CN103102412B - 人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其应用 - Google Patents

Abstract

人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其应用，人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab，所述抗体的V_L链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：SEQIDNO.3所示的L-CDR1；SEQIDNO.4所示的L-CDR2；SEQIDNO.5所示的L-CDR3；并且所述抗体的V_H链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：SEQIDNO.8所示的H-CDR1；SEQIDNO.9所示的H-CDR2；SEQIDNO.10所示的H-CDR3。该抗体可用于免疫荧光、免疫组化和免疫共沉淀实验。该人源抗体能为鼻咽癌的靶向治疗提供一个新的靶向抗体。

Description

人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其应用

技术领域：

本发明属于免疫学或分子生物学技术领域，涉及利用基因重组技术，提供一种人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其应用。

背景技术：

鼻咽癌是来源于鼻咽上皮的高度恶性肿瘤，肿瘤进展极易侵犯颅底等重要结构，并较早发生颈部淋巴结转移和远处转移。鼻咽癌表现为种族和地区分布的特点，是我国十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为20/100，000，已引发严重健康问题。鼻咽癌是由Epstein-Barr病毒（EBV）的潜伏感染、环境因素和宿主的基因遗传因素共同参与的多步骤交互作用而逐步形成的复杂性疾病。所有的鼻咽癌细胞都含有EBV基因组，并表达EBNA1，EBER1，EBER2，和LMP1，LMP2A，LMP2B，这使得这些病毒蛋白成为理想的肿瘤标志物，其中latentmembrane protein2A(LMP2A)在鼻咽上皮细胞的转化、癌变和复发的过程中的作用倍受关注，是目前公认的病毒癌基因。它以其独特的蛋白分子结构参与鼻咽癌发生和发展的全过程。

发明内容

解决的技术问题：本发明目的是提供一种人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其药物用途，为鼻咽癌中表达的LMP2A的检测提供检测工具及为鼻咽癌的靶向治疗奠定基础。

技术方案：人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab，所述抗体的V_L链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

SEQ ID NO.3所示的L-CDR1；

SEQ ID NO.4所示的L-CDR2；

SEQ ID NO.5所示的L-CDR3；

并且所述抗体的V_H链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

SEQ ID NO.8所示的H-CDR1；

SEQ ID NO.9所示的H-CDR2；

SEQ ID NO.10所示的H-CDR3。

所述抗体的V_L链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，V_H链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述抗体的V_L链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，V_H链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab在制备治疗鼻咽癌药物中的应用。

人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab在治疗鼻咽癌中的应用。

SEQ ID NO.1轻链可变区核酸序列

GAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO.2轻链可变区氨基酸序列

ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO.3L-CDR1：QSISSY

SEQ ID NO.4L-CDR2：AAS

SEQ ID NO.5L-CDR3：QQSYSTPYT

SEQ ID NO.6重链可变区核酸序列

CAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATTGGAAACAGCACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO.7重链可变区氨基酸序列

QLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWKQHWYFDLWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO.8H-CDR1：GFTFSSYG

SEQ ID NO.9H-CDR2：IWYDGSNK

SEQ ID NO.10H-CDR3：ARDWKQHWYFDL

有益效果：本发明提供了一种既具有抗体特异性又具备较好亲和力的抗鼻咽癌作用的anti-LMP2A人源抗体，该抗体可用于免疫荧光、免疫组化和免疫共沉淀实验。该人源抗体能为鼻咽癌的靶向治疗提供一个新的靶向抗体。

附图说明

图1为LMP2A胞外区融合基因在大肠杆菌系统中的表达纯化和SUNE、CNE中LMP2A蛋白的鉴定：A．LMP2A胞外区融合基因在大肠杆菌系统中的表达1空菌2诱导后全菌3超生上清4超生沉淀（SDS-PAGE）；B．纯化后的胞外融合蛋白LMP2A12KD（SDS-PAGE；纯度>95%）；C．LMP2A在细胞内表达的鉴定1SUNE2CNE55KD（Western Bloting）；

图2为噬菌体抗体库筛选的ELISA检测结果和抗LMP2A人源抗体Fab29的鉴定、纯化：A.差减法阳性克隆的挑选；B.Fab29在Top10空菌中表达1空菌对照2超生上清3超生沉淀（Western Bloting）；C.Fab29纯化结果（SDS-PAGE；纯度>95%）；

