CN103097539A - 木质纤维素生物质的二氧化碳-水两相超临界预处理 - Google Patents

Abstract

一种生物质原料的预处理方法，该方法包括使生物质原料经受150℃到250℃温度范围和高压条件下的水和超临界CO₂的两相混合物，维持从10秒到100分钟的时间。在特定的实施方式中，该工艺为两阶段的温度过程，其中最初的短暂高温阶段在至少200℃温度下进行不超过20分钟，并且随后更长时间的低温阶段在至少140℃到不超过190℃温度下进行10-120分钟。

Description

木质纤维素生物质的二氧化碳-水两相超临界预处理

本发明在美国运输部签定的编号为DT0S59-07-G-00052的合约下，由美国政府支持完成。美国政府对本发明享有一定权益。

发明领域

本发明主要涉及将生物质转化为实用产品（例如，由其制成的单糖和燃料材料），更具体地说，本发明涉及生物质处理的预处理步骤。

发明背景

随着全球能源消耗的不断增加，与化石燃料提取和使用相关的经济和环境问题变得越来越紧迫了。尤其是，对于全球原油供应安全性和全球变暖的担心，使从生物质中生产碳燃料受到了关注。从长远来看，随着石油资源的开发变得越来越昂贵，化工行业将需要新的资源作为碳原料，生物质可以提供这种原料。

一个生产燃料或其他生物制品的最具体和最通用的路线是从生物质中得到的单糖。通过例如，发酵(Dodds DR.等,Science 318:1250-1251,(2007))或催化工艺(Huber G.等,Science 308:1446-1450(2005);Román-Leshkov Y.等,Nature 447:982-985(2007))，这些单糖可以被转化成燃料或生物制品。然而，选择性地从木质纤维素生物质生产糖类是具有挑战性的，其通常包括几个阶段。初始或“预处理”阶段包括从生物质中部分提取半纤维素和/或木质素部分。预处理能增加纤维素酶和木聚糖酶的催化位点，这些酶在第二阶段（即，水解）被加入以解聚纤维素和任何剩余的半纤维素。在预处理过程中，需要注意要尽量减少半纤维素的降解，半纤维素是一种主要由戊糖和少数己糖组成的聚合物。

各种预处理方法包括使用酸或碱溶液或单纯用纯水（通常是在较高的温度下）来解构半纤维素和木质素(Mosier N.等,Bioresource Technology 96:673-686(2005));Wyman C.等,Bioresource Technology 96:2026-2032(2005);Wyman C.等,Bioresource Technology96:1959-1966(2005);Wyman C.等,Biotechnology Progress 25:333-339(2009))。这些技术中的一些涉及使反应介质流过生物质（GuptaR.等，BiotechnologyProgress 25(2009);Liu C.等Applied Biochemistry and Biotechnology 113:977-987(2004)或在蒸汽闪爆情况下总混合物的爆发式减压(BuraR.等,Biotechnology Progress 25:315-322(2009))或氨纤维爆裂(BalanV.等,Biotechnology Progress 25:365-375(2009);Teymouri F.等,Bioresource Technology96:2014-2018(2005))。化学催化系统通常都对环境有害而且成本很高，同时热水系统由于转移量大和耗散问题而需要大量的能源。这些问题已经通过，例如，回收化学催化剂或开发填充床生物质反应器以增加混合的方式得到解决。然而，这些处理仍普遍存在高复杂性，高成本，低糖产率（即低效率）和不需要的副产品（例如糠醛类）产生量大的问题。

此外，目前使用的生物质转化过程通常明显缺乏通用性，在设备和条件大体相同的条件下处理的不同生物质原料的范围较窄。传统的做法通常需要使用明显不同的设备和/或工艺条件处理不同类型的生物质（例如，硬木和多年生草类）。由于现有生物质转化技术的这一明显局限性的障碍，使得与传统能源生产和使用相比，生物质-能量生成技术不具备竞争力。可以将单一方法应用于多种、或混合生物质原料中的任意一种的能力，使其具有了从任何可利用的生物质中生产有用的材料和能源的明显优势，并且无论生物质转化设备所在地的原料是本地区的还是非本地区的。

发明概述

本发明提供了一种环境友好型的方法，用于预处理各种生物质原料中的任何一种或其混合物。这个方法使生物质原料更易于随后的水解处理，从而有利地提高糖产量。对温度、压力、处理时间、以及二氧化碳和水的相对量都进行了仔细的筛选，以使得随后的水解过程中产糖率最大化，同时副产物最小化。

环境友好型方法的本质主要在于升高温度和压力条件下的超临界二氧化碳和水混合物的使用。溶剂、酸、和碱、以及其他昂贵且环境有害型的原料，本方法是不需要的。二氧化碳是无毒的，而且几乎可以被完全回收。此外，随后发酵过程中产生的二氧化碳可以在很大程度上补偿任何损失的二氧化碳。

即时预处理方法的一个特别的优点在于它在设备和条件大体相同时，处理各种不同的生物质原料时的通用性。这一能力与传统技术形成了鲜明的对比，传统技术通常在处理不同类型生物质时需要使用明显不同的设备和加工条件。即时预处理方法有效处理多种生物质原料或其混合物的能力具有明显优势，它能从任何可利用的生物质生产有用的材料和能源，无论生物质转化设备所在地的原料是本地区的还是非本地区的。

即时预处理方法的另一个显著优点是它能够与随后的水解工艺以一种连续的构造或模式进行整合（即，通过使用相同的设备，而不需要在多个预处理单元之间或向单独的水解单元进行转移）。在工业环境中，即时预处理方法可以采取连续管式反应器的形式，而不是非连续工艺，后者具有多个阶段和停机时间，通常需要较高的资金和较高的运行成本。

然而，即时预处理方法的另一个显着优点是其对高含量固体的运作能力。例如，即时方法的产率为固体含量的至少40wt%，这非常具有竞争力。预处理方法中的高固体含量将决定整个方法过程中需要多少水，而这些水最终要从终产物中分离出去。通常，固体含量越高，方法的能效就越高。

在特定的实施方式中，方法包括将生物质原料与150℃到250℃温度范围和高压下的水和超临界CO₂的两相混合物接触，维持10秒到100分钟。在一些实施方式中，优选压力在150-225bar或190-210bar的范围内。在其他的实施方式中，优选温度在155-200℃或160-170℃的范围内。在特定的实施方式中，处理时间大约为60分钟。在其他特定实施方式中，两相混合物的形成首先通过将生物质原料和水混合得到一种浆体，浆体的水分含量至少10%并且不超过85%，然后在密闭的反应器中向浆体提供液态二氧化碳（可能有多余的水）。

在其他的实施方式中，本申请描述的预处理方法是通过两阶段的温度方法而进行的，其中首先是最初的短暂的高温阶段，接着是更长时间的低温阶段。即时两阶段方法是对该技术的明显改善，原因至少为，其缩短了预处理方法的同时还使副产物最小化，并且对环境无害且成本效率高。在特定的实施方式中，两阶段方法包括最初的短暂高温阶段，其在至少200℃温度下进行1-20分钟，以及随后更长时间的低温阶段，其在不高于180℃的条件下进行40-100分钟。

附图简要说明

图1：不搅拌的25mL预处理反应器系统示意图。

图2：搅拌的1L预处理反应器系统示意图。

图3A-3D：含20wt%固体（生物质和水混合物）的混合硬木浆体预处理的综合产率图，该产率为200bar条件下预处理时间和温度的函数。该产率为酶水解（15FPU/g纤维素或19.6FPU/g葡聚糖）72小时后的产率。（A）葡聚糖至葡萄糖的产率。（B）木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖（半纤维素糖）至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率。（C）葡聚糖和甘露聚糖（戊糖）至5-HMF的产率。（D）木聚糖和阿拉伯聚糖（己糖）至糠醛的产率。

图4A-4D：在200bar的预处理时间和温度条件下，含40wt%固体（生物质和水混合物）的混合硬木浆体预处理的综合产率图，该产率为200bar条件下预处理时间和温度的函数。该产率为酶水解（15FPU/g纤维素或19.6FPU/g葡聚糖）72小时后的产率。（A）葡聚糖至葡萄糖的产率。（B）木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖（半纤维素糖）至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率。（C）葡聚糖和甘露聚糖（戊糖）至5-HMF的产率。（D）木聚糖和阿拉伯聚糖（己糖）至糠醛的产率。

图5A-5D：含40wt%固体（生物质和水混合物）的柳枝稷浆体预处理的综合产率图，该产率为200bar条件下预处理时间和温度的函数。该产率为酶水解（15FPU/g纤维素或22.8FPU/g葡聚糖）72小时后的产率。（A）葡聚糖至葡萄糖的产率。（B）木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖（半纤维素糖）至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率。（C）葡聚糖和甘露聚糖（戊糖）至5-HMF的产率。（D）木聚糖和阿拉伯聚糖（己糖）至糠醛的产率。

