CN103122344A - 补料发酵生产破胶生物酶的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用补料工艺提高复合菌发酵生产生物破胶酶工艺中酶的产率的方法，在控制pH及通气量条件下，通过控制补料的时间及补料溶液组成，可有效地缩短发酵周期，提高发酵周期内复合破胶酶的产率，从而降低了发酵工艺的成本。补料工艺中补料溶液主要由碳源和无机盐组成，其中碳源为胍胶、葡萄糖、蔗糖或葡萄糖与蔗糖的混合液；无机盐则包含硫酸镁、磷酸氢二钾、硝酸钾及氯化钠。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用补料工艺提高复合菌发酵生产生物破胶酶工艺中酶的产率的方法，其技术方案属于发酵工程技术领域。
背景技术
胍胶(Guar gum)提取自瓜尔豆种子的内胚乳，属于天然半乳甘露聚糖，由半乳糖和甘露糖聚合而成，是迄今为止发现的最好的天然高分子化合物之一。胍胶是中性多糖，一般分子量约20-30万Da，由于产地不同，瓜儿胶的分子量可达到100-200万Da。胍胶呈奶白色或淡黄色、自由流动粉末状，几乎无味，能溶于冷水或热水中形成溶胶，天然溶液pH在6-8之间。由于其具有较大的水作用力和特有的分子间的相互缠绕作用，胍胶在水基溶液中能产生极高的粘度，在低浓度下，可形成高粘稠溶液；表现出非牛顿流变特性，与硼砂形成酸可逆凝胶，是重要的增稠剂、乳化剂、稳定剂、絮凝剂，在食品、采油、日化、医药等领域有着广泛的应用。胍胶的这些特性使得它被广泛地应用于石油天然气开采领域。采用压裂的方式对油井尤其是低渗-特低渗油井进行改造，是提高油田采收率的重要措施之一，其压裂效果的好坏会直接影响增产的效果。目前以胍胶为稠化剂的水基压裂液体系为主要应用的体系，具有价廉、安全、操作弹性大，综合性能好以及应用范围广等优点，占据了整个压裂份额的95％以上。破胶剂是压裂施工中非常重要的物质之一，其主要作用是将地层裂缝形成以后将高粘度压裂液冻胶彻底水化，以便使压裂液返排和支撑剂留在裂缝里，形成一定的裂缝和孔隙渗透率，达到压裂增产的目的，因此，压裂液破胶程度的好坏直接影响到压裂效果的好坏。
胍胶降解的方法主要有物理法和生物酶法，后者由于其具有的环保、高效等特点，成为了目前国内外研究的热点。研究内容大多集中在甘露聚糖酶方面，尤其是这种酶在饲料等行业的应用，例如CN200610073160.4描述了一种主要在饲料行业应用的β-甘露聚糖酶及其表达方法与生产用的专用工程菌。CN200710121923.2描述了一种具有耐热耐酸性的β-甘露聚糖酶的制备方法。CN200810136843.9涉及一种产甘露聚糖酶的工程菌及其生产工艺。CN99808877.3和CN200610106884.4则涉及了一种新的甘露聚糖酶，提示其可以用于胍胶压裂液中破胶。CN200910164483.8则涉及一种生物酶制剂配制压裂液的配方，所用的制剂蛋白酶、纤维素酶、木瓜酶等多种生物酶产品。CN200910254406.1涉及的则是一种生物酶破胶剂进行水基胍胶压裂液破胶的配方及工艺，所用的生物酶是β-甘露聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、葡聚糖酶和黄原胶酶等生物酶产品。采用现成的生物酶产品配制压裂液，势必造成压裂的成本大幅升高，从而影响现场应用。
研究还表明，胍胶的酶法处理应用的酶主要有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶或半乳糖醛酸酶，并根据目的产物不同而进行不同方式的酶解。
迄今为止，采用复合菌液态深层发酵直接生产胍胶破胶酶用于石油天然气开采领域的技术方案尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种补料工艺用复合菌发酵生产破胶复合酶的方法，该方法通过补加碳源为胍胶、葡萄糖、蔗糖或葡萄糖与蔗糖的混合液，无机盐则包括硫酸镁、磷酸氢二钾、硝酸钾及氯化钠的混合液的补料溶液得以实现，从而解决了分批发酵中复合破胶酶产率较低的问题，显著提高了复合破胶酶的产率，缩短了发酵时间，降低了生产成本。
本发明所针对的复合菌发酵产生复合破胶酶的工艺，发酵所采用的菌种均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，并标明了购买时的菌种编号；工艺中所采用的方法若无特别说明，均为常规方法。
本发明采用的具体的技术方案是：
一、发酵所采用复合菌种的制备及活化
本发明采用枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus (CICC 23659))、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus ATCC 2(CICC 10352))、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans ATCC 4516(CICC 103532)作为菌种，此复合菌种经种子培养后，作为本发明所采用的菌种。
二、初发酵培养基的制备
三、补料液的制备及补料方式
补料液主要由碳源及无机盐组成。其中碳源为胍胶、葡萄糖、蔗糖或葡萄糖与蔗糖的混合液；无机盐则包含硫酸镁、磷酸氢二钾、硝酸钾及氯化钠。
在控制pH及通气量条件下，在初发酵后的一定时间内开始流加补料溶液，之后再发酵，得到复合酶。
研究表明，本发明所采用复合菌发酵可以同时生产α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶，α-半乳糖苷酶主要水解瓜胶侧链，β-甘露糖苷酶水解主链，其综合作用的结果是粗酶液可以直接用于水基压裂工艺，大幅度降低了生物酶法胍胶破胶的成本，具有良好的应用前景。
与现有技术相比，本发明通过控制流加补料的时间及补料溶液组成，可有效地提高发酵周期内复合破胶酶的产率，缩短发酵周期，降低了发酵工艺的成本。再通过添加CN201110195159.X所提供的复合生物酶的保护剂，可以有效地提高复合酶的稳定性，所生产的粗酶液可以直接用于胍胶的破胶，适用于石油行业的压裂破胶工艺。
具体实施方式
下述实施例中的方法，若无特别说明，均为常规方法。
实施例一：实验菌种：