图3为纯化的Fab29与细胞株SUNE/CNE以及不相关抗体与SUNE结合的细胞ELISA测定结果和Fab29与SUNE/CNE细胞结合的FACS结果以及SUNE细胞与CNE细胞裂解液与Fab29免疫共沉淀结果：A.纯化的Fab29与细胞株SUNE/CNE以及unrelated Fab与SUNE的结合测定；B.流式细胞计数显示Fab29与SUNE细胞结合（1）而unrelated Fab不与SUNE（2）细胞结合而且Fab29不能与CNE细胞结合；C.免疫共沉淀结果显示Fab29能够捕获LMP2A蛋白

图4为Fab29和细胞株SUNE/CNE以及不相关抗体Fab与SUNE结合的细胞免疫荧光图：A.Fab29(1-4)和unrelated Fab（5-8）与肿瘤细胞株SUNE以及Fab29(9-12)与CNE的结合-免疫荧光，4，8，12分别是普通光学显微镜检视；

图5为Fab与重组蛋白LMP2A的亲和力和动力学测试结果：Fab29在不同浓度下与重组LMP2A蛋白的亲和力和动力学分析结果。结果显示Fab29对重组LMP2A的亲和力是1.79E-0.9；

图6为Fab29与Rat anti-EBV LMP2A和不相关Fab做鼻咽癌患者免疫组化的差别：1是经商业化Rat anti-EBV LMP2A抗体鉴定的阳性鼻咽癌患者的肿瘤切片；2是Fab29与该阳性患者切片孵育结果；3是unrelated Fab与鼻咽癌患者肿瘤切片孵育的结果.4-6是鼻咽癌LMP2A阴性切片结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例中如无特别说明，各物质浓度均为质量百分比浓度：

实施例1

人源抗LMP2A胞外区抗体Fab的制备与鉴定：

一、潜伏膜蛋白2A(LMP2A)胞外区抗原的制备与纯化

1.LMP2A胞外区的基因序列来源于B95-8细胞系，通过GenBank公布数据（AJ507799.2）确认，LMP2A二段胞外区LMP2A由南京佰杰斯生物公司进行全基因合成，并将LMP2A胞外区重组基因克隆到pET28a⁺载体中而构建成质粒pET28a⁺-LMP2A。

2.His-LMP2A胞外肽段质粒的构建

(1).用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pET28a⁺-LMP2A，将LMP2A胞外基因片段使用TAKARA公司胶回收试剂盒切胶回收；

(2).使用T4DNA连接酶联接到pET28a⁺表达质粒；

3.His-LMP2A胞外肽段融合蛋白的表达

(1).将含有重组质粒pET28a⁺-LMP2A和空载体pGEX-4T-2的BL21菌株接种到含卡纳霉素(50ug/mL)的LB中，37℃震荡过夜；

(2).次日转接，37℃培养至菌液吸光度(A)值600约0.6时，加异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达蛋白，至终浓度为1mmol/L，25℃190r/min震荡；

(3).诱导12小时，以未转质粒的空菌作对照。用12％SDS-PAGE电泳分析His-LMP2A融合蛋白表达。

4.His-LMP2A融合蛋白的纯化

(1).离心收集表达His-LMP2A膜外肽段融合蛋白菌液。用PBS45mL重悬细菌，超声碎菌。4℃收集上清过滤；

(2).将含有His-LMP2A膜外肽段融合蛋白的上清经亲和层析柱，用洗脱液（500mmol/L咪唑，0.5M/L NaCl，20mmol/L NaH₂PO₄）洗脱，收集蛋白；

(3).经SDS-PAGE分析蛋白表达含量与纯度，样品于-70℃贮存。

二、交替固相法与差减法的筛选抗体Fab

1.本发明采用基于固相抗原的筛选与基于细胞的筛选，差减筛选法选择人鼻咽癌细胞CNE为阴性细胞（由南京医科大学卫生部抗体重点实验室保存），天然在膜表面表达LMP2A的鼻咽癌细胞株SUNE为阳性细胞（上海诺华诺华制药有限公司）；固相筛选时His-LMP2A胞外肽段融合蛋白为抗原；

2.基于细胞表面的差减筛选

（1）抗体库滴度测定：将-80℃保存的噬菌体库于冰上解冻后用pH7.4的PBS稀释至1×10^-9，取1μL稀释的抗体库与50μL对数生长期的XL1-blue（OD₆₀₀约1.0）于室温下混合30min后铺板，于第二天通过菌落数测滴度，公式如下：

每微升噬菌体数=稀释倍数×菌落数

首轮准备约10¹³phage；筛库加入的phage数按需要的噬菌体数÷每微升phage数计算；如噬菌体滴度低，则将几个不同离心管内的噬菌体混合后加入1/5体积20%wt的PEG，15%wtNaCl溶液沉淀后用1mL1%wt的BSA-PBS溶解；