图6A-6D：含40wt%固体（生物质和水混合物）的混合多年生牧草浆体预处理的综合产率图，该产率为200bar条件下预处理时间和温度的函数。该产率为酶水解（15FPU/g纤维素或17.3FPU/g葡聚糖）72小时后的产率。（A）葡聚糖至葡萄糖的产率。（B）木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖（半纤维素糖）至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率。（C）葡聚糖和甘露聚糖（戊糖）至5-HMF的产率。（D）木聚糖和阿拉伯聚糖（己糖）至糠醛的产率。

图7：含40wt%固体（水和生物质混合物）的混合硬木单一温度方法预处理的产率柱状图。所有的产率均为在预处理（除非指明没有预处理）和酶水解（15FPU/gr葡聚糖）72小时之后的产率。预处理是在200bar下完成的，温度和持续时间显示在每组产率的图柱上。图柱代表葡聚糖至葡萄糖的产率（以“葡萄糖”表示）；木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率（以“半纤维素”表示）；以及木聚糖和阿拉伯聚糖至糠醛的产率（以“糠醛”表示）。术语“不搅拌反应器实验”是指在小型不搅拌反应器中的结果。术语“搅拌反应器实验”是指在1L的搅拌反应器中的结果。术语“大颗粒”是指颗粒尺寸达到或小于0.95cm时得到的结果，术语“小颗粒”是指颗粒尺寸达到或小于1mm时得到的结果。

图8：含40wt%固体（水和生物质混合物）的柳枝稷单一温度方法预处理的产率柱状图。所有的产率均为在预处理（除非指明没有预处理）和酶水解（15FPU/gr葡聚糖）72小时之后的产率。预处理是在200bar下完成的，温度和持续时间显示在每组产率的图柱上。图柱代表葡聚糖至葡萄糖的产率（以“葡萄糖”表示）；木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率（以“半纤维素”表示）；以及木聚糖和阿拉伯聚糖至糠醛的产率（以“糠醛”表示）。术语“不搅拌反应器实验”是指在小型不搅拌反应器中的结果。术语“搅拌反应器实验”是指在1L的搅拌反应器中的结果。术语“大颗粒”是指颗粒尺寸达到或小于0.95cm时得到的结果，术语“小颗粒”是指颗粒尺寸达到或小于1mm时得到的结果。

图9(1-3部分)：含40wt%固体（水和生物质混合物）的大颗粒混合硬木两温度阶段预处理的产率图。所有产率均为首先经200bar、200℃、不同持续时间的预处理，随后160℃60分钟，以及酶水解（15FPU/gr葡聚糖）72小时后的产率。部分1显示葡聚糖至葡萄糖的产率。部分2显示木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率。部分3显示降解产物的产率（木聚糖和阿拉伯聚糖至糠醛，以及葡聚糖和甘露聚糖至5-HMF）。

图10(1-3部分)：含40wt%固体（水和生物质混合物）的大颗粒混合硬木两温度阶段预处理的产率图。所有产率均为首先经200bar、200℃、不同持续时间，随后170℃60分钟，以及酶水解（15FPU/gr葡聚糖）72小时后的产率。部分1显示葡聚糖至葡萄糖的产率。部分2显示木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率。部分3显示降解产物的产率（木聚糖和阿拉伯聚糖至糠醛，以及葡聚糖和甘露聚糖至5-HMF）。

图11(1-3部分)：含40wt%固体（水和生物质混合物）的大颗粒混合硬木两温度阶段预处理的产率图。所有产率均为首先经200bar、210℃、不同持续时间，随后160℃60分钟，以及酶水解（15FPU/gr葡聚糖）72小时后的产率。部分1显示葡聚糖至葡萄糖的产率。部分2显示木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率。部分3显示降解产物的产率（木聚糖和阿拉伯聚糖至糠醛，以及葡聚糖和甘露聚糖至5-HMF）。

图12：含40wt%固体（水和生物质混合物）的大颗粒混合硬木两温度阶段预处理的产率图。所有产率均为首先经200bar预处理和酶水解（15FPU/gr葡聚糖）72小时之后的产率。预处理条件在每组产率的图柱上均有标注。图柱代表葡聚糖至葡萄糖的产率（以“葡萄糖”表示）；木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率（以“半纤维素”表示）；以及木聚糖和阿拉伯聚糖至糠醛的产率（以“糠醛”表示）。

图13(1-3部分)：含40wt%固体（水和生物质混合物）的大颗粒多年生牧草两温度阶段预处理的产率图。所有产率均为首先经200bar、210℃、不同持续时间，随后160℃60分钟，以及酶水解（15FPU/gr葡聚糖）72小时后的产率。部分1显示葡聚糖至葡萄糖的产率。部分2显示木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率。部分3显示降解产物的产率（木聚糖和阿拉伯聚糖至糠醛，以及葡聚糖和甘露聚糖至5-HMF）。

图14：含40wt%固体（水和生物质混合物）的大颗粒多年生牧草两温度阶段预处理的产率图。所有的产率均为200bar预处理和酶水解（15FPU/gr葡聚糖）72小时之后的产率。预处理条件在每组产率图柱上均有标注。图柱代表葡聚糖至葡萄糖的产率（以“葡萄糖”表示）；木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖至木糖、树胶醛糖和甘露糖的产率（以“半纤维素”表示）；以及木聚糖和阿拉伯聚糖至糠醛的产率（以“糠醛”表示）。

发明详述

本申请使用的术语“大约”通常是指在指示值的±0.5%、1%或不超过±2%的范围内。例如，大约150°C的温度通常是指，从广义上讲，150°C±2%（即，150°C±3°C，或147-153°C）。此外，术语“大约”可以指一个测量误差（即，由于测量方法的限制），或者也可以指某组物理特性的变化或平均值（例如，成分特性变化的水平）。

如本发明所述，超临界二氧化碳（也就是，SC-CO₂）和水的两相混合物被用作预处理的介质。正如本领域所理解，以及在本申请中所使用的术语“超临界二氧化碳”指的是二氧化碳相位处在其临界温度(T_c)或以上，以及临界压力(P_c)或以上。二氧化碳的临界温度大约31.1°C。二氧化碳的临界压力大约为73.9bar（72.9atm或1.072psig）。正如本领域已知，在超临界相时，二氧化碳兼具液体和气体的特性。这种双重性质使得SC-CO₂具备低粘度流体的优点（即，低表面张力的溶剂）和气体的渗透性。在即时方法中，这些双重特性显著提高了从半纤维素和木质素组分中分离纤维素组分的预处理方法的效率。本申请进一步发现，本申请中所述特定的两相混合物大幅改善了预处理方法。

SC-CO₂和水的两相混合物包括：i）主要由二氧化碳和一些水组成的超临界相，和ii）水相，主要由水和一些二氧化碳形成碳酸溶液。超临界相可能含有精确地，至少、不超过或小于，例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的水，或一定量的水，所述量由这些值中任意两个值的范围确定（其中％为摩尔百分比）。在一些实施方式中，CO₂超临界相用水饱和，其中可以理解，饱和所需的水的量（％）高度依赖于温度和压力。液体水相可能含有的二氧化碳精确为、至少、不超过或小于，例如，0.1％、0.2％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％或3％，或为一定量的二氧化碳，所述量由这些值中任意两个值的范围确定。

即时预处理方法中使用的温度优选约150℃至250℃的范围内。在不同的实施方式中，温度在下面任意两个温度之间的范围内：150℃、155℃、160℃、165℃、170℃、175℃、180℃、185℃、190℃、195℃、200℃、205℃、210℃、215℃、220℃、225℃、230℃、235℃、240℃、245℃和250℃。在不同的实施方式中，即时预处理方法中使用的温度优选在如下的温度范围内：155℃-250℃、160℃-250℃、165℃-250℃、170℃-250℃、180℃-250℃、190℃-250℃、200℃-250℃、155℃-225℃、160℃-225℃、165℃-225℃、170℃-225℃、180℃-225℃、190℃-225℃、200℃-225℃、155℃-200℃、160℃-200℃、165℃-200℃、170℃-200℃、180℃-200℃、190℃-200℃、155℃-180℃、160℃-180℃、165℃-180℃、170℃-180℃、155℃-175℃、160℃-175℃、165℃-175℃、170℃-175℃、155℃-170℃、160℃-170℃、165℃-170℃、155℃-165℃以及160℃-165℃。

