CN103110932B - 一种hip-55的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HIP-55的新用途。本发明提供的HIP-55蛋白、HIP-55蛋白编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体或含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒在制备具有如下1)或2)功能的产品中的应用:1)抑制心脏成纤维细胞增殖;2)抑制P38MAPK激酶活性;所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明,本发明发现HIP-55在大鼠不同器官中都有表达,尤其心脏中有高水平的表达,进一步异丙肾上腺素(ISO)诱导,在乳大鼠心肌成纤维细胞中过表达HIP-55明显抑制心脏成纤维细胞增殖;在过表达HIP-55心脏成纤维细胞中能够抑制ISO诱导的P38MAPK的激活以及激酶活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种HIP-55的新用途。
背景技术
HIP-55(hematopoietic progenitor kinase 1[HPK1]-interacting protein of55kDa;也称为drebrin-like protein、mAbp1或SH3P7)是一个包含多功能域的蛋白质。其结构主要包含着N端的F-actin蛋白结合结构域和C端SH3结构域。HIP-55参与突触发生、受体内吞、骨架重排及信号转导。目前对HIP-55功能了解较少尚无对HIP-55在心血管系统方面的研究报道。
心血管疾病是中国居民健康的“头号杀手”,每年主要用于心血管病的直接医疗费用已达1300亿元人民币。心肌纤维化是心脏重塑的重要病理改变,是指在心肌的正常组织结构中心肌成纤维细胞过度分裂,胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变,引起心肌僵硬度增加、舒缩功能受限,严重影响心脏的功能。这种病理变化在多种心血管疾病中存在,与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关。心肌纤维化是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键,其严重程度和疾病的发生发展及预后密切相关。因此,预防和逆转心肌纤维化具有重要的意义。大量研究表明儿茶酚胺-肾上腺素系统过度激活是促心肌纤维化的重要因素,儿茶酚胺(如异丙肾上腺素isoproteronol,Iso)通过β-ARs促进心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加,从而导致心肌纤维化、心脏功能的恶化和心衰的形成。同时β-ARs阻滞剂能够显著改善患者的预后。
发明内容
本发明的目的是提供HIP-55蛋白、HIP-55蛋白编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体或含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒的新用途。
本发明提供的HIP-55蛋白、HIP-55蛋白编码基因或含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体或含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒在制备具有如下1)或2)功能的产品中的应用:
1)抑制心脏成纤维细胞增殖;
2)抑制P38MAPK激酶活性;
所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
上述抑制心脏成纤维细胞增殖和所述抑制P38MAPK激酶活性均在(异丙肾上腺素)ISO诱导下进行。
上述抑制心脏成纤维细胞增殖是在ISO诱导下进行;所述抑制心脏成纤维细胞增殖具体通过如下1)或2)体现:
1)在ISO诱导下减少心脏成纤维细胞Brdu参入量;
2)在ISO诱导下减少心脏成纤维细胞CCK8吸光值。
上述抑制P38MAPK激酶活性是在ISO诱导下进行;抑制P38MAPK激酶活性通过降低P38MAPK激酶底物ATF-2的磷酸化水平体现。
上述应用中,所述HIP-55蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
上述应用中,所述含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体为重组腺病毒载体;
在本发明的实施例中,上述重组腺病毒载体为将HIP-55蛋白编码基因与Flag-IRES/DesRedE2融合成为HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2基因后插入pAd/CMV/V5-DEST中,得到的重组腺病毒载体pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2。
所述含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒为将所述含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体转染细胞,包装得到的腺病毒。
上述应用中,所述产品为药物。
上述应用中,所述心脏成纤维细胞为离体心脏成纤维细胞。
上述应用中,所述抑制心脏成纤维细胞增殖是通过抑制P38MAPK激酶活性实现。
本发明的实验证明,本发明发现经异丙肾上腺素(ISO)诱导,在乳大鼠心肌成纤维细胞中过表达HIP-55明显抑制心脏成纤维细胞增殖,与之相反,应用RNAi方法knock down HIP-55明显促进心脏成纤维细胞增殖;在过表达HIP-55心脏成纤维细胞中能够抑制ISO诱导的P38MAPK的激活以及激酶活性,而在Knock-down HIP-55心肌成纤维细胞中能够增强ISO诱导的P38MAPK的激活以及激酶活性;发现HIP-55是一种新的对心脏纤维化具有保护作用的蛋白质,为临床诊断、治疗及新药开发提供了新的靶点。