（2）筛库前一天接种单克隆XL1-blue于含10mL30μg/mL四环素SB培养液的50mL烧瓶中，37℃，250r/min，过夜，第二天按体积比1∶100用含10μg/mL四环素的SB培养液转接，注意OD₆₀₀不要超过1.0；

（3）准备CNE细胞（为消除部分非特异性结合的阴性细胞）与SUNE细胞（为细胞表面高表达抗原的阳性细胞，用于结合特异性抗体）各100万个，即150cm²的细胞培养瓶70%长满后1-2瓶；

（4）首先移去CNE细胞培养瓶内的培养基，用10mL pH7.4的PBS洗三次，移去PBS，再向每个培养瓶中移入10mL细胞解离液，37℃孵育10min；

（5）此时大部分细胞应已经从瓶壁分离，少量仍贴壁者可用细胞铲将细胞从培养瓶壁中缓慢刮下，收集至一个1.5mL的聚丙烯离心管内，1800r/min离心5min；

（6）仔细吸去上清，再加入1mL pH7.4PBS吹打重悬，按前述转速及时间离心，用pH7.4PBS洗涤三次；

（7）最后一次洗涤后移去PBS，用溶于1mL5%wt脱脂牛奶-PBS的噬菌体抗体库重悬CNE细胞，37℃混合30min；在此同时按照相同方法准备SUNE细胞；

（8）离心，1800r/min，5min，然后将上清转移至SUNE细胞（注意不要将CNE细胞带出），与SUNE细胞37℃混合30min；

（9）离心，1800r/min，5min，弃去上清，再用1mL0.1%wt BSA-PBS洗涤，共8次；

（10）50μL0.25%wt trypsin，0.53mmol EDTA重悬细胞沉淀，37℃20min;把以上液体再加入2mL XL1-blue(OD₆₀₀约1.0)，37℃30min；

（11）向装有感染了洗脱噬菌体细菌的离心管中补加事先预热至37℃的6mL SB培养液，向其中补充1.6μL羧苄霉素（0.1g/mL）保存液，吸取2μL加入200μL SB，混匀。取10μL、100μL铺板，计算洗脱噬菌体产量为第一轮产出(output)；洗脱噬菌体产量=菌落数×稀释倍数×10³；剩余菌液转到50mL三角瓶中，250r/min，37℃1h；

（12）补充2.4μL羧苄霉素保存液，相同条件再培养1h；

（13）加入100μL10¹³VCSM13辅助噬菌体，将整个培养液转移至含91mL预热（37℃）SB培养液的500mL烧瓶中，补充46μL羧苄霉素保存液与184μL四环素保存液，继续前述条件培养2h；

（14）加入140μL卡那霉素保存液（0.05g/mL），过夜培养；

（15）将培养液转移至500mL离心瓶中，室温离心3000g，15min；

（16）上清中加入4g PEG，3g NaCl，摇晃混匀后于冰上静置1h；

（17）4℃离心，15000g×15min；

（18）弃上清，将离心瓶口朝下置于纸上，将剩余的液体清除；

（19）用1mL1%wt BSA-PBS溶解噬菌体，用前述方法测定滴度，取10¹³噬菌体用于下一轮筛选，共筛选5轮；剩余保存于-80℃。

3.固相筛选法方法

（1）包被抗原：在两个1.5mL的离心管中，将纯化的His-LMP2A溶于ELISA coatingbuffer使终体积达到400μL，LMP2A浓度为3μg/mL，每孔中分别加入50μL，每次筛库每个浓度用8孔，4℃过夜；筛库前一天及当天按前述方法准备细菌；

（2）次日，将被His-LMP2A蛋白结合的孔加入pH7.4PBST洗三次，每孔加入300mL脱脂牛奶37℃1min，pH7.4PBST洗三次；

（3）Fab抗体库250μL与5%wt脱脂牛奶250μL，37℃30min；

（4）将上步所得液体以每孔50μL加入His-LMP2A包被的ELISA8孔板中，即（2）中，盖上塑料膜，37℃2h；

（5）甩去噬菌体，0.5%wt TWEEN-TBS洗涤：向孔中加满0.5%wt TWEEN-TBS，用1mL Tip头反复吹打10次，静置约5min，待气泡完全消失，甩去孔中洗涤缓冲液，孔顶朝下拍打3次，反复10次后再用装于无菌塑料瓶中的洗涤缓冲液冲洗，甩去缓冲液后再拍打3次，反复5次；

（6）向每孔中加入约50μL0.25%胰酶－EDTA，37℃30min，用Tip头猛烈吹打10次；剩余转移到2mL当日接种培养的XL1-blue(OD₆₀₀1.0左右)的12mL聚丙烯培养管中，室温孵育20min；