在即时预处理方法中使用的压力优选至少为二氧化碳的临界压力，即至少74bar。这一压力在本申请中被称为“高”压或“提高的”压力。在不同的实施方式中，压力精确地、大约、或至少为，例如，80bar、90bar、100bar、110bar、120bar、130bar、140bar、150bar、160bar、170bar、180bar、190bar、200bar、205bar、210bar、215bar、220bar、225bar、230bar、235bar、240bar、245bar、250bar、260bar、270bar、280bar、290bar或300bar，或者前面任意两个示例的压力确定的范围内。在不同的实施方式中，压力优选为在如下范围内：150-250bar、150-225bar、150-210bar、150-200bar、150-190bar、150-180bar、160-250bar、160-225bar、160-210bar、160-200bar、160-190bar、160-180bar、170-250bar、170-225bar、170-210bar、170-200bar、170-190bar、170-180bar、180-250bar、180-225bar、180-210bar、180-200bar、180-190bar、190-250bar、190-225bar、190-210bar、190-200bar、200-300bar、200-250bar、200-225bar、200-210bar、210-300bar、210-250bar、210-225bar、210-220bar、225-300bar、225-250bar和250-300bar。

用上述两相混合物处理生物质的时间（也就是“处理时间”）通常为至少10秒，20秒，30秒或1分钟，以及通常不超过40、60、80或100分钟。在不同的实施方式中，处理时间可优选在下面任意两个时间确定的范围内：10秒、20秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟和100分钟。

生物质可以是本领域中已知的任何生物质原料。本申请中使用的术语“生物质”通常定义为含有纤维素组分的任意天然来源的原材料。通常，生物质原料包含至少一种组分，该组分选自纤维素，半纤维素和木质素成分，即通常在木材和其他木制纤维素植物材料中发现的成分。典型地，本申请中考虑使用的生物质原料包含纤维素（P-1,4-葡聚糖）、半纤维素和木质素所有这三种成分。通常，本申请中考虑使用的生物质既不是食物，也不是食物垃圾。

取决于生物质原料，纤维素的量至少、大约或不超过，例如生物质原料的30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%；半纤维素的量至少、大约或不超过，例如生物质原料的10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或45%；木质素的量至少、大约或不超过，例如生物质原料的5%、10%、15%、20%、25%或30%。生物质原料包含的纤维素、半纤维素和木质素的量可在上述示例性的量确定的范围内。生物质原料还具有其他特性，例如具有一定量的特定多糖，其可以形成纤维素和/或半纤维素。正如本领域内所熟知，纤维素几乎完全由葡萄糖的聚合物（也就是葡聚糖）所组成，而半纤维素含有其他几种多糖，包括木聚糖、甘露聚糖和阿拉伯聚糖。在一些实施方式中，生物质原料包含一定量的木聚糖，该量精确地为、大约、至少、小于或不超过，例如5、10、15、20、25或30wt%，或这些数值中的任意两个所确定的范围内。在其他实施方式中，生物质原料包含一定量的甘露聚糖，该量精确地为、大约、至少、小于或不超过，例如0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.5、1.7,2、2.5、3、3.5、4、4.5或5wt%，或这些数值中的任意两个所确定的范围内。在其他实施方式中，生物质原料包含一定量的阿拉伯聚糖，该量精确地为、大约、至少、小于或不超过，例如0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.5、1.7、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5wt%，或这些数值中的任意两个所确定的范围内。生物质原料的成分可用其他合适的标准进行分类，例如，元素分析和微量元素的鉴别。蛋白量或氮含量是其他的组成性特质，可用来表征生物质原料。蛋白含量可以是，例如，大约，不超过或小于，例如1、2、5、10、15、20或25%。

生物质原料可以是，例如，木材（例如硬木或软木）、草或其混合物（例如，多年生牧草或谷类植物）、甘蔗（例如，甘蔗渣）、纸、硬纸板和壳类材料（例如，谷壳或坚果壳）。本申请中考虑的一些特定类型的木材包含白杨木、松树、山杨、杉木、柳树、桦木、枫树、橡树、云杉和竹子。多年生牧草的一些例子包含柳枝稷（即黍属柳枝稷（Panicumvirgatum））、大须芒草、芒草、苜蓿、果园草和虉草。谷类植物的一些例子包括小麦、黑麦、燕麦、大麦、大豆和大麻，及来自其的稻草。壳类材料的一些特定例子是玉米秸，通常包含叶子、外皮、茎干或玉米穗轴中的至少一种。

正如本领域所熟知，事实上自然界发现的木质素组成都是不同的。木质素是一种随机的聚合物，不同植物物种的木质素具有明显的组成变化。而且，其他许多条件，例如环境条件和年龄，都会影响植物中木质素的含量。木质素主要在三种乙醇基团的比例上有差异。软木木质素由大约80wt%松柏醇，14wt%p-香豆醇和6wt%芥子醇组成。硬木木质素由大约56wt%松柏醇，4wt％p-香豆醇和40wt%芥子醇组成。牧草木质素中富含p-香豆醇。p-香豆醇，松柏醇和芥子醇的聚合分别形成木质素聚合物的p-羟苯基（H），邻甲氧苯基（G）和紫丁香基（S）组分。在不同的实施方式中，生物质原料的木质素包含松柏醇的量大约、至少、不超过或少于，例如，20wt%、30wt%、40wt%、50wt%、60wt%、70wt%、80wt%或90wt%，包含的p-香豆醇的量大约、至少、不超过或小于，例如，1wt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%、10wt%、20wt%、30wt%、40wt%、50wt%、60wt%、70wt%、80wt%或90wt%，包含的芥子醇的量大约、至少、不超过或小于，例如，1wt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%、6wt%、7wt%、8wt%、9wt%、10wt%、15wt%、20wt%、30wt%、40wt%、50wt%、60wt%或70wt%。

在一些实施方式中，经过预处理的生物质原料是一种单一类型的生物质原料。通过成为一种单一类型的生物质原料，生物质原料在其组成特性上变得完全或大体上相同，也就是说，将被处理的生物质原料之间在其组成特性上差异非常小或没有差异。上面已经对不同组成特性进行了描述，其可被用来确定生物质源的同质性或异质性。通常，来源于同种植物类型（例如柳枝稷）或其一个特定种类或品种的生物质构成一种单一类型的生物质。同一植物不同部分组成上的不同是很常见的，例如叶和茎之间，这种组成上的差异通常不被认为是混合的生物质，但在一些实施方式中对植物源的不同组分进行分离以及选择性处理植物的一个或两个部位是有优势的。

在其他的实施方式中，生物质原料是生物质原料的混合物。本申请中考虑了生物质原料的任意组合。这种组合可能是，例如，硬木和软木，或木材和多年生牧草，或不同的多年生牧草，或不同的木材，或不同的壳类材料，或木材和谷类植物，或草和纸，或木材和壳类材料，或这些种类原料的更多种的混合。

上述生物质原料类别或特定类型的一种或多种也可能排除在本申请所述的预处理方法之外。在特定的实施方式中，杨木和/或南方黄松是排除在使用的生物质原料之外的。

生物质通常被加载到高压容器（反应器）中，该容器适合通入二氧化碳，并和水一起可以被压成超临界状态。此类容器的设计和构造在本领域内是熟知的。在特定的实施方式中，使用上述两相混合物的预处理方法是首先将生物质原料和水进行混合，以获得浆体或湿的（即水分增加的）生物质原料，其含水量精确地为、大约、至少、或不超过3%、4%、5%、8%或10%,以及不超过60%、70%、75%、80%或85%。然后将液态或超临界CO₂加入到装有湿的生物质原料的容器中，其后CO₂连同湿的生物质原料一起被加压和加热，以形成上述的超临界-CO₂-水两相混合物。

在替代的实施方式中，补充的水可以和液态或超临界的CO₂一起被引入容器中。在这种情况下，CO₂典型地处于超临界状态，且水应处于加压的次临界液体状态。在特定的实施方式中，两相混合物的形成是通过将水和二氧化碳的混合物注入到装有生物质原料的容器中，其中，生物质在与二氧化碳和水的混合物接触前，其基本是干的并且含水量不超过或小于10%、9%、8%、7%、6%或5%。在其他的实施方式中，两相混合物的形成是通过将水和二氧化碳的混合物注入到装有生物质原料的容器中，其中，生物质在与二氧化碳和水的混合物接触前，比水和CO₂注入后形成最终混合物时要干一些，最终混合物的含水量不超过或小于60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。例如，某一地域的生物质有多达50-60%的水分，这样就需要将CO₂和水一起注入，将含水量从50%提升至60%。或者，生物质可能含有10%-15%的水分（典型的干燥地区生物质），将含水量提升至20%，并将剩余的水同CO₂一起注入以达到60%的水分。

预处理方法可以使用任何适宜的含水量。在不同的实施方式中，生物质的含水量可以精确地是、大约、至少、不超过、或少于，例如，3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65、70、75、80和85%。在其他的实施方式中，含水量可以在上述任意两个示例的含水量确定的范围内。

在一些实施方式中，醇类是排除在本申请所述的预处理方法之外的。在其他的实施方式中，不同种类有机溶剂（例如，醇类、酮类、醚类、及其类似物），或所有的有机溶剂中的一种或多种是排除在本申请所描述的预处理方法之外的。在其他的实施方式中，强的无机酸（例如硫酸、硝酸、或盐酸）和/或碱（例如氢氧化钠）是排除在本申请所述的预处理方法之外的。在特定的实施方式中，预处理方法只使用生物质原料、二氧化碳和水。