附图说明
图1为过表达HIP-55蛋白质表达水平的检测
A为携带Dserd-HIP-55基因腺病毒及携带Dserd基因的对照腺病毒转染效率的检测;B为过表达HIP-55蛋白质表达水平的检测
图2为HIP-55shRNA敲减HIP-55蛋白质表达水平的检测
图3为HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖(Brdu法)
A为过表达HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖;B为敲减HIP-55促进心肌成纤维细胞增殖
图4为HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖(CCK8法)
A为过表达HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖;B为敲减HIP-55促进心肌成纤维细胞增殖
图5为ISO通过p38MAPK诱导的心脏成纤维细胞增殖
图6为HIP-55抑制心脏成纤维细胞P38MAPK激酶活性
A和B为过表达HIP-55抑制心肌成纤维细胞P38MAPK激酶活性;C和D为敲减HIP-55增强心肌成纤维细胞P38MAPK激酶活性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中定量试验均重复三次,结果取平均值。
鼠HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2,编码该蛋白的基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
下述实施例采用的离体乳大鼠心脏成纤维细胞通过如下方法获得:
实验用SD乳大鼠购自北京大学医学部实验动物部,完全遵照北京大学医学部实验动物相关伦理学标准;采用酶消化和差速贴壁方法进行分离培养;细胞在含有10%胎牛血清(Biochrom AG,Berlin,Germany)的高糖DMEM(Hyclone,Logan,UT)培养基里,其中添加100μg/ml链霉素及100U/ml青霉素,置于37℃的5%CO2孵箱里培养,具体如下:
出生1-3天内的SD乳大鼠,浸没于75%酒精;眼科剪开胸取心脏;置于冰冷的Hank’s缓冲液中剪除心房部分并洗涤两次。转移到10ml血清瓶中,剪碎组织后Hank’s缓冲液再洗涤两次。弃去上清;加入4mL0.1%胰蛋白酶置于37℃水浴中平缓搅动消化,每次4min,弃去前两次细胞悬液。继续进行6-8次消化,收集细胞悬液,加入含4mLDMEM完全培养基(含10%胎牛血清)的离心管中,1000rpm×5min离心,取4mL DMEM完全培养基洗涤细胞沉淀,再次重悬离心。最后合并收集细胞,接种于10cm培养皿,37℃、5%CO2培养箱静置培养2小时。吸取未贴壁的心肌细胞悬液,已贴壁的成纤维细胞用DMEM洗涤后,加入DMEM完全培养基进行培养。长满后传代,实验选用第二代离体心脏成纤维细胞。
下面实施例采用的抗体如下:Anti-EIF5(Santa cruz公司;货号:c-282)、Anti-P38MAPK(santa cruz公司;货号:sc-7194)、Anti-phospho-P38MAPK(cell signaling;货号:#9211s)。
实施例1、HIP-55shRNA、过表达HIP-55的重组腺病毒和RNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒的获得
一、HIP-55shRNA的获得
针对鼠HIP-55蛋白编码基因设计并合成如下HIP-55shRNA和对照Control shRNA如表1所示:
HIP-55shRNA,其核苷酸序列为序列表中序列3,其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4;
设计Control shRNA:其核苷酸序列为序列表中序列5,其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列6;
表1为shRNA及其对照序列
二、过表达HIP-55重组腺病毒的构建及制备
1、过表达HIP-55重组腺病毒载体的构建
利用重叠延伸PCR扩增attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2
利用重叠PCR扩增:以序列表中序列1所示的HIP-55核苷酸为模板,使用引物attB1-HIP-55和HIP-55-Flag-IRES-R(序列见表2)进行PCR扩增;以IRES/DesRed为模板,使用引物Flag-IRES-F和DesRedE2-attB2(序列见表2)进行PCR扩增;分别回收两个PCR产物;再以两个PCR产物为模板,用引物:attB1-HIP-55和DesRedE2-attB2进行融合PCR,得到2656bp的PCR产物(该PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列7,序列表中序列7自5’末端第36-1334位核苷酸为序列1自5’末端第1-1299位核苷酸),命名为attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2。
表2为重叠PCR扩增引物
引物名称 | oligo序列5’to3’ |
attB1-HIP-55 | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCGGTGAACCTGAGC |
HIP-55-Flag-R | CTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCTATGAGCTCCACATAGT |
Flag-IRES-F | ACGACGATGACAAGTAGGCCCCTCTCCCTCCCCC |
DesRedE2-attB2 | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTACTGGAACAGGTGGTGGC |
重叠PCR扩增反应体系及扩增程序如下:反应体系:
补加ddH2O至总体积50μl
扩增程序:
98℃ 3min
98℃,10s;60℃,10s;72℃,3min;
30个循环
72℃ 5min
6×loading buffer终止反应;
将上述2665bp的PCR产物利用Gateway clone构建重组载体pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2,具体如下:
25℃,BP反应3h。
反应体系:
加入蛋白酶K终止反应10min,得到BP反应产物,将BP反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中,挑取单克隆摇菌并提取质粒,质粒为将attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2(序列7)插入pDONR221中得到的中间载体,命名为pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2。
利用Gateway clone构建pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2,具体如下:
将中间载体pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2和母载体质粒pAd/CMV/V5-DEST进行LR反应,体系如下:
25℃,LR反应3h,加入蛋白酶K终止反应10min,得到LR反应产物,将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中,挑取单克隆摇菌并提取质粒,质粒为将attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2编码基因(序列7)插入pAd/CMV/V5-DEST中,得到腺病毒表达载体,命名为pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2。
2、对照病毒腺病毒表达载体pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2的构建
pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2为将Flag-IRES/DesRedE2(序列表中序列7自5’末端第1335-2627位核苷酸)构建到pAd/CMV/V5-DEST中得到的载体;
1)利用引物flag+DsRed-F和attB2+DsRed为引物(序列见表3),序列表中序列7自5’末端第1335-2627位核苷酸所示的DNA分子为模板PCR扩增获得1293bpflag-IRES-DsRed Express2片段;
2)利用引物attB1-K-Flag和attB2+DsRed为引物,flag-IRES-DsRed Express2片段为模板PCR扩增获得1357bpattB1-flag-IRES-DsRed Express2-attB2片段。
3)BP反应
采用上述1的方法,将attB1-flag-IRES-DsRed Express2-attB2片段通过BP反应插入pDONR221载体中,构建pDown-flag/IRES/DsRed Express2;
4)LR反应
采用上述1的方法,将attB1-flag-IRES-DsRed Express2-attB2片段通过LR反应插入pAd/CMV/V5-DEST载体中得到pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2。
表3为引物序列
4、过表达HIP-55重组腺病毒的获得
将上述获得的过表达HIP-55重组腺病毒载体pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2转入HEK293A细胞(美国ATCC,产品目录号CRL-1573TM),包装得到过表达HIP-55重组腺病毒(命名简称:Dsred-HIP55)。
将上述获得的空腺病毒载体pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2转染HEK293A细胞,包装得到pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒(命名简称:Dsred)。
5、验证
1)转染
将上述步骤4制备5×106pfu过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)和5×106pfu pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒(Dsred)转染离体心脏成纤维细胞,得到感染过表达HIP-55重组腺病毒的细胞和感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRedExpress2腺病毒细胞。
2)倒置荧光显微镜观察转染效率
应用倒置荧光显微镜选用绿色激发块(激发红色荧光)观察转染效率,结果如图1的A所示,过表达Dsred-HIP-55病毒及Dsred病毒转染效率达到95%以上。
3)Western blot验证
A、心脏成纤维细胞蛋白提取
分别收获感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)的细胞、感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒(Dsred)细胞和离体心脏成纤维细胞,冷PBS洗细胞二次(样本欲检测磷酸化AMPK时则不洗,直接加裂解液),60mm培养皿中加入100μl细胞裂解液(20mmol/L Tris-HCl PH7.4,150mmol/L NaCl,2.5mmol/LEDTA,50mmol/L NaF,0.1mmol/L Na4P2O7,1mmol/L Na3VO4,1%Triton X-100,10%glycerol,0.1%SDS,1%deoxycholic acid,1mmol/L PMSF,and1μg/ml aprotinin)裂解细胞10分钟,用细胞刮刮下并移入Ep管中,超声处理后于4℃,12,000g离心15min,所得上清液冻存于-70℃。蛋白定量采用BCA方法,所得上清液冻存于-70,得到感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)的细胞蛋白、感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒(Dsred)细胞蛋白和离体心脏成纤维细胞蛋白。