（7）向装有感染了洗脱噬菌体细菌的离心管中补加事先预热至37℃的6mL SB培养液，向其中补充1.6μL羧苄霉素保存液（0.1g/mL），12μL四环素保存液（0.2g/mL），于37℃，250r/min，1h；同时取2μL加入200μL SB，混匀。取10μL、100μL于LB-Agar/羧苄青霉素（0.1×10^-3g/mL），37℃过夜生长后数单菌落数目，计算产出噬菌体(output)；

（8）补充2.4μL羧苄霉素保存液，相同条件再培养1h；

（9）加入10¹³VCSM13辅助噬菌体，将整个培养液转移至含91mL预热（37℃）SB培养液的500mL烧瓶中，补充46μL羧苄青霉素保存液与184μL四环素保存液，继续前述条件培养2h；

（10）加入140μL卡那霉素保存液（0.05g/mL），过夜培养；

（11）将培养液转移至250mL离心瓶中，4℃离心，3000g，15min；

（12）上清中加入4gPEG，3gNaCl，37℃，250r/min，15min摇晃混匀完全溶解后于冰上静置1h；

（13）4℃离心，15000g，30min；

（14）弃上清，将离心瓶口朝下置于纸上，将剩余的液体清除；

（15）用500μL1%wtBSA-TBS溶解噬菌体，用前述方法测定滴度，取10¹³噬菌体用于下一轮筛选；剩余保存于-80℃。

4.噬菌体ELISA挑选阳性克隆

（1）本过程需新鲜准备的包被抗原。用ELISA coating buffer稀释纯化的His-LMP2A至浓度为3μg/mL，每孔中加入50μL，4℃过夜；

（2）第二天甩去每板中的包被缓冲液，每孔中加满ELISAwashing buffer，甩去，于纸上拍打三次洗涤，反复三次；

（3）每孔中加新鲜配制的1％wt BSA-PBS，37℃，1.5h；

（4）最后一轮产出噬菌体2mL铺四块板，37℃孵箱中过夜培养；

（5）次日晨用tip头挑选58个单菌落分别接种于1mL SB培养基（内含100μg/mL氨苄青霉素和1%wt葡萄糖），于12mL聚丙烯培养管中37℃震荡培养；

（6）约8-10h后，OD₆₀₀达到0.3，此时向每个培养管中加入10⁹VCSM13辅助噬菌体，继续37℃震荡培养2h；

（7）每管中加入1.4μL50mg/mL的卡那霉素至终浓度为70μg/mL，摇床中37℃过夜培养。

（8）次日，将每根培养管标号，3000g离心，15min，每管中剩余的噬菌体暂存于4℃；

（9）甩去ELISA板中的封闭牛奶，吸取出50μL过夜培养液上清与50μL1%wtBSA-PBS混匀，按顺序加入实验孔（LMP2A）中，一孔加入一个克隆的噬菌体，留至少两对孔加入含相同浓度抗生素及葡萄糖的SB培养液作为空白对照，37℃，2h；

（10）弃去噬菌体培养液，拍打三次后再用10mL移液管吸取0.1%wt TWEEN-PBS冲洗后再拍打三次，用此方法共洗涤五次；

（11）每孔中再加入50μL1:3000稀释的HRP标记的羊抗M13二抗(Amersham codenumber:27-942-01)，室温1h；

（12）用(3)中的溶液再次洗涤；

（13）显色，每孔中加入100μL显色底液(TMB与H₂O₂按1:1体积比混合)，20min后加入1M H₂SO₄停止显色；

（14）于波长450nm读数记录；

（15）取ELISA读值最高的29号克隆为最佳阳性克隆。

5.阳性克隆的测序

（1）2mL过夜培养菌，12000r/min离心2min，弃上清；

（2）加入250μL的SolutionⅠ(含RNaseA1)，充分重悬细菌；

（3）加入250μL的SolutionⅡ，轻轻地上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液；

（4）加入400μL4℃预冷的SolutionⅢ，轻轻地上下翻转混合5-6次，直至形成紧实凝集块，室温静置2min；

（5）12000r/min离心10min，取上清；

（6）Spin Column安置于Collection Tube，上清置于Spin Column中；

（7）12000r/min离心1min，弃滤液；

（8）将500μL的Rinse A加入Spin Column中，12000r/min离心30s，弃滤液；

（9）将700μL的Rinse B加入Spin Column中，12000r/min离心30s，弃滤液；

（10）重复上一步，然后再12000r/min离心1min，弃滤液；

（11）将Spin Column安置于新的1.5mL离心管，在Spin Column膜的中央处加入60μL经60℃预热的洗脱液，室温静置1min；

（12）12000r/min离心1min，洗脱DNA，测序。

二、Fab29的表达

1.Top10F’接种于含30μg/mL四环素的LB-Agar中，取单菌落于37℃震荡培养过夜；

2.将过夜培养的Top10F’培养液以1:100体积比接种于含30μg/mL四环素的SB培养液中，37℃震荡培养至OD600约为0.8；

3.吸取1μL阳性克隆的噬菌体与50μL对数生长期的Top10F’混合，于室温下孵育15mins，然后铺板生长于含100μg/mL氨苄青霉素的LB-Agar，37℃过夜生长；