本申请所述处理方法使用的固体含量（即，“固体载量”或“生物质载量”）优选为至少20wt%。固体载量指的是方法起始时处理的生物质的量相对于生物质和方法用水总重量的量。一些生物质载量值精确、大约或至少包括，例如，20、25、30、35、40、45或50wt%，或者其某一范围内的载量值。

在特定的实施方式中，上述的预处理方法是通过两阶段的温度方法而进行的，其首先为最初的短暂的高温阶段（即，至少或200℃以上），接着是长时间的低温度阶段（即，小于200℃）。为了获得纤维素从木质素和半纤维素物质中分享的初始高效率，对最初短暂高温阶段的温度和持续时间进行选择。尽管高温条件下的持续处理可以显著加速纤维素的分离过程，然而延长在这一高温的处理过程将会显著提高副产物的生成率而造成不利影响，并会破坏有用的半纤维素部分。因此，为了达到借助低温减少副产物的同时继续进行分离过程的目的，其后使用了一个较长的低温处理阶段。两温度阶段的组合有利地克服了本领域存在的显著问题，即本领域的技术人员要么选择长的处理时间最小化副产物形成，要么选择短的处理时间但副产物形成的数量显著增加。即时两阶段方法能显著改善该项技术，原因至少为，通过本申请所述的超临界二氧化碳两相混合物，缩短了预处理方法的同时使副产物最小化，并且对环境无害兼具成本效率高。

在特定的实施方式中，两相方法包括初始的高温阶段，在精确为、大约、或至少200℃的温度下持续不超过到或小于20分钟，以及随后的更长的低温阶段，其在至少140℃和不超过或小于170℃、180℃或190℃的条件下持续10-120分钟、30-120分钟、或40-120分钟。可以理解，处理时间选自上述示例性的范围，使得高温阶段持续时间短于低温阶段。在不同的实施方式中，在最初的短暂高温阶段使用的温度精确地、大约、或至少是，例如，200℃、210℃、215℃、220℃、225℃、230℃、235℃、240℃、245℃或250℃，或是在上述意何两个示例温度确定的范围内。其中，通常高温阶段维持的时间应精确地、大约、不超过、或少于，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20分钟，其中通常以更高的温度维持更短的时间以获得相同或类似的结果。在不同的实施方式中，在更长时间的低温阶段使用的温度精确地、大约、不超过、或少于，例如，190℃、180℃、175℃、170℃、165℃、160℃、155℃、150℃、145℃或140℃，或者在上述任意两个示例温度确定的范围内。低温阶段维持的时间精确地或大约为，例如，10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120分钟，或者在上述任意两个示例的值确定的范围内。

在两阶段温度的方法中，温度可以被快速地或缓慢地调整（例如，通过一个特定的温度变化速率）。例如，温度可以精确地、大约、或至少增加到200℃，持续不超过或者少于20分钟，然后以一个恒定的或变化的速率将其降低（例如，0.1至100°C/min）至低温（如前所述）。降温阶段可以在整个方法过程中持续进行，或直至达到低温阶段的温度时即可。在一些实施方式中，可以按照一定的变温速率逐渐获得高温（从，例如，室温开始）。然后，随后的低温可以按照一定的变温速率突然地达到（例如，在30秒或1分钟内）或逐渐地达到。降温阶段的任何时间都可以插入一个或多个平台阶段，在所述平台阶段维持某一中间温度一段时间。

在预处理方法中，生物质通常被破碎到一定尺寸水平，使其可以被有效地处理。生物质颗粒的平均尺寸可以是任何适宜的尺寸。在不同的实施方式中，生物质颗粒的平均尺寸为大约、至少、不超过、或小于，例如，10cm、8cm、7、cm、6cm、5cm、3cm、2cm、1cm、5mm、2.5mm或1mm。上述提供的示例性尺寸可以代表对生物质颗粒所有三个维度上的限制，或者，是代表生物质颗粒至少一个或两个维度。

本发明也可以用于上述预处理方法后进行酶水解方法的工艺中，酶水解将预处理的生物质转化为可发酵的糖类，其主要为单糖，例如葡萄糖。在一些实施方式中，预处理的生物质从高压容器转入到水解单元，并使用任何本领域熟知的传统水解技术和条件进行处理。这在本领域内已较为成熟，预处理的生物质通常与纤维素酶进行反应以促进水解。在其他的实施方式中，上述的预处理方法后是一个连续进行的水解阶段。因为是一个“连续的过程”，预处理和水解过程使用的是相同的设备，不需要将预处理的生物质转移到一个独立的水解位点。例如，预处理后原料可以进行降压降温，而且持续将其泵过一个连续的管道系统。这避免了不连续单元操作，例如不同反应器的使用。事实上，与相同高固体混合物且没有CO₂的情况相比，CO₂用作水的助溶剂将使总的混合物可以容易泵过一个管状的预处理系统。这样一个连续的系统能够直接供给连续的酶水解管式反应器中，而使整个系统连续起来。

本申请所述的预处理方法大幅增加了纤维素酶在随后水解步骤中的可用性和消化能力。预处理方法的效率，在很大程度上，是通过随后水解步骤获得的糖产率而进行表示的。优选地，本申请所述的预处理方法可以获得至少50%的糖产率。在其他的实施方式中，本申请描述的预处理方法可以获得至少55%、60%、65%、70%、75%或80%的糖产率。

本发明的另一方面，本申请所述的方法进一步包含了将水解步骤产生的单糖转化为有用的日用品，尤其是乙醇、液态烷烃类生物燃料、或碳基日用化学品（即“生物材料”）。乙醇、烷烃类生物燃料和生物材料的发酵和催化方法在本领域是熟知的。不同的碳基日用化学品可以从单糖中生产(Dodds DR.等,Science 318:1250-1251,(2007))。例如，通过发酵生产的乳酸，可以用化学方法转化为乳酸甲酯、丙交酯和聚乳酸（PLA）。特别是PLA，可以作为聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的一种生物可降解替代品。琥珀酸也可以由单糖生产获得，而且可以被用于替代马来酸酐，目前马来酸酐由丁烷生产。马来酸酐可以被用作生产聚合物和工业溶剂的起始材料。儿茶酚和其它芳族醇，也可由单糖类生产获得，其可以取代目前依赖环境有害的苯作为起始原料的生产方法。

因其生产中依赖可再生的和生态友好的来源，纤维素衍生的乙醇和其他生物燃料越来越多地被视为优选的替代燃料。当生产生物燃料的生物质是植物的纤维素部分（如玉米秸秆或壳类材料）时，这种生物燃料的生态效益是显而易见的，这些部分通常是收获的农作物中不可食用和没用的副产品。典型地，这些纤维素残余物或者被丢弃、用作肥料、或者饲料。这样，通过使用这一没用的纤维素副产物，可以避免竞争使用自然资源和食物资源。此外，由于纤维素副产品作为燃料来源不需要进行特别的生产，因此他们的生产并不需要任何额外开支，因此它们廉价而来源丰富。

在乙醇的发酵过程中，水解步骤产生的游离糖和/或寡糖被置于发酵条件下用于生产乙醇。发酵过程在本领域内是熟知的。典型地，发酵通过一种或多种发酵微生物与生产的糖混合后在适宜的发酵条件下完成。对于酵母（例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae））来说发酵培养基典型地可以加热，例如，到20-40°C，或者对于嗜高温微生物（例如高温厌氧菌株），可以加热到更高的温度。然后将乙醇从培养基中移除，典型地通过蒸馏，留下发酵过程水。

在水解和乙醇发酵过程中遇到的显著问题是，在预处理方法中抑制性化合物的产生（例如，乙酸盐、糠醛、酮类和醇，如羟基芳烃）。典型地，抑制剂化合物包括羧酸（即，羧酸盐）、糠醛（即，2-糠醛）、5-羟甲基糠醛（5-HMF）和酚类化合物中至少一个或多个化合物。该羧酸可以是，例如，乙酸（醋酸）、丙酸或高级酸，或它们的去质子化的（例如，盐）的形式。酚类是典型的木质素降解产物。酚醛树脂可以是，例如，苯酚、愈创木酚、丁子香酚、甲酚、二甲氧基苯酚、4-羟基苯甲醛（4-HB或HB）、香草醛、香草酸（VA）、高香草酸、丁香醛、3,4,5-三甲氧基苯甲醛、4-羟基苯乙酮（4-HAP或HAP）、香草乙酮、乙酰丁香酮、4-羟基苯甲酸、丁香酸、3,4,5-三甲氧基苯乙酮、阿魏酸、咖啡酸、芥子醇、松柏醇和p-香豆酸。抑制剂化合物的有害影响为抑制一个或多个方法步骤（例如，水解或发酵过程），从而使乙醇的生产水平下降。特别是，醋酸通常产自乙酰化阿魏酸的水解，其与生物质半纤维素部分相关联。另外，生物质固体载量提高，抑制剂化合物的积累也随之增加。