本实验采用枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus(CICC 23659))35-45％、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC 2(CICC 10352))25-35％、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans ATCC4516(CICC 103532)5-35％(以上均为质量百分比浓度)作为菌种。
实施例二：菌种培养基的制备及种子的培养(浓度均为质量百分比浓度)
瓜儿胶0.4％，葡萄糖0.1％，酵母浸粉0.1％，蛋白胨0.1％，硫酸镁1.25％，磷酸氢二钾2.5％，硝酸钾3.5％，4％氯化钠，pH为7左右，120℃灭菌15min。
制得的复合菌种分别经接种、一级菌种培养，使菌数含量达108个/ml，然后再按上述菌种配比混合并经二级菌种培养，使菌数含量达5-9×109个/ml，即得复合菌剂，作为本发明的发酵菌种。
实施例三：初发酵培养基制备
酵母抽提物20g/L，胍胶20g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硝酸钾2.5g/L，氯化钠2g/L，pH为7左右。
实施例四：补料溶液的制备
补料溶液中碳源为胍胶、葡萄糖、蔗糖或葡萄糖与蔗糖的混合液；无机盐则包含硫酸镁、磷酸氢二钾、硝酸钾及氯化钠。其具体的浓度可以为：
1.胍胶30g/L，葡萄糖40g/L，硫酸镁2.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，硝酸钾3g/L，氯化钠3g/L；
2.胍胶30g/L，蔗糖40g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸氢二钾3.5g/L，硝酸钾3g/L，氯化钠4g/L；
3.胍胶60g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，硝酸钾4g/L，氯化钠4.5g/L；
4.葡萄糖60g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸氢二钾3.5g/L，硝酸钾3g/L，氯化钠4.5g/L；
5.葡萄糖30g/L，蔗糖30g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，硝酸钾3g/L，氯化钠4g/L；
6.胍胶30g/L，葡萄糖30g/L，蔗糖20g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，硝酸钾3g/L，氯化钠4g/L；
实施例五：复合破胶酶酶活力的测定方法
参照Akino等的方法，取0.9mL0.5％槐豆胶(Sigma)(用pH＝6.5，0.05mol/LPBS配制)于比色管中，加入适当稀释酶液0.1mL，70℃水浴反应10min，采用DNS法测定水解所产生的还原糖。在上述反应条件下，每分钟产生1μmol相当于D-甘露糖的还原糖所需酶量为1U(一个酶活力单位)。
实施例六：补料发酵工艺及粗酶液的制备之一
按体积分数5％的接种量接二级种子于配置好的初发酵培养基中，40L发酵罐装料20L，pH7.0，温度30℃转速350r/min，通气量10vvm，发酵8h，开始流加补料，补料液组成为实例四中之一，补料后再发酵8h。
发酵液于9000r/min条件下离心20min，取上清液即为复合酶液，测得产酶量可达182-220U/mL。
实施例七：补料发酵工艺及粗酶液的制备之二
按体积分数5％的接种量接二级种子于配置好的初发酵培养基中，40L发酵罐装料25L，pH7.0，温度30℃转速350r/min，通气量10vvm，发酵10h，开始流加补料，补料液组成为实例四中之一，补料后再发酵6h。
发酵液于9000r/min条件下离心20min，取上清液即为复合酶液，测得产酶量可达195-231U/mL。
Claims (6)
1.一种补料发酵生产破胶生物酶的工艺其特征在于：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus cereus(CICC 23659))、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC2(CICC 10352))、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans ATCC 4516(CICC 103532)复合制成复合菌种，此复合菌种经种子培养后，接种于初发酵培养基中，在控制pH及通气量条件下，进行初发酵然后开始流加补料溶液，进行补料发酵，得到破胶用复合生物酶。
2.根据权利要求1所述的补料发酵工艺，其特征在于复合菌种在初发酵培养基中进行初发酵6-8小时后，开始流加补料，之后再进行6-8小时的发酵。
3.根据权利要求1所述的补料发酵工艺，其特征在于所流加的补料溶液的碳源为胍胶、葡萄糖、蔗糖或葡萄糖与蔗糖的混合液。
4.根据权利要求1所述的补料发酵工艺，其特征在于所流加的补料溶液中无机盐溶液包括硫酸镁、磷酸氢二钾、硝酸钾及氯化钠。
5.根据权利要求3所述的补料溶液的碳源，其特征在于组成为胍胶30-60g/L、葡萄糖30-60g/L、蔗糖20-30g/L或葡萄糖与蔗糖的混合液。
6.根据权利要求4所述的补料溶液的无机盐溶液，其特征在于浓度为硫酸镁1.5-2g/L、磷酸氢二钾2.5-3.5g/L、硝酸钾3-4g/L及氯化钠3-4.5g/L。
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|---|---|---|---|---|
| CN103980874A (zh) * | 2014-05-07 | 2014-08-13 | 陕西省石油化工研究设计院 | 一种瓜胶压裂液破胶剂及其制备方法和应用 |
| CN113337267A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-09-03 | 大连知微生物科技有限公司 | 一种生物酶破胶剂在高矿化度水基压裂液产品中的应用及压裂液产品 |
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