4.次日，挑选单菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素，2%wt葡萄糖的SB培养液中，37℃震荡培养过夜；

5.用含100μg/L氨苄青霉素，1%wt葡萄糖的SB培养液按1:100体积比转接过夜生长的细菌，37℃震荡培养直至OD600达到1.0；

6.5000r/min，5min，37℃离心，弃上清，用1mL含100μg/L氨苄青霉素的SB重悬细菌；

7.加入IPTG至终浓度为0.1mM，加入蔗糖浓缩液至终浓度为4%wt，于25℃震荡培养过夜。

三、阳性克隆表达的鉴定

1.取100μL过夜诱导表达的细菌培养液，离心，10000g；

2.将上清与细菌沉淀分离，取10μL上清与相同体积的SDS2×loadingbuffer混匀，100℃煮沸5min；

3.向pH7.4PBS加入200mM PMSF至终浓度为1mM，用200μL重悬细菌沉淀，然后于冰水混合物中超声处理5min；

4.再离心，10000g×5min；

5.取10μL上清与相同体积的SDS loadingbuffer混匀，100℃煮沸5min；

6.上样，蛋白电泳，90V，大约1h左右；

7.转膜，150mA，2h；

8.封闭，5%wt牛奶-PBS，将膜完全浸泡于封闭液中，37℃1h；

9.洗涤三次(洗涤方法为加入wash buffer，室温下于摇床上反复摇晃5min，然后弃去再加入wash buffer)；然后加入1:3000体积比稀释的HRP标记的羊抗人IgG(Fab)’(catalog no.A0293;Sigma)，室温下于摇床上摇晃1h；

10.按前述方法再洗涤三次，加入HRP底物冲洗硝纤膜，约45s后曝光。

四、阳性克隆表达产物的纯化

1.按前述方法诱导表达Fab29；

2.离心细菌培养液，10000g×15min；

3.细菌沉淀重悬于1/10细菌培养液体积的含1mM PMSF的pH7.4的20mM磷酸缓冲液；

4.将重悬的液体分装于50mL的聚丙烯离心管中，于冰水混合物中超声处理，约12min；

5.将超声后的菌液再次聚集在一起，离心，15000g×30min；

6.弃沉淀，上清通过0.22μL滤器过滤；

7.准备好AKTA-FPLC与ProteinL亲和层析柱，从柱中先后流过2倍柱体积的去离子水及10倍柱床体积的结合缓冲液，平衡Protein L亲和层析柱；

8.取待纯化样品上柱，流速为0.5～1mL/min；

9.然后以同样的流速依次用20倍柱床体积的结合缓冲液；

10.上5mL洗脱缓冲液，在AKTA-FPLC上根据峰值收集洗脱蛋白，并用0.1mol/L Tris碱中和收集的洗脱液至pH7.0～7.5；

11.用BCA法测蛋白质含量，置4℃保存备用。使用后的层析柱经双蒸水洗涤，再以20%的酒精冲洗、密封保存于4℃供再次使用；

12.纯化的Fab29用SDS－PAGE鉴定其纯度。用0.12g/mL分离胶、0.04g/mL浓缩胶，设低分子量标准，恒压下电泳。考马斯亮蓝R250染色。纯化的Fab29的活性用上述ELISA法鉴定；

13.经Centricon离心换缓冲液溶解于pH7.4，PBS中浓缩保存。

五、纯化的Fab29与LMP2A胞外区结合能力ELISA

1.包被抗原及封闭：将纯化的His-LMP2A溶于ELISA coating buffer使终体积达到5mL，LMP2A浓度为600ng/mL，每孔中分别加入50μL，4℃过夜；

2.次日，将被His-LMP2A蛋白结合的孔加入pH7.4PBST洗三次，每孔加入300mL脱脂牛奶37℃1min，pH7.4PBST洗三次；

3.将纯化的Fab29分别稀释为10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156μg/mL，向每孔中加入50μL稀释的Fab29于室温下孵育1h；