本申请描述的预处理方法优选地将抑制剂化合物的产生最小化。因此预处理方法的效率在很大程度上是由抑制剂化合物的产量而确定的。优选地，本申请描述的预处理方法可以使抑制剂化合物（特别糠醛和/或其衍生物）的产生不超过或小于30%。在其他的实施方式中，本申请描述的预处理方法使抑制剂化合物的产生不超过或小于25%、20%、15%、10%、5%、2%或1%。

下文所述实施例是为了对本发明进行举例说明和对本发明某些特定实施方式进行描述。然而，本发明的保护范围从任何方面来说都不受到本申请中所列出的实施例的任何限制。

实施例

总述

本申请提供的特定、非限制性实例中，硬木以20和40wt%固体含量进行预处理。柳枝稷，玉米秸秆，大须芒草和混合多年生草本植物（共培养的大须芒草和柳枝稷）以40wt％的固体含量进行预处理。操作温度范围从150°C到250°C，保持时间从20秒到60分钟。预处理后，样品进行酶水解处理。总得率由葡萄糖、半纤维素糖以及糠醛和5-HMF两个降解产物确定。将反应曲面作为温度和保持时间的函数，对不同含水量和生物质种类进行比较。170°C预处理60分钟，对于固体含量20%的混合硬木和40%的混合多年生牧草可以分别获得77%、73%和68%的葡萄糖产率。160°C预处理60分钟，柳枝稷可以获得81%葡聚糖到葡萄糖产率，玉米秸秆为85%。

材料和方法

使用了五种不同的生物质种类：混合硬木（来自纽约，2007年收获），柳枝稷（2009年秋在纽约，伊萨卡岛附近收获），混合多年生牧草（柳枝稷和大蓝茎共培养物，2009年秋纽约，伊萨卡岛附近收获），大须芒草（2009年秋纽约，伊萨卡岛附近收获）和玉米秸秆（来自国家可再生能源实验室，Golden,CO,2009年）。所有种类的生物质都进行烘干，使其含水量在7-12%之间。生物质使用切割碎机(

威明顿，北卡罗莱纳州)减小尺寸，用1mm的筛将灰尘颗粒除去，这些颗粒在筛分时会损失(美国标准400筛,E.H.Sargent andCo.,芝加哥，伊利诺依州)。预处理前、预处理后和清洗后，通过烘箱105℃12小时和干燥器中5小时处理前后的称量重量变化，可以确定生物质的含水量。

对生物质原料进行中性洗涤纤维（NDF），酸性洗涤纤维（ADF），洗涤木质素（木质素）的分析。所有这些分析都用Dairy

(纽约，伊萨卡）通过Van Soest PJ等描述的方法进行分析。(Van Soest PJ等,J.Dairy Sci.74:3583-3597(1991))。生物质原料进一步分析了其葡聚糖，木聚糖，阿拉伯聚糖和甘露聚糖，使用美国国家可再生能源实验室开发的实验方法(SluiterA.等,NREL Analytical Procedure,Google Scholar(2004))。所有本研究中使用的生物质原料的结果，见下表I。

表I：生物质分析结果。NDF表示中性洗涤纤维，ADF表示酸性洗涤纤维。葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、和阿拉伯聚糖测量的范围以90％的置信区间范围表示。

预处理

生物质颗粒与去离子水混合以获得所需的含水量（本研究中为80或60wt%的含水量）。所得浆体（2g干物质和3g或8g水）被加载到不锈钢反应器中，图及详细描述见图1。不锈钢预处理反应器由外径O.D.为2.54cm(1”)的20.3cm(8”)介质压管（a）和相应的末端装置（b）(Autoclave

伊利，宾夕法尼亚)组成。热电偶（T）在反应器的顶部，并放置在离开反应器底部2cm和生物质填充床中心的地方。反应器顶部连接钢制的隔离罩，以及4通的介质压力装置（c），其连接到针形阀（d）(Autoclave

伊利，宾夕法尼亚)、压力计（P）和安全隔膜（e）(ETS,伊利，宾夕法尼亚，压力等级:282bar)，用外径0.635cm(1/4”)的介质压力管(Autoclave

伊利，宾夕法尼亚)连接。形成的反应器标称体积为25mL。沙浴加热器通过温度反馈回路进行控制（Tc）。

反应器关闭后，通过增加压力进行净化，并通入30到35bar的CO₂五分钟。液态CO₂从虹吸罐中装载到反应器中，生成60bar的压力。流化沙浴(伯灵顿，新泽西)被提前加热到目标反应温度以上大约100±20℃的温度。反应器然后被放入沙浴中，沙浴温度设定在目标反应器温度以上10到20℃的温度。此时，压力在2-到30秒内升高到200bar。其后，缓慢放气使反应器维持压力在200±10bar。反应器内部温度在10±1分钟内达到目标温度(±5℃)(典型的反应器温度曲线见补充信息文件)。选择的起始沙浴温度要能满足这一情况。保持过程中，反应器内部温度维持在目标温度5℃以内。后文中，本研究中报告的所有保持时间对应的都是加热阶段结束和反应器转移到冰浴之间的时间。反应器没入到冰浴中会使反应器温度在大约20秒钟时间内降低100℃，这样可以使反应速率降低为可以忽略。所得浆体使用

滤布(

达姆施塔特，德国,38μm孔径)过滤，并用1升去离子水进行清洗。

当使用大的1L搅拌式反应器时(相对于图1中小的反应器)，生物质颗粒与去离子水混合以获得所需的40wt%干固体含量。所得浆体（60g的干物质和90g的水）被加载到一个1L的搅拌式反应器中（见图2）。由高压不锈钢容器组成的1L搅拌式反应器使用磁控叶轮转轴进行搅拌（Autoclave

伊利，宾夕法尼亚的系统)。叶轮为定制加工的，以优化整个方法过程中生物质的混合。液态CO₂从CO₂虹吸箱通过CO₂泵（

Process,Pittsburg,Pa）进行递送，泵连接至冷却机(

Scientific,沃尔瑟姆，马萨诸塞州)以避免压缩过程中CO₂的相变。为使CO₂进入时的分散最大化，CO₂通过反应器系统配备的多孔金属散布器进行递送。胶体冷却线圈（反应器上配备的）通过阀连接到建筑给水，以使反应器快速冷却。使用电加热套进行温度控制。用背压调节器(BPR,

Elk River,MN)使压力维持在目标压力。使用加热带（Omega

Stamford,Co)）防止CO₂降压时BPR的过度冷却。

反应器用CO₂加压除空气，使其达到20bar的压力，然后放气，重复此操作5次。然后液态CO₂从虹吸罐中装载到反应器中，产生大约60bar的压力。使用电加热套加热反应器到达目标温度，其使用的是比例式、积分和微分控制器，其配有Autoclave

(Erie,Pa)提供的

软件。温度和压力使用相同的软件进行记录。使用背压调节器（BPR），反应器逐渐放气以维持反应器200±10bar的压力。水的损耗认为是可以忽略的，因为气体是在室温下排出（在这一状态下，CO₂中水的饱和浓度很低；(DuanZ.等,Chemical geology 193:257-2712003))。加热30到45分钟后，反应器内达到目标温度(±5℃)（典型的反应器温度曲线见补充信息）。本研究报道的所有保持时间均对应于反应器在目标温度5℃范围内的时间。给反应器内冷却盘管通水，使反应停止。一旦冷却水阀打开，反应器温度典型地在大约1分钟内降低100℃，这使反应速率降低到可以忽略。

当进行第二阶段预处理时，额外的CO₂用泵加载到反应器中，以弥补第一阶段排掉的CO₂。一旦加热开始，压力就维持在类似于第一阶段的200±10bar。加热到目标温度后，随后以初始阶段相同的方式进行温控和冷却。一旦这些阶段完成，所得生物质使用

的滤布(

达姆施塔特，德国，38μm孔)和1L的去离子水进行清洗和过滤。

酶水解

清洗后的固体在0.05M的柠檬酸钠1wt%纤维素溶液中进行水解，溶液中包括15FPU/(g纤维素)的spezyme

纤维素酶、30(mg蛋白）/(g纤维素）的

木聚糖酶（两个酶均来自Genecor,哥本哈根，丹麦)以及30CBU/(g纤维素)的

β-葡糖苷酶(Novozyme,Davis,Ca)。加入环十二碳三烯（30mg/L）和四环素（40mg/L），以防止长菌。假定在预处理中没有纤维素的损失，用质量守恒的方法确定纤维素含量。在4、24、72和44小时取样150μL。通过在微型板加热块中95℃加热5分钟终止水解。

为了确定预处理液中低聚物的量，10mL 0.05M柠檬酸缓冲液在50℃下孵育72小时，缓冲液中含有2mL预处理液，0.01FPU/mL的spezyme CP、0.02CBU/mL的Novo188β-葡糖苷酶和0.03mg/mL的