B、Western blot
将上述A得到的感染过表达HIP-55重组腺病毒(简称:Dsred-HIP55)细胞蛋白、感染pAd.-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒(简称:Dsred)细胞蛋白和离体心脏成纤维细胞蛋白进行Western blot检测,一抗为Anti-HIP-55(BD公司;货号:612614,稀释度1:1000),二抗为辣根过氧化物酶标记(中杉金桥公司,货号ZB-2305,稀释度1:4000)。
结果如图1B所示,与感染pAd.-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒(Dsred)细胞相比,感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)的细胞内的HIP-55蛋白有强表达。
感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒(Dsred)细胞和离体心脏成纤维细胞结果无显著差异。
三、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒
1、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒载体的构建
shRNA的扩增引物为shHIP-55-F和shHIP-55-R;
对照shRNA的扩增引物为Control-F和Control-R;
表4为shRNA相关引物序列
oligo名称 | oligo序列5’to3’ |
shHIP-55-F | TCTTTGGCATGTTTCCTGCCAACTCGAGTTGGCAGGAAACATGCCAAAGTTTTTC |
shHIP-55-R | TCGAGAAAAACTTTGGCATGTTTCCTGCCAACTCGAGTTGGCAGGAAACATGCCAAAGA |
Control-F | TGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGCGCTTTTTC |
Control-R | TCGAGAAAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGCGCA |
shpDwon-HIP-55的构建Oligo DNA的退火
a)把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配置成50μM,溶解Annealing Buffer forDNA Oligos(5×),混匀备用。
b)设置反应体系:
设置PCR仪进行退火反应:
95℃ 2min
每8s下降0.1℃,降至25℃ 约90min
4℃ 长时间保存
退火产物-20℃保存,得到退火的shHIP-55Oligo DNA(核苷酸序列为序列4,)。
(2)、酶切载体shpDown-MCS
a)酶切体系:
b)37℃酶切3h。
c)6×loading buffer终止反应,1%的琼脂糖凝胶电泳并切胶回收约3043bp的载体片段。
3)连接
a)连接体系:
b)16℃连接过夜,将连接产物转化stb13感受态细菌,菌落PCR筛选阳性重组子。
PCR鉴定引物:
shpDown-flank-f:AGCTACATTTTACATGATAGGCTT
shpDown-flank-r:AGCGAGCTTATCGATACCGT
得到234bp的为阳性重组子;提取质粒送去测序,测序引物:shpDown-flank-f:AGCTACATTTTACATGATAGGCTT,结果该质粒为将shRNA HIP-55(Rat)的编码基因(退火的shHIP-55Oligo DNA)插入shpDown-MCS中得到的载体,命名为shpDwon-HIP-55。
2)shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-HIP-55
利用Gateway Technology构建shpAd-HIP-55,具体如下:
LR反应体系:
反应条件:25℃,16h。
加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10min,得到LR反应产物。
将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中,挑取挑取单克隆摇菌小量提取质粒,送去测序,测序引物:pAd/PL-flank-f:GGCCGCTAGCGACATCGATC和pAd/PL-flank-r:CCTTAAGCCACGCCCACAC,结果为该质粒为将shRNA HIP-55(Rat)的编码基因(退火的shHIP-55Oligo DNA)插入pAd/PL-Dest中得到的载体,将该质粒命名为shpAd-HIP-55。
2、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒的获得
将上述获得的shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-HIP-55转入HEK293A细胞,包装得到shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(简称KD1)。
3、对照shRNA干扰重组腺病毒
1)对照shRNA干扰重组腺病毒载体shpDown-Scramble的构建
(1)Oligo DNA的退火