4.洗涤后加入1:2000体积比稀释的HRP标记的羊抗人二抗(catalog no.A0293;Sigma)，室温下1h；

5.洗涤后加入底物显色30min，加入1M硫酸中止显色，于波长450处读数。

六、Fab29细胞ELISA检测

1.用胰蛋白酶消化细胞培养瓶中的细胞；收集细胞并计数；离心，1500r/min，10min；

2.用完全培养基重悬细胞调整浓度4×10⁵个细胞/mL，分成三组，第一组鼻咽癌细胞株SUNE细胞，第二组对照组人鼻咽癌细胞株CNE细胞；第三组SUNE细胞和不相关的Fab蛋白；

3.滴加到96孔培养板中，100μL/孔；37℃环境孵育过夜；

4.用PBS洗板两次；

5.每孔加125μL10％wt福尔马林缓冲液；于室温环境下固定15min；

6.用双蒸水洗涤三次；晾干；贮存于2-8℃；

7.用双蒸水洗涤ELISA板两次；

8.每孔加250μL含2％wtBSA的PBS；37℃孵育1h；

9.双蒸水洗板三次；

10.每孔加50μLFab29(依次用含1％wt BSA的PBS稀释至浓度为50、25、12.5、6.25、3.15、1.56、0.78、0.00μg/mL)，37℃孵育2h；

11.0.1％wt PBST洗板五次；

12.每孔加50μL用含1％wt BSA的1：2000体积比稀释的HRP酶标羊抗人IgG(Fab)(catalog no.A0293;Sigma)；37℃孵育1h；

13.TMB显色，显色前按TMB:H₂O₂=1:1体积比混合，100μL/孔，在室温下孵育20min；加1M硫酸溶液50μL/孔；

在酶标仪上测OD490波长的值。

七、荧光激动的细胞分类(fluorescence-activated cell sorting，FACS)

1.分别培养CNE与SUNE细胞至约10⁶个；

2.用pH7.4PBS洗涤三次：向每个培养瓶中移入10mLpH7.4，PBS后倒出；反复三次；

3.向每个培养瓶中分别加入2-3mL cell dissociation buffer，37℃，10min；

4.用细胞刮将细胞刮落，再加入约1mLpH7.4PBS，转入15mL的聚丙烯离心管，1800r/min离心，5min；

5.弃去上清，用1mLpH7.4PBS重悬细胞，再离心，1800r/min，5min，反复三次；

6.用10mL1%wtBSA-PBS于4℃封闭30min；

7.离心，将两种细胞分别于50μg/mL Fab29的PBS1mL重悬，细胞均置于microtube中，于mixer上4℃转动反应45min；

8.1800r/min离心，5min；弃去上清；

9.用1mLpH7.4PBS重悬细胞，再离心，1800r/min，5min，反复三次；

10.用1mL1:200体积比稀释的FITC-labeled anti human Fab IgG重悬每份细胞，于4℃转动反应30min，本步骤中就用铝箔包裹试管避光；

11.1800r/min离心，5min；弃去上清；再用pH7.4PBS洗涤三次；

12.将每份细胞用200μLpH7.4PBS重悬，于流式细胞仪分析光强度。

八、免疫共沉淀

1.在非变性条件下收集SUNE和CNE细胞，去掉培养基，用4℃PBS清洗一次；

2.将所有细胞刮下，收集到一个离心管中。冰浴中对样品用超声处理40秒，功率3W；

3.4℃，14000g离心10分钟。将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物；

4.取200μL的细胞裂解物，在其中加入50μg Fab29，4℃孵育过夜分钟；

5.向4中加入20μL的蛋白L琼脂糖微球浆，4℃孵育60分钟；

6.4℃离心10分钟。弃上清，沉淀pH7.4PBS重悬洗3次；

7.将6的沉淀加入40μLpH7.4PBS和10μL的5×loadingbuffer，100℃5分钟；

8.取7中的20μL Western免疫印迹分析（详见三、6-10）

九、免疫荧光

1.将上述两种细胞分别接种于6孔培养皿中，CNE细胞两孔，SUNE细胞四个孔（其中两个孔加入不相关Fab），每孔约1500细胞，直到约80%长满，其中每种细胞培养1孔作为实验观察组，另1孔仅加入二抗作为阴性对照组；