木聚糖酶蛋白。对于在1L搅拌式反应器中进行的试验，使用替代的低聚物测定试验(Sluiter A.等,NREL Analyical Procedure.Google Scholar(2004))。加入硫酸，得到一个4wt％的酸溶液，将所得溶液在一个台式高压釜（VWR，西切斯特，宾夕法尼亚州）中加热至121℃将低聚糖解聚1小时。糖的对照品（含有相当数量的葡萄糖和木糖），以类似的方式处理以矫正降解。然后将产物用碳酸钙中和，并过滤进行分析。然而，两种低聚物测定试验都得到了统计上相同的结果。所有的酶水解实验一式三份进行检测，以计算结果的90%置信区间(Bobleter O.,Progress in Polymer Science19:797-841(1994);Kim K.等,Bioresource Technology 77:139-144(2001);Mittal等,ChemicalEngineering Science 64:30313041(2009))。

液体分析

对预处理液体、酶促水解样品、和低聚物测定所得样品分析其中葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、糠醛、5-羟甲基糠醛（5-HMF），使用配有Aminex P-Column柱(Biorad,Hercules,CA)的岛津液相色谱系统(Shimadzu,京都，日本)进行分析。分析标准购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州)。

产率

使用液相色谱法测定预处理和酶水解中葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、糠醛、5-羟甲基糠醛的浓度，以计算产率。以预处理和酶水解72小时后该化合物最大可能产量的摩尔百分数表示产率系数，Y_i。

$Y_g=\frac{{\mathrm{Mo}}_{g,\mathrm{Pr}}+{\mathrm{Mo}}_{g,E}+{\mathrm{Mo}}_{g,\mathrm{Ol}}}{P_g}\×100$

$\begin{array}{c}{Y}_h=\frac{{\mathrm{Mo}}_{x,\mathrm{Pr}}+{\mathrm{Mo}}_{x,E}+{\mathrm{Mo}}_{x,\mathrm{Ol}}+{\mathrm{Mo}}_{m,\mathrm{Pr}}+{\mathrm{Mo}}_{m,E}+{\mathrm{Mo}}_{m,\mathrm{Ol}}+{\mathrm{Mo}}_{a,\mathrm{Pr}}+{\mathrm{Mo}}_{a,E}+{\mathrm{Mo}}_{a,\mathrm{Ol}}}{P_x+P_m+P_a}\×100\\ Y_5=\frac{{\mathrm{Mo}}_{5,\mathrm{Pr}}}{P_x+P_a}\×100\end{array}$

$Y_f=\frac{{\mathrm{Mo}}_{f,\mathrm{Pr}}}{P_g+P_m}\×100$

变量Mo_i，j和P_i指过程j中获得的单体或多聚体化合物i的摩尔数。下标g、h、x、m、a、5和f分别表示葡萄糖、半纤维素糖（即木糖、甘露糖和阿拉伯糖）、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、5-羟甲基糠醛或糠醛。下标Pr、Eand Ol分别表示在预处理(Pr)、酶水解（E）72小时或低聚物测定（Ol）中，得到的化合物。葡萄糖和，较小程度的木糖，可以产生除了5-HMF和糠醛外的降解产物，而且所有的降解产物可以进一步降解，尤其是在温度接近240℃时(Bonn G.等,Journal of Radioanalyical and Nuclear Chemistry 79:171-177(1983);Dunlop AP,Industrial&Engineering Chemistry 40:204-209(1948))。然而，这些产物仍然是预处理中很好的糖降解指示物。

为了进行产率计算，预处理后反应物的质量（水和生物质）损失（通常在4至9%之间）是可被忽略的。事实上，这些损失和预处理的温度和程度没有关系，因此，假设其是由于蒸发、材料转移过程中的损失、以及生物质粘附在反应器壁上造成的。在某些情况下，特别是当柳枝稷在高温（210℃）长时间（6分钟或更长时间）地预处理时，质量损失会超过10wt％（可达17％）。在这种情况下，任何超过10wt％的质量损失都要考虑到产率计算中。

硬木的预处理

20wt％的预处理和糖化

20wt％固体含量的硬木浆体，在150℃和200℃之间的温度，预处理20秒至60分钟。预处理的硬木酶解后测量的最高Y_g值在75和77％之间（图3A）。所有在此范围内的这三个Y_g测量值等同于2至3.6个百分点的变化值。在170℃至180°C温度范围保持20到60分钟的时间获得的产率最高。对于170℃以上的预处理温度，酶水解4小时后，产率可达到72小时产率（Y_g）的53至68％。对于170℃及以下的预处理温度，4小时后，产率可达到72小时的39至47％。在预处理温度低于200℃时，90％至95％测定的和用于计算Y_g的葡萄糖都在酶水解的过程中产生。温度为225℃至230℃以及对于250℃时，酶水解产糖分别占产生的总糖的83％至88％，和56至75％。在预处理中随着温度的升高质量损失增加，也证实了上述的结果，（从50℃保持1小时时的6％，到250℃保持1分钟时的几乎80％）。这样的结果与Bobleter O.在Progress in Polymer Science,19:797-841(1994)中报道的温度超过220℃以上的葡聚糖解聚的结果是一致的。

如图3B所示，在达到150°C开始下降之前，Y_h值几乎与温度呈线性地增加到某一值，该值是160℃、60分钟时的28±1%。然而在200℃保持20分钟时得到的Y_h为31±5%。半纤维素的产糖量介于60％和90％是因为酶水解过程中释放的糖。当预处理温度低于200°C时，此范围缩小为63％至68％，由此表明，在较高的温度下，预处理中释放的大部分半纤维素糖类被降解。

图3C显示，在所有的实验中只有相对少量的5-HMF产生，预处理温度为215℃到230℃时产生最多4-5％的量。这是由于预处理中产生的木糖增加了。预处理温度为200°C和230、保持时间分别为20分钟和2分钟的情况下，观察到糠醛的产率高达23％（参见图3D）。与预处理中戊糖的释放一致，糠醛产量随着温度和保持时间趋于减小，但在250℃时较低，这可能是由于糠醛本身的快速分解造成的。

40wt％的预处理和糖化

由于20wt％的固体混合物在高于200°C的温度下预处理，观察到较低产率和更高副产物形成，40wt％的固体混合物的实验温度范围被限制在150和200℃之间进行。保持时间的标称范围从5分钟到60分钟。

如图4A所示，最高的Yg是170℃的预处理温度和60分钟的标称保持时间下的73±5%。在67至69％的范围内报道的三个Yg值在统计学上相等，这表明160℃至180°C的温度和30分钟至69分钟的保持时间范围内的灵敏度有限。因此再次地，观察到的最大Yg或者是在低温和较长的保持时间下，或者是在更高的温度和较短的保持时间下。酶水解过程中Yg在87％至95％之间，证实预处理温度低于200℃时，很少有葡聚糖发生解聚。对于160℃以上的预处理温度，酶水解4小时后，产率可达到72小时（Y_g）的78到89%。低于此温度时，4小时后，产率为72小时数值的53到64%。

温度为150℃到160℃、保持时间60分钟时，观察到的半纤维素糖产量为18％和19％（图4B），以及在190℃、15分钟保持时间下，最大Y_h为24±5%。此最大Y_h正好与酶水解过程中释放的最低糖分数（53％）相符合。对于其他的预处理条件下，酶水解过程中产生的Y_h值为62％到85％，没有可辨别的趋势。图4C，再次显示，非常低的Y_5-HMF值，表明六碳糖的降解有限。糠醛产量，如图4D所示，随着温度和保持时间增加至15％和19％之间。

柳枝稷预处理及糖化

混合硬木的20wt％和40wt％固体浆体预处理得到的产率相似。由于处理高固体含量的方法优势，下面的预处理只在150℃和200°C的温度、标称保持时间为5分钟到60分钟的条件下，处理含有40wt％干固体的浆体。

温度为160℃和170℃、保持时间为60分钟的糖产量（图5A）最高，产率分别为79％和81％。如表II中所示，预处的理柳枝的Yg值高于未经处理的生物质的8倍。预处理温度为180℃、保持时间为15分钟时，获得的Y_g为72％。所有其他的产率都在50%到70%之间。酶水解4小时后，产率可达到72小时数值的80%到92%。预处理温度低于200°C时，葡萄糖产率为92％和95％之间，这是由于酶水解过程中葡萄糖的释放。预处理温度为200°C时，酶水解获得的葡萄糖部分下降至83％和87％之间。

在170℃、15分钟和30分钟的保持时间，以及150℃、60分钟的保持时间的预处理情况下，半纤维素糖产量高达16％至17％（图5B）。温度和保持时间的其他组合，得到的产率在9％和15％之间。这些组合产率中，酶水解过程中释放的糖占62％到73％不等。在所有条件下，己糖转化为5-HMF的量都是非常有限的(图5C)。戊糖到糠醛（图5D）的转换随温度和保持时间的变化不大，保持在10％至15％的产率范围内。