a)把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配置成50μM,溶解Annealing Buffer forDNA Oligos(5×),混匀备用。
b)设置反应体系:
设置PCR仪进行退火反应:
95℃ 2min
每8s下降0.1℃,降至25℃ 约90min
4℃ 长时间保存
c)退火产物-20℃保存,得到和退火Control Oligo DNA(核苷酸序列为序列6,)。
(2)酶切载体shpDown-MCS
a)酶切体系:
b)37℃酶切3h;
d)6×loading buffer终止反应,1%的琼脂糖凝胶电泳并切胶回收3kb的载体片段。
3)连接
a)连接体系:
b)16℃连接过夜,将连接产物转化stb13感受态细菌,菌落PCR筛选阳性重组子。
PCR鉴定引物:
shpDown-flank-f:AGCTACATTTTACATGATAGGCTT
shpDown-flank-r:AGCGAGCTTATCGATACCGT
得到230bp的为阳性重组子;提取质粒送去测序,测序引物:shpDown-flank-f:AGCTACATTTTACATGATAGGCTT,结果该质粒为将Control shRNA编码基因(退火ControlOligo DNA)插入shpDown-MCS中得到的载体,命名为shpDown-Scramble。
2)Scramble干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-Scramble
利用Gateway Technology构建shpAd-Scramble,具体如下:
LR反应体系:
反应条件:25℃,16h。
加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10min,得到LR反应产物。
将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中,挑取挑取单克隆摇菌小量提取质粒,送去测序,测序引物:pAd/PL-flank-f:GGCCGCTAGCGACATCGATC和pAd/PL-flank-r:CCTTAAGCCACGCCCACAC,结果为该质粒为将Control shRNA编码基因(退火ControlOligo DNA)插入pAd/PL-Dest中得到的载体,将该质粒命名为shpAd-Scramble。
3)、对照shRNA干扰重组腺病毒
将上述步骤2)得到的获得的对照shRNA干扰重组腺病毒载体shpAd-Scramble转入HEK293A细胞,包装得到对照shRNA干扰重组腺病毒(简称scramble)。
4、验证
1)转染
将上述步骤2制备shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)和步骤3制备对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)、pAd/PL-Dest腺病毒(将空载体pAd/PL-Dest转入HEK293A细胞,包装得到的腺病毒)转染离体心脏成纤维细胞,得到shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒的细胞、感染对照shRNA干扰重组腺病毒细胞和感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞。
2)转录水平验证
将上述shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)细胞和感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞分别提取RNA,反转录得到cDNA作为模板,用表5中的HIP-55)F和HIP-55)R为引物进行RT-PCR扩增。以感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞和正常的离体心脏成纤维细胞为对照。
表5为引物序列
引物名称 | 引物序列 |
HIP-55)F | TGCGAAAAGGAGCATGTGCCAA |
HIP-55)R | GGCAACCTTCTCCATGATGCAC |
内参GAPDH Forward | CCTTCCGTGTTCCTACCC |
内参GAPDH Reverse | CCTTCCGTGTTCCTACCC |
结果如表6所示,可以看出,与感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞相比,shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)的细胞中的HIP-55表达受到抑制;表明HIP-55shRNA在成纤维细胞中敲减HIP-55。
感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞和正常的离体心脏成纤维细胞结果无显著差异。
表6为RT-PCR鉴定HIP-55shRNA干扰率
3)Western blot验证
A、心脏成纤维细胞蛋白提取
分别收获感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)的细胞、感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞细胞、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞和离体心脏成纤维细胞,冷PBS洗细胞二次(样本欲检测磷酸化AMPK时则不洗,直接加裂解液),60mm培养皿中加入100μl细胞裂解液(20mmol/L Tris-HCl PH7.4,150mmol/L NaCl,2.5mmol/L EDTA,50mmol/L NaF,0.1mmol/L Na4P2O7,1mmol/L Na3VO4,1%Triton X-100,10%glycerol,0.1%SDS,1%deoxycholic acid,1mmol/L PMSF,and1μg/mlaprotinin)裂解细胞10分钟,用细胞刮刮下并移入Ep管中,超声处理后于4℃,12,000g离心15min,所得上清液冻存于-70℃。蛋白定量采用BCA方法,所得上清液冻存于-70,得到感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)的细胞蛋白、感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞蛋白、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞蛋白和离体心脏成纤维细胞蛋白。