2.吸去培养液，用pH7.4PBS洗涤三次，方法为加入PBS后再吸去；

3.加入按等体积混合的丙酮与甲醇混合液，室温下固定20min；

4.吸去固定液，再用去离子水洗三次，洗涤方法为加入去离子水后吸去；

5.用新鲜配制的5%wt脱脂牛奶-PBS在37℃封闭1h；

6.阴性对照组继续用封闭液处理，实验组中加入20μg/mL HLEAFab抗体，37℃，1h；

7.用pH7.4PBS洗涤，方法为加入PBS后再吸去；

8.在无光条件下加入1:200（PBS）体积比稀释的FITC-labeled羊抗人Fab(catalogno.F5512;Sigma)，室温0.5h；

9.洗涤后于显微镜下观察；FITC激发波长494nm。

十、Fab的亲和力和动力学分析（fortéBIO co.，LTD.上海分公司代做）

十一、免疫组化

1.南京医科大学二附院病理科提供的鼻咽癌患者石蜡切片脱蜡至水；

2.3%wt H₂O₂室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；

3.蒸馏水冲洗，pH7.4PBS浸泡5分钟×2次；

4.5%wt小牛血清封闭，室温孵育30分钟，倾去血清，滴加纯化后PBS稀释的浓度为0.25μg/mL Fab29抗体蛋白，浓度为0.25μg/mL商业化Rat-EBV LMP2A抗体蛋白和浓度为0.25μg/mL不相关抗体Fab抗体蛋白工作液，37℃孵育2小时；

5.PBS冲洗，5分钟×3次；

6.滴加1：1000(PBS)体积比稀释后的HRP标记羊抗人IgG(catalog no.A0293;Sigma)，HRP标记羊抗大鼠IgG(112-035-003,Jackson ImmunoResearch)工作液，37℃孵育1分钟；

7.PBS冲洗，5分钟×3次；

8.显色剂显色3-15分钟（DAB）；

9.自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

结果

一、LMP2A胞外肽段融合蛋白的表达与纯化

LMP2A胞外肽段的相对分子质量为11KD，加上0.84KD相对分子质量的His，融合蛋白预期的相对分子质量应为12KD。转化有重组质粒pET28a⁺-LMP2A的BL21经IPTG诱导后，在相应区域有浓染蛋白带一条，与预期大小相吻合。经SDS-PAGE分析，含有表达载体的BL21(DE3)菌株经IPTG诱导，可表达与预期分子量相符蛋白带(图1)。

二、阳性克隆的筛选、测序、表达与纯化

1.phage ELISA的阳性克隆挑选

我们于第6轮筛库结束后挑选单克隆噬菌体扩增进行phage ELISA selection。挑选29号信号最强的质粒送检，结果提示29号的基因型符合Fab基因型，且该Fab轻链为κ链，提示特异性29克隆从抗体库中被挑选出来。挑选29号克隆命名为Fab29（图2）。

2.阳性克隆序列的测定

表129号克隆的轻链可变区(上)及重链可变区(下)序列

3.Fab29在E.Coli.Top10F’中的表达

SDS-PAGE与Western-blot分析表明，转化工程菌能够正确表达Fab抗体。在变性条件下，Fab抗体分子的异二聚体分解为Fd与Kappa链；经Protein L纯化的抗体经SDS/PAGE检验进一步证实了其结构与分子量与Fab相符，经诱导Fab29在细菌中分泌表达，尽管其组装部位在质周腔，但Fab29分子形成后被分泌至细菌周腔（图2B）

4.两步纯化法得到了较高纯度的Fab29

经过亲和力纯化，Fab29基本与其它蛋白分离，SDS－PAGE证实了其纯度（图2C）。

三、Fab29与具有天然构象的LMP2A胞外结构结合

1.细胞ELISA检测

纯化后的Fab29与展示于噬菌体表面的抗体一样，都具有较强的与LMP2A胞外区结合的能力，但是当我们以较低的Fab29浓度反应时，抗体能够与LMP2A特异性结合而表现为抗体活性（图3A）。

2.FACS检测

LMP2A为跨膜分子，分为胞外区，跨膜区与胞内区，实现靶向治疗有赖于与胞外区结合的抗体，因此通过FACS检测Fab29与细胞表面LMP2A结合的能力，并以CNE和不相关Fab作为阴性对照。结果显示Fab29能够与SUNE细胞结合的特异性，而不与CNE细胞结合（图3B）。FACS检测结果证实抗Fab29与SUNE细胞的结合。

3.免疫共沉淀

为了更明确的知道我们的筛选的抗体Fab29结合的是LMP2A，SUNE和CNE细胞同时被超声裂解后与Fab29作用后被Protein L beads结合后煮样，Western Bloting用商业化的Rat anti-EBV LMP2A检测LMP2A蛋白，显示SUNE的裂解液中LMP2A在Fab29的作用下被捕获而CNE细胞裂解液中无LMP2A的表达则无相应的LMP2A条带（图3C）。

