冻干燥3天，制得纳米纤维聚乳酸支架。
(4) 配制壳聚糖的三氟乙酸溶液，质量浓度在5－12％之间。配制聚己内酯的三氟乙醇溶液，质量浓度在10－30％之间。
(5) 将制得的聚乳酸纳米纤维支架用导电双面胶贴在铝箔上，铝箔接地。按一定质量配比均匀混合壳聚糖的三氟乙酸和聚己内酯的三氟乙醇溶液，倒入一个3 ml的针管中，固定针管和基底聚乳酸支架的距离20 cm， 针管通以10－20 kV的高压电，高压静电推动壳聚糖和聚己内酯的混合溶液形成壳聚糖-聚己内酯纳米纤维，贴附在聚乳酸支架的表面，静电纺丝一定时间后制得纳米纤维结构的双层支架。
(6) 制得的双层支架在0.1 mol/L的氨水溶液中浸泡20分钟，去除支架残留的三氟乙酸及三氟乙醇，然后用大量蒸馏水冲洗干净，重新冷冻、冻干，最后经环氧乙烷消毒后可用于细胞培养和组织修复。
本发明制得的三维多孔网络状皮肤支架呈白色，具备纳米纤维的双层结构。其中，表层的壳聚糖-聚己內酯纤维直径约为200 nm，适合角化细胞的生长；底层的聚乳酸纤维直径约在200-750 nm之间，适合成纤细胞的生长。其具体的微观形貌详见说明书附图。
本发明中，所选材料均为生物相容性好的合成或天然聚合物，制备方法简单可行，且制得的双层纳米纤维支架，从结构上仿生人体皮肤的结构，可用做人体皮肤的修复。
附图说明
图1：纳米纤维双层支架微观结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明方法作进一步的说明，但本发明的实现方式并不局限于此。
称取0.6 g聚乳酸，在50 ℃下溶解于10 ml四氢呋喃中。将溶液倒入称量瓶中，放置在－18 ℃的冰柜中过夜，形成聚乳酸凝胶。将凝胶在4℃条件下水置换2天，每天换水3次，去除四氢呋喃溶剂。将水置换后的聚乳酸凝胶再次在－18 ℃条件下冷冻12小时后，将凝胶放入真空干燥机中冻干3天。取出后切成厚度为1 mm左右的纳米聚乳酸薄片并将该薄片用导电双面胶贴在铝箔上。称取0.7 g壳聚糖粉末，加入10 ml三氟乙酸。在70 ℃回流条件下，溶解壳聚糖。称取1.8 g聚己内酯，常温下溶解于10 ml三氟乙醇中。各取1g壳聚糖的三氟乙酸溶液和聚己内酯的三氟乙醇溶液，混合均匀后，加入到一个3 ml的针管中，通以15 kV的高压静电，针管与纳米聚乳酸薄片的距离为20 cm，高压静电推动壳聚糖-聚己内酯的混合溶液形成纳米纤维贴附在接地的纳米聚乳酸薄片上，纺丝30分钟可得到纳米纤维结构的双层支架。将双层支架浸泡在0.1 mol/L的氨水溶液中20分钟, 去除残留的溶剂，再用大量的蒸馏水冲洗干净，重新冷冻，冻干，用环氧乙烷消毒后备用。
Claims (6)
1.一种用于皮肤组织工程的纳米纤维双层支架制备方法，其特征在于包括如下操作步骤：
(a) 底层纳米纤维聚乳酸支架的制备
一定质量的聚乳酸溶解于溶剂后，放入成型玻璃模具中，在－18 ℃条件下，将溶液冷冻制得聚乳酸凝胶，在4 ℃条件下，水置换去除凝胶中的溶剂，将水置换后的凝胶再次冷冻后，在冷冻干燥机中制得纳米纤维聚乳酸底层支架；
(b) 纳米纤维双层支架的制备
分别配制一定浓度的壳聚糖溶液和聚己内酯溶液，按照一定的质量配比，均匀混合壳聚糖和聚己内酯溶液，混合溶液放入一个针管中， 针管通以高压静电，已制得的纳米纤维聚乳酸底层支架用导电双面胶贴在铝箔上，铝箔接地，高压静电推动壳聚糖-聚己内酯的混合溶液形成纳米纤维贴附在聚乳酸支架的表面，纺丝一定时间后可制得纳米纤维双层皮肤支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于复合使用热致相分离和高压静电纺丝技术制备得到纳米纤维双层支架。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所使用的聚乳酸，分子量在5～10万之间，溶剂为四氢呋喃，聚乳酸的质量浓度在5～10％之间。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于使用的壳聚糖，分子量在15～40万之间，溶剂为三氟乙酸，质量浓度在5～12％之间； 使用的聚己内酯，分子量在7～9万之间，溶剂为三氟乙醇，质量浓度在10～30％之间。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于静电纺丝溶液为壳聚糖的三氟乙酸溶液和聚己内酯的三氟乙醇溶液的混合物，其中壳聚糖溶液与聚己内酯溶液的质量比范围为0.25～4之间。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于高压静电纺丝的电压在10～20 kV之间。
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