B、Western blot
将上述A得到的感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)的细胞蛋白、感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞蛋白、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞蛋白和离体心脏成纤维细胞蛋白进行Western blot检测,一抗为Anti-HIP-55(BD公司;货号:612614)、Anti-GAPDH(santa cruz公司;货号:sc-32233)(稀释度均1:1000),二抗为辣根过氧化物酶标记(中杉金桥公司,货号ZB-2305)(稀释度1:4000)。
结果如图2所示,上图为电泳图,下图为定量统计结果;与感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞相比,感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)的细胞内的HIP-55蛋白表达明显减低,降低率在70%。感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞和正常的离体心脏成纤维细胞结果无显著差异。
进一步表明HIP-55shRNA在心脏成纤维细胞中敲减HIP-55。
实施例2、HIP-55的功能研究
1、HIP-55与心脏成纤维细胞增殖的影响
1)Brdu ELISA检测
将离体心脏成纤维细胞传代种于96孔板,细胞密度为3.5*104个/mL,100μl/孔,待细胞融合度达到60~70%时,换用无血清培养,感染腺病毒;上述腺病毒分别为由实施例1制备得到的过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)、Des1d腺病毒(Dsred)、shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)、对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)、pAd/PL-Dest腺病毒。培养24小时后,再给异丙肾上腺素(ISO,终浓度为10-5mol/L)处理24小时后收样。收样前6小时,掺入BrdU10μl/孔(终浓度10μmol/L)。收样时弃上清,拍干。
使用Cell Proliferation ELISA,BrdU kit(Roche,Cat No.11647229001)测量BrdU掺入情况。具体步骤如下:加入200μl/孔Fix Denat室温(25℃)孵育30分钟;弃去,轻拍;加入100μl/孔anti-BrdU-POD工作液,室温孵育90分钟;弃去液体,加200μl/孔的洗涤液洗3次;拍干,加入100μl/孔底物溶液,室温孵育15分钟。加入25μl/孔2mol/L硫酸终止反应,在酶联免疫检测仪OD450nm波长测定吸光值。
HIP-55过表达结果表明HIP-55能够明显抑制心肌成纤维细胞增殖,如图3A所示:
以感染Des1d腺病毒(Dsred)的细胞为对照,其BrdU参入量为1;经过ISO处理后的感染Des1d腺病毒(Dsred)细胞BrdU参入量为1.72;
感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)细胞BrdU参入量为0.84;经过ISO处理后的感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)细胞BrdU参入量为1.36;
可以看出,给予ISO刺激后能够明显诱导心脏成纤维细胞增殖(p<0.001),过表达HIP-55后能够明显抑制ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖(p<0.05)。
HIP-55敲减结果进一步表明HIP-55能够明显促进心肌成纤维细胞增殖,结果如图3B所示:
以感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞为对照,其BrdU参入量为1;经过ISO处理后的感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞BrdU参入量为1.41;
感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)细胞BrdU参入量为1.06;经过ISO处理后的感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)细胞BrdU参入量为2.01;
对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)和pAd/PL-Dest腺病毒结果无显著差异。
以感染重组腺病毒(scramble)细胞为对照,给予ISO刺激后能够明显诱导心脏成纤维细胞增殖(p<0.001),敲减HIP-55后能够明显增强ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖(p<0.01)。
2)、Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测