四、免疫荧光检测

我们通过免疫荧光提供直接、可视的形态学证据来观察Fab29与鼻咽癌细胞株SUNE的结合部位。Fab29主要与SUNE表面的LMP2A结合，提示其能够与鼻咽癌细胞结合，结合部位为细胞膜（图4）。

五、Fab29的亲和力和动力学的分析

四个不同浓度的Fab29（12.5，25，50，100nmol/L）与5μg/mL的重组LMP2A蛋白结合，实验显示Fab29与重组蛋白的亲和力为1.79×10^-9KD(M)。

六、免疫组化

在由商业化Rat anti-EBVLMP2A抗体做阳性参照的前提下，同时以Fab29和不相关的Fab做对照组与鼻咽癌患者的肿瘤切片结合。结果显示Fab29与商业化的抗体做出来的结果是一样的，这提示了Fab29能与天然构象的LMP2A结合（图6）。

本发明首次展示了一种既具有抗体特异性又具备较好亲和力的抗鼻咽癌作用的anti-LMP2A人源抗体，该抗体可用于免疫荧光、免疫组化和免疫共沉淀实验。该人源抗体为鼻咽癌的靶向治疗提供了一个新的靶向抗体。

SEQUENCE LISTING

 

<110> 陈,仁杰

 

<120> 人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab及其应用

 

<130> 

 

<160>  10   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  321

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  1

gagctccagatgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60

 

atcacttgccgggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca    120

 

gggaaagcccctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca    180

 

aggttcagtggcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct    240

 

gaagattttgcaacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgtacac ttttggccag    300

 

gggaccaagctggagatcaa a                                              321

 

 

<210>  2

<211>  107

<212>  PRT

<213> 人工序列

 

<400>  2

 

GluLeu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

            20                  25                  30         

 

 

LeuAsn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45             

 

 

TyrAla Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

GluAsp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr

                85                  90                  95     

 

 

ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105        

 

 

<210>  3

<211>  6

<212>  PRT

<213> 人工序列

 

<400>  3

 

GlnSer Ile Ser Ser Tyr

1               5      

 

 

<210>  4

<211>  3

<212>  PRT

<213> 人工序列

 

<400>  4

 

Ala Ala Ser

1          

 

 

<210>  5

<211>  9

<212>  PRT

<213> 人工序列

 

<400>  5

 

GlnGln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr

1               5                  

 

 

<210>  6

<211>  351

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  6

cagctgttggagtctggggg aggcgtggtc cagcctggga ggtccctgag actctcctgt     60

 

gcagcgtctggattcacctt cagtagctat ggcatgcact gggtccgcca ggctccaggc    120

 

aaggggctggagtgggtggc agttatatgg tatgatggaa gtaataaata ctatgcagac    180

 

tccgtgaagggccgattcac catctccaga gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa    240

 

atgaacagcctgagagccga ggacacggct gtgtattact gtgcgagaga ttggaaacag    300

 

cactggtacttcgatctctg gggccgtggc accctggtca ccgtctcctc a             351

 

 

<210>  7

<211>  117

<212>  PRT

<213> 人工序列

 

<400>  7

 

GlnLeu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu

1               5                   10                  15     

 

 

ArgLeu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met

            20                  25                  30         

 

 

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val

        35                  40                  45             

 

 

IleTrp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

    50                  55                  60                 

 

 

ArgPhe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65                  70                  75                  80 

 

 

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

                85                  90                  95     

 

 

Asp Trp Lys Gln His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu

            100                 105                 110        

 

 

Val Thr Val Ser Ser

        115        

 

 

<210>  8

<211>  8

<212>  PRT

<213> 人工序列

 

<400>  8

 

GlyPhe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1               5              

 

 

<210>  9

<211>  8

<212>  PRT

<213> 人工序列

 

<400>  9

 

IleTrp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1               5              

 

 

<210>  10

<211>  12

<212>  PRT

<213> 人工序列

 

<400>  10

 

Ala Arg Asp Trp Lys Gln His Trp Tyr Phe Asp Leu

1               5                   10          

 

Claims (3)

1.人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab，其特征在于，所述抗体的V_L链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

SEQ ID NO.3所示的L-CDR1；

SEQ ID NO.4所示的L-CDR2；

SEQ ID NO.5所示的L-CDR3；

并且所述抗体的V_H链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

SEQ ID NO.8所示的H-CDR1；

SEQ ID NO.9所示的H-CDR2；

SEQ ID NO.10所示的H-CDR3；

抗体的V_L链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，V_H链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求1所述的人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab，其特征在于，所述抗体的V_L链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，V_H链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.权利要求1～2任一人源抗鼻咽癌LMP2A胞外区抗体Fab在制备治疗鼻咽癌药物中的应用。

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