表II：生物质分析结果。NDF表示中性洗涤纤维，ADF表示酸性洗涤纤维。所有测量以90％的置信区间范围表示。

混合多年生牧草的预处理和糖化

用含有wt40％干固体的浆体，在150℃和200°C的温度之间，标称的保持时间在5分钟和60分钟之间对混合多年生牧草进行预处理。与柳枝稷实验同样的理由，实验仅对40wt％的固体进行处理。

如图6A中所示，最高的Y_g值，68±1%，是在170℃的预处理温度和15和60分钟的标称保持时间下观察到的。这相当于未经处理生物质Y_g值的5倍（参见表II）。酶水解4小时后，产率可达到其72小时数值（Y_g）的79%到86%。报告的葡萄糖中87%和94%是酶水解过程中释放的糖。最高Y_h值（图6B）为9％，这是在温度160℃、保持时间60分钟预处理下观察到。所有其他的产率都在5%到8%之间。再次地，在所有情况下己糖转化为5-HMF的量都是非常有限的(图6C)。戊糖降解产生的糠醛产率，见图6D，的范围为180℃、15分钟预处理时的14％至150℃、60分钟预处理时的4％。

固体含量的影响

通过比较图3A和图4A可见，生物质固体含量的变化对葡萄糖终产率的作用有限。固体载量在40wt％和20wt％之间的Y_g变化始终在10个百分点以下。此外，40wt％固体载量可以更早地获得72小时的终产率。酶水解72小时后产率没有显着的变化。图3A和图4A中所示曲面，与在类似的温度和保持时间下得到最大产率相似。然而，在较高的固体含量时，Y_g对温度的敏感较弱。20wt％载量时Y_g在170℃至150℃之间随温度的变化（图3A）比40wt％载量的变化（图4A）更剧烈。热传递可能是这种差异的重要原因。事实上，具有较高固体含量的浆体的热传递效率较低。因此，它需要的初始砂浴温度高于20wt％固体浆体实验约20°C的温度，来达到同样的加热时间。增加沙浴温度可能会导致在反应器内更大的温度梯度，通过使其混合物的一部分经受更高的温度，将增加较低温度下预处理实验的产率。

40wt％的浆体得到的半纤维素糖的产率，大约是20wt％预处理得到产率的一半。然而，图3B和4B所示的响应曲面表现出类似的趋势和最大的葡萄糖产率。再次地，较高固体含量实验的产率对温度变化较不敏感。较低的Y_h值，可能是由于在预处理中戊糖降解增加或者是半纤维素解聚的减少。然而，无论是糠醛还是5-HMF的产率，都不会随着浆体的固体含量增加而显着增加。反应器中水的受限和热点的存在，可能导致局部半纤维素热分解加速。这一解释同Serapiglia MJ等,Bioenergy Research 2:1-9(2009)的观察结果是一致的，其报道了175-220℃之间连续加热2分钟时，可测量的生物质降解情况。

生物质种类的影响

生物质种类以大约恒定的值表现出产值变化（图4，图5和图6）。事实上，在不同条件下产率的变化本质上是一样的。例如，不管什么条件下，柳枝稷的Y_g值表现出始终比其他物种的要高出10个百分点。产率的最大值始终出现在温度160℃和170℃、保持时间1小时条件下。木材的半纤维素糖产率是最高的，柳枝稷的略低一点，混合多年生牧草的更低。糠醛的产率的变化也相似。

1L搅拌式反应器中搅拌和颗粒尺寸的影响。

混合硬木的预处理

为了进行进一步的试验，构建了一台1L的搅拌式反应器（见图2）。大的反应器允许使用较大的生物质颗粒，这些颗粒经磨碎能通过3/8英寸(0.95cm)的筛。这些颗粒尺寸相当于工业中使用的更实际尺寸。混合可以大大降低热梯度，这种热梯度通常认为在小规模的反应器系统中发生，此外还可以帮助限制任何高温分解的影响，其可能会导致较低的单糖收率。

如前所述，当在25毫升不搅拌的反应器中对固体含量40wt％的混合硬木在160℃和170℃预处理60分钟时，可以获得67%和73%的葡聚糖到葡萄糖产率（Y_G，图7中标记为“葡萄糖”），以及18%和14%的半纤维素糖产率（Y_H，图7中记为“半纤维素”）。如图7所示，在1升搅拌反应器中在160℃和170℃条件下，对相同的小颗粒（<1mm）进行预处理60分钟时，Y_G从67%减小到22％（160℃）以及从73%减小至57％（170℃），而Y_H从小于20％显著增加到39％（160℃）和42％（170℃）。然而，它们在180℃和190℃进行预处理60分钟时，Y_G均为69％（参见图7）。

正如在先前的结果中讨论，上述结果似乎表明在不搅拌的系统中存在温度梯度。这些梯度导致在反应器中的某些区域会有更高的温度（相比温度更加恒定的混合系统，其会增加Y_G值），但通过在反应器内形成热点它们也可以降解半纤维素糖（与混合系统相比，这会降低Y_H而增加Y_F，Y_F在图7中标记为“糠醛”）。此外在预处理温度下，曾观察到水分含量较高，即为80wt％时（相对于此处60wt％的水分含量），会导致Y_G值随预处理温度更快的下降。因此假定，干燥的底物倾向于增加热梯度，使产率随温度的变化变得“扁平化”。这里似乎发生了一个类似的现象，除了梯度是通过混合减小的，而不是通过增加溶剂的导热性能。当使用1升的搅拌反应器时，为了获得与不搅拌反应器中类似的产率，优选温度为180℃或更高并保持60分钟，这可能表明，实际上，这一温度是不搅拌反应器中的平均温度。

当较大的颗粒（即，<0.95厘米）在搅拌反应器中进行预处理时，葡萄糖产率一般低于相同条件下预处理的小颗粒（即，<1毫米）所得产率约10个百分点（参见图7）。唯一的例外是190℃预处理一小时，其得到了76％的Y_G。较大颗粒的所有半纤维素糖产率（Y_H）较低，而糠醛产率（Y_F）则大致相当。因此，由于粒径增加而使质量转移受到限制，这似乎影响了产率，并且为了获得与更小颗粒类似的产率，需要更高的温度。最后需要注意的是，预处理的硬木可以获得比未处理的硬木更高的葡聚糖和半纤维素转化率（Y_G高出15倍，Y_H高出8-10倍）。

柳枝稷的预处理

在不搅拌和搅拌式反应器中以及小颗粒和大颗粒处理得到的不同产率见图8。搅拌式反应器相比不搅拌的反应器，始终可能获得得较低的Y_G值。然而，除了温度190℃外，Y_H值普遍较高。再次的，这些结果可以归因于搅拌的系统中更均一的温度。

在搅拌式反应器中预处理较小颗粒获得的Y_G值会迅速增加，但在60％左右快速趋于平缓。然而，较大颗粒的Y_G值随着温度连续上升，达到不搅拌反应器中获得值的10个百分点内。半纤维素糖产率（Y_H）最初随着温度而增加，直至170℃，此后糖产率随温度升高而急剧下降。相比不搅拌的反应器，搅拌的反应器中170℃60分钟时观察到Y_H的急剧增加（从13％到48％），这进一步表明温度梯度的存在。然而当使用搅拌式反应器中时，糠醛产率（Y_F）比不搅拌的反应器中的更大或相同。因此，没有温度梯度可能会减少糠醛本身的降解、或降低其他形式的半纤维素降解，如热分解。

两阶段温度预处理方法的结果

绝大多数文献中的预处理实验使用的是单一温度的阶段（即对于一个给定的保持时间，只有一个温度）。然而，考虑到在酸性或中性介质中生物质的典型反应化学特性，在预处理中使用一个以上的温度可能是有利的。事实上，半纤维素解聚会产生低聚物，低聚物解聚为单体，单体又降解为不需要的副产物，如糠醛(Esteghlalian等,BioresourceTechnology 59:129-136(1997);Mittal等,Chemical Engineering Science 64:3031-3041(2009);Mittal等,Holzforschung 63:307-314(2009)。该反应网络的连续性质使得糠醛生产滞后于寡糖和单糖。在(Mittal等,Chemical Engineering Science 64:3031-3041(2009))的建模和实验结果中表现地特别明显，当枫木，杨木用水在175℃处理时，在糠醛开始出现前，木糖和低聚木糖浓度就有显著增加。为了解决这个问题，本发明试图通过在此降解产物形成的初始滞后阶段使用短暂的高预处理温度，然后接着在较低温度下进行更长时间的预处理，这样单体的降解就不太明显（即，短暂高温阶段后，紧接更长时间的低温阶段）。

混合硬木的预处理

根据上面讨论的原因，为了增加Y_G和Y_H的值，使用两个温度阶段。该方法为先使用短暂的高温阶段（200°C-210°C进行0-24分钟，0分钟代表只进行加热阶段）然后是更长时间的低温阶段（160-170°C进行60分钟），对大硬木颗粒（<0.95厘米）进行预处理。结果见图9、10和11。