将离体心脏成纤维细胞传代种于96孔板,细胞密度为3.5×104个/mL,100μl/孔,待细胞融合度达到60~70%时,换用无血清培养,感染腺病毒;上述腺病毒为由实施例1制备得到的过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)、Des1d腺病毒(Dsred)、shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)、对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)和pAd/PL-Dest腺病毒。培养24小时后,再给ISO(终浓度10-5mol/L)处理24h后,每孔100μl不含血清培养液中加入CCK810μl,37°C,5%CO2培养箱静置培养2h。
用CCK8细胞增殖试剂盒(dojindo公司(日本)货号ck04)检测增殖,在酶联免疫检测仪上490nm波长处测定光吸收值,用只加培养液的空白孔调零。
CCK8检测结果同样表明HIP-55过表达HIP-55能够明显抑制心肌成纤维细胞增殖,如图4A所示,
以感染Des1d腺病毒(Dsred)的细胞为对照,CCK8吸光值为1;经过ISO处理后的感染Des1d腺病毒(Dsred)细胞CCK8吸光值为1.35;
感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)细胞CCK8吸光值为0.89;经过ISO处理后的感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)细胞CCK8吸光值为1.16;
可以看出,以感染腺病毒(Dsred)的细胞为对照,给予ISO刺激后能够明显诱导心脏成纤维细胞增殖(p<0.001),过表达HIP-55后能够明显抑制ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖(p<0.05)。
HIP-55敲减结果进一步表明HIP-55能够明显促进心肌成纤维细胞增殖,结果如图4B所示:
以感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞为对照,其CCK8吸光值为1;经过ISO处理后的感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞CCK8吸光值为1.45;
感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)细胞CCK8吸光值为1.24;经过ISO处理后的感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)细胞CCK8吸光值为1.89;
对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)和pAd/PL-Dest腺病毒结果无显著差异。
以感染重组腺病毒(scramble)细胞为对照,给予ISO刺激后能够明显诱导心脏成纤维细胞增殖(p<0.001),敲减HIP-55后能够明显增强ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖(p<0.01)。
总之,上述Brdu ELISA和CCK8法检测细胞增殖结果表明,敲减HIP-55后心脏成纤维细胞的增殖明显增强。与之相反,过表达HIP-55后心脏成纤维细胞的增殖明显减弱。证明HIP-55能够明显抑制心脏成纤维细胞增殖。
2、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性对心脏成纤维细胞增殖的影响
本实验采用p38MAPK选择性抑制剂SB202190(10μm)抑制p38MAPK激酶的活性,检测p38MAPK激酶的活性对ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖的影响。
方法按照上述1的1),将离体第二代心脏成纤维细胞传代种于96孔板,细胞密度为3.5*104个/mL,100μl/孔,待细胞融合度达到60~70%时,换用无血清培养24小时后,先给予P38抑制剂SB202190(10μM)孵育30min后,再给异丙肾上腺素(ISO,终浓度为10-5mol/L)处理24小时后收样。收样前6小时,掺入BrdU10μl/孔(终浓度10μmol/L),收样时弃上清,拍干。
结果表明ISO能够明显诱导的心脏成纤维细胞增殖,p38MAPK选择性抑制剂SB202190能够明显抑制ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖(图5)。说明ISO诱导心脏成纤维细胞增殖是通过激活p38MAPK活性引起的。
3、HIP-55对心脏成纤维细胞P38MAPK激酶活性的影响
1)心脏成纤维细胞体外P38MAPK激酶活性分析本实验采用非放射性P38MAPK激酶分析试剂盒检测体外P38MAPK激酶(为两种亚型,其氨基酸序列为序列表中的序列8或序列9)活性,试剂盒购自(cell signaling公司货号#9820);具体如下:
(1)配制1×lysis buffer;从-20℃取出10×lysis buffer,冰上融化;加入1mmol/l PMSF,用dd H2O配制;
(2)将细胞接种在100mm培养皿,加入终浓度为10μM ISO孵育培养10分钟;
(3)用上述lysis buffer裂解细胞,细胞裂解液离心收集上清液即为总蛋白;BCA法检测总蛋白含量;上清液-80℃冻存。
(4)每个样品取500μg总蛋白,用lysis buffer调整体积至600μl。
(7)分别加入磷酸化P38MAPK抗体小珠悬液20μl,4℃,旋转孵育过夜。
(8)4℃,14000g离心,30s,小心弃上清液。
(9)用500μl lysis buffer清洗小珠,共2次。
(10)用1×kinase buffer再洗2次。
(11)最后用50μl kinase buffer重悬。
(12)各样加入1μl ATP(200μmol/l)以及1μl ATF-2融合蛋白(ATF-2是P38MAPK激酶底物,p-ATF2水平代表了P38MAPK激酶活性)。
(13)30℃,孵育30min。
(14)加入25μl 3×SDS上样缓冲液终止反应。
(15)混匀,14000g离心,30s。
(16)100℃,煮沸5min。-80℃冻存。
(17)用抗ATF-2磷酸化抗体(Thr76)进行western blot,样本离心后取体积25μl上清液上样,检测P38MAPK激酶活性。
上述细胞为感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)的细胞、感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒(Dsred)的对照细胞、感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)的细胞、感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)对照细胞、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞。
结果如图6所示,其中,A为HIP-55过表达的结果;B为HIP-55过表达定量结果;C为HIP-55shRNA干扰结果;“-”号表示没有ISO诱导;“+”号表示10μM ISO诱导;D为HIP-55shRNA干扰定量结果;
图6B中可以看出,以感染Des1d腺病毒(Dsred)的细胞为对照,p-ATF2相对表达量为1;经过ISO处理后的感染Des1d腺病毒(Dsred)细胞p-ATF2相对表达量为2.45;
感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)细胞p-ATF2相对表达量为1.03;经过ISO处理后的感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)细胞p-ATF2相对表达量为1.63;
图6D中可以看出,以感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞为对照,p-ATF2相对表达量1;经过ISO处理后的感染对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)细胞p-ATF2相对表达量为1.57;
感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)细胞p-ATF2相对表达量为1.24;经过ISO处理后的感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1)细胞p-ATF2相对表达量为2.16;
对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)和pAd/PL-Dest腺病毒结果无显著差异。
从图6A/B和6C/D上可以看出,与感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒(Dsred)的对照细胞相比,感染过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)细胞的P38MAPK激酶底物ATF-2磷酸化(p-ATF2)水平明显减弱,说明抑制P38MAPK激酶活性。与之相反,与感染shRNA干扰重组腺病毒(scramble)对照细胞相比,感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒(KD1,敲减HIP-55)的ATF-2磷酸化(p-ATF-2)水平明显增强,说明促进P38MAPK激酶活性。
以上结果表明,在心脏成纤维细胞中过表达HIP-55能够明显抑制P38MAPK激酶活性(以ATF2做为底物检测,其磷酸化水平反映P38MAPK激酶活性),相反,在心脏成纤维细胞中敲减HIP-55则明显增强P38MAPK激酶活性。因此,HIP-55在心脏成纤维细胞中抑制P38MAPK激酶活性。
Claims (6)
1.含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体或含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒在制备具有如下1)或2)功能的产品中的应用:
1)抑制心脏成纤维细胞增殖;
2)抑制P38MAPK激酶活性;
所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2;
所述含有HIP-55蛋白编码基因的重组载体为重组腺病毒载体;
所述含有HIP-55蛋白编码基因的腺病毒为将所述重组腺病毒载体转染细胞,包装得到的腺病毒;
所述重组腺病毒载体为将attB1-HIP-55-Flag-IRES/DsRed-attB2编码基因插入pAd/CMV/V5-DEST中,得到的重组腺病毒载体pAd-HIP-55-Flag-IRES/DsRedE;
所述attB1-HIP-55-Flag-IRES/DsRed-attB2编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列7。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:
所述抑制心脏成纤维细胞增殖和所述抑制P38MAPK激酶活性均在ISO诱导下进行。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:
所述HIP-55蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
4.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:
所述产品为药物。
5.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:
所述心脏成纤维细胞为离体心脏成纤维细胞。
6.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:
所述抑制心脏成纤维细胞增殖是通过抑制P38MAPK激酶活性实现。
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