葡聚糖到葡萄糖的产率不断增加，而且一旦保持时间达到约16分钟就达到稳定水平（参见图9，第1部分，图10，第1部分和图11，第1部分）。最高的Y_G（83％）是在210℃保持16分钟，接着是160℃60分钟后得到。半纤维素糖产率（Y_H），随着保留时间变化更大，一般趋势表现为产率随着第一阶段保持时间的增加而降低（参见图9，第2部分，图10，第2部分，和图11，第2部分）。最高的Y_H分别在200℃4分钟后，200℃1分钟后和210℃的8分钟后获得，最高的Y_H在200℃4分钟和160℃60分钟获得为。这些结果表明，较低的第二阶段的160℃温度可得到最高的Y_G和Y_H值。与此相反，不考虑其他参数，高温预处理约8分钟后糠醛产率（Y_F）增加并趋于平稳至约20％（参见图9，第3部分，图10，第3部分，和图11，第3部分）。最后，整个研究中，5-HMF产率（Y₅）可以忽略，这意味着己糖降解非常低。

考虑到200℃0分钟和160℃或170℃60分钟的产率与在160℃和170℃60分钟的基本相等，加热混合物至200℃并没有很大影响（参见图7）。加热至210℃时有更为显着的影响（Y_G和Y_F增加超过一倍，以及Y_H显着增加）。210℃0分钟的产率，与200°C 2-4分钟的相当，（在这两种情况下后面均为160℃60分钟），这与在加热阶段花费在200±5℃时的时间相对应。因此，与150℃和195℃之间保持5-10分钟相比，在195℃以上花费的分钟数有更显著的影响。

对初始阶段优化之后，进行进一步的测试，以确定改变第二阶段温度和保持时间的影响。因此，选择了两个第一阶段的条件，即210℃1分钟,和210℃16分钟。选择更长的保持时间，这在之前被确定为最佳时间，以对不太苛刻或稍加改变的第二阶段的影响进行研究。选择更短的保持时间，对更为苛刻的第二阶段的影响进行研究。这些实验的结果见图12所示，左边所示为一组5个保持时间为16分钟的实验，右边为一组5个保持时间为1分钟的实验。在16分钟实验的情况下，图12中报告的所有三个产率，显示出与210℃保持16分钟和160保持60分钟时的最佳条件在统计学上无显著性差异。在1分钟的实验的情况下，大多数的第二阶段的变化并没有产生显著的改变。观察到的唯一例外是第二阶段190℃30分钟，在此条件下，观察到Y_G从约50％的产率增加至67％，Y_F的值从10％的产率增加到20％左右。

柳枝稷的预处理

考虑到木材的结果，柳稷枝的预处理优化范围被降低为第一阶段210℃，以及第二阶段160℃60分钟。结果见图13。与木材情况相反，柳枝稷的葡聚糖到葡萄糖产率在短的保持时间下为最大，并且当预处理时间延长超过6分钟时迅速减小（参见图13，第1部分）。观察到的最大Y_G为80％，这是在210℃1分钟和160℃60分钟的条件下获得，这在统计学上与在210℃6分钟时得到的77％的Y_G相等。加热阶段在210℃时对柳枝稷的影响比木材更显著，这是因为对210℃0分钟（参见图13）和160℃60分钟（参见图8）的结果进行比较时，Y_G增加超过50％，。

同样地，硬木的结果也相似，当高温阶段的保持时间改变时，半纤维素糖产率（Y_H）有双模式的响应（参见图13，第2部分）。在210℃0和4分钟，以及160℃60分钟后，分别得到42％和27％的产率。糠醛产率在210℃一分钟后迅速增加到15％左右的值（见图13，第3部分），并保持稳定，但保持12分钟后反而下降（表明糠醛可能有降解）。

类似于硬木，进行进一步的测试，以确定改变第二阶段温度和保持时间的影响。再一次地，选择了两个第一阶段的条件，即210℃进行0分钟，和210℃进行1分钟。这些实验的结果见图14所示，左边所示为一组5个保持时间为1分钟的实验，右边所示为一组5个保持时间为0分钟的实验。在1分钟的实验中，随着第二阶段的温度和保持时间的增加，Y_G增加而Y_H减小。这表明，给定第一阶段的短暂处理时间后，第二阶段的条件对产率有更为显著的影响。此外，因为显著比例的预处理反应发生在升温阶段，这一易发生变化的步骤可能会造成最终产率更大的变化。因此，当第二阶段为160℃60分钟时观察到Y_G超过80％，这与在较短时间、或较低温度下获得的50％左右的值结果截然不同。糠醛产率（Y_F）也观察类似的趋势，而半纤维素产率（Y_H）观察到相反的趋势。210℃、0分钟保持时间后紧接着是更苛刻的第二阶段条件时，观察到较小的变化。第二阶段的条件为160℃60分钟和180℃15分钟时，Y_G的所有值都接近于65％，并且Y_H的值达到40％以上，而其他Y_H值大约为25％。

结论

在使用非常相似的实验条件下（即160-170℃和60分钟的保持时间）、高固含量（40wt％）、不需要额外的化学品的情况,使用小（<1mm）颗粒在不搅拌的反应器中两相的CO₂-H₂O预处理，木材可以产生73％的葡萄糖产率，柳枝稷为81％，以及玉米秸秆为85％下。通过使用机械搅拌的1升搅拌反应器以增加的温度均匀性和传质速率,进一步改进可以增加半纤维素糖的产率和降低糠醛的形成。使用搅拌系统，对使用较大生物质颗粒的影响也进行了探讨。

随后，使用双温阶段的预处理方式，对相同的大颗粒进行预处理，结果混合硬木的葡聚糖到葡萄糖转化率为83％，柳枝稷为80％。这些产率与使用稀酸预处理木材得到的产率相类似，并且是主要技术预处理柳枝稷所得产率的10%以内，然而本申请方法没有使用化学催化剂、使用了较大的颗粒并显着较高的固形物含量（40wt％）。

虽然通过本发明的优选实施方式进行了展示和描述，然而在本发明的权利要求所限定的本发明的范围内，本领域的技术人员可作出各种变化和修改。

Claims (33)

1.一种生物质原料的预处理方法，所述方法包括使生物质原料经受在150℃至250℃温度范围和高压条件下的水和超临界CO₂的两相混合物，维持一段时间，所述时间为10秒至100分钟。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述高压为至少74bar。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述高压为150-225bar。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述高压为190-210bar。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度在155-200℃的范围内。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度在160-170℃的范围内。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述时间为约60分钟。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物质原料选自下组：硬木、软木、草、壳类材料、纸制品及其组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述草包含多年生牧草。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多年生牧草选自柳枝稷、大须芒草、芒草、苜蓿、果园草和虉草。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述壳类材料由玉米秸秆组成。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物质原料为生物质原料的混合物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述两相混合物的形成是通过首先将所述生物质原料和水混合得到浆体，所述浆体的水分含量为至少10%并且不超过85%，以及在密闭的反应器中向所述浆体提供液态或超临界二氧化碳。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述水分含量为不超过80%。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述水分含量为不超过60%。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述浆体的固体含量为至少20wt%。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述浆体的固体含量为至少40wt%。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述两相混合物的形成是通过将水和二氧化碳的混合物注入到含有所述生物质原料的反应器中，其中所述生物质在与所述二氧化碳和水的混合物接触前，其水分含量不超过10%。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述水分含量为不超过5%。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述两相混合物的形成是通过将水和二氧化碳的混合物注入到含有所述生物质原料的反应器中，其中所述生物质，在与所述二氧化碳和水的混合物接触前，其水分含量不超过60%。

21.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将预处理的生物质原料进行酶水解，由此产生单糖。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述酶水解可以得到至少50%的糖产率。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述预处理和所述酶水解以连续的方式在反应器中进行。

24.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括将所述单糖转化为乙醇、液态的烷烃类生物燃料或日用化学品。

25.根据权利要求21所述的方法，其中所述酶水解的糠醛产率不超过30%。

26.根据权利要求21所述的方法，其中所述酶水解的糠醛产率不超过25%。

27.根据权利要求21所述的方法，其中所述酶水解的糠醛产率不超过20%。

28.根据权利要求21所述的方法，其中所述酶水解的糠醛产率不超过15%。

29.根据权利要求21所述的方法，其中所述酶水解的糠醛产率不超过10%。

30.根据权利要求21所述的方法，其中所述酶水解的糠醛产率不超过5%。

31.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法为两阶段的温度方法，其中最初的短暂高温阶段在至少200℃温度下进行不超过20分钟，随后更长时间的低温阶段在至少140℃到不超过190℃温度下进行10-120分钟。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述最初的短暂高温阶段是在至少210℃的温度下进行不超过20分钟。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述更长时间的低温阶段是在至少140℃到至多180℃的温度下进行30-120分钟。

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