CN103096928A - 遗传性疾病的预防/改善剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂。本发明使用的预防/改善剂的特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物。

Description

遗传性疾病的预防/改善剂
技术领域
本发明涉及一种预防/改善剂，其特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物。
背景技术
肌营养不良是肌纤维的破坏/变性(肌坏死)与再生反复发生，从而使肌肉萎缩和肌肉无力随之发展的遗传性肌肉疾病的总称，其中，进行性肌营养不良是众所周知的。属于进行性肌营养不良之一的杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy：DMD)在肌营养不良中最为普遍，其因X染色体上的肌营养不良蛋白基因的突变而发病(参照非专利文献1)。由于幼年时期发病的进行性肌肉萎缩，DMD患者通常会在20岁左右因心力衰竭或呼吸器官衰竭而死亡。
肌营养不良蛋白质(以下也简单表示为“肌营养不良蛋白”。)存在于肌细胞的细胞膜的内侧，通过将由肌动蛋白-肌球蛋白引起的肌肉收缩所产生的机械性能量以良好的平衡传递至细胞膜、周围的结缔组织、腱等，并进行调节，以不施加过度的冲击，由此发挥保护肌细胞结构的作用。在DMD患者的情况下，由于其肌营养不良蛋白基因的突变，肌纤维中完全不存在或仅存在极少量肌营养不良蛋白，因此会因肌肉收缩而导致肌细胞的细胞膜破损，从而使比通常量更多的钙离子流入肌纤维中。过量的钙会使诱发钙蛋白酶、蛋白酶等的破坏肌肉或诱发细胞凋亡的酶活化，其结果导致成纤维细胞被活化而出现纤维化，组织形成瘢痕，肌细胞难以再生，肌肉萎缩逐渐发展。
另一方面，属于进行性肌营养不良之一的贝克氏型肌营养不良(Beckermuscular dystrophy：BMD)也是因肌营养不良蛋白基因的突变而发病的，其发病时间通常为成年，症状的发展也比DMD缓慢。虽然DMD和BMD均因肌营养不良蛋白基因的突变而发病，但其症状的程度、发展速度不同。DMD和BMD的这个差别可通过读码框规则来说明。对于肌营养不良蛋白mRNA而言，产生提前终止密码子(premature termination codon：PTC)的突变(无义突变)通常会引起重度的DMD表现型(杜氏)，而维持了肌营养不良蛋白mRNA原有读码框的突变(整码突变，in-frame mutation)则会成为症状更轻的BMD表现型(贝克氏型)(参照非专利文献2)。但是，令人意外的是，报告有：虽然若干轻症BMD患者的肌营养不良蛋白基因上具有无义突变，但通过使包含该无义突变的外显子跳跃，会产生新型的读码框内的肌营养不良蛋白mRNA(参照非专利文献3~6)。由于跳跃而缺失部分外显子的该肌营养不良蛋白mRNA编码所得的肌营养不良蛋白(截短型肌营养不良蛋白)比正常的肌营养不良蛋白短，但在某种程度上残存保持肌细胞结构的功能，因此肌营养不良的症状比较轻，另外，肌肉萎缩的发展速度也变慢。
从根本上治疗肌营养不良的方法尚未确立，以往，除了功能训练、用于预防关节挛缩的伸展之外，只不过针对心力衰竭/呼吸障碍进行对症治疗。但是，近年来，本发明人等、其它研究人等开发了针对DMD的新治疗方法，备受期待。该治疗方法是通过使用肌营养不良蛋白mRNA的反义寡核苷酸(AON)诱发外显子跳跃，实现从DMD表现型向BMD表现型的转换，从而使症状减轻的方法(非专利文献3)。为了在DMD患者的细胞中诱发外显子跳跃，对于任意剪接部位或剪接促进元件设计了几种不同的AON。这些AON可以修复肌营养不良蛋白mRNA的读码框。例如，通过外显子19的外显子剪接增强子(ESE)的AON，可观察到前述DMD患者细胞中产生外显子19的跳跃、生成截短型肌营养不良蛋白(参照非专利文献3~5)。另外，外显子51的AON也多用于患者细胞，现在，这些AON还处于临床研究阶段(参照非专利文献6~8)。
然而，AON存在必须定期进行肌肉注射或静脉注射、对患者而言比较麻烦的问题、或大量制备需要高额费用的问题。此外，对作为肌营养不良模型小鼠的mdx小鼠进行AON处理时，骨骼肌中的肌营养不良蛋白的表达在某种程度上得以恢复，但心脏中的肌营养不良蛋白的表达难以恢复(非专利文献9)。因此，临床上非常期待用于调节外显子跳跃的低分子。报告有作为低分子的非氨基糖苷类无义突变抑制基因化合物的PTC124(注册商标)(3-[5-(2-氟代苯基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸)能够治疗具有无义突变的部分DMD患者(非专利文献10、11)，现在，在美国等正在进行2b期的临床试验。PTC124是通过在核糖体翻译时连读(read-through)提前终止密码子(PTC)的方式进行诱发，从而在某种程度上恢复具有全长功能的肌营养不良蛋白的表达的治疗药，但对其它依赖基因无义突变的mRNA分解机理的影响尚未明确。
然而，本发明人等确认TG003(后述通式(1)中，R1和R2为甲基、R3为甲氧基的化合物)可作为Cdc-like激酶(Clk)特异性激酶抑制剂。TG003是在体外和体内两种情况下均对剪接产生影响的化合物(参照非专利文献12和13)，本发明人等在相关专利申请(参照专利文献1)中记载了：TG003具有介由SR蛋白质的磷酸化反应来调节替代剪接的作用、可利用所述作用来进行癌症等疾病的预防、治疗。但是，迄今为止，TG003可促进肌营养不良蛋白基因的外显子的跳跃尚属未知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第20050171026号说明书
非专利文献
非专利文献1：Cell(1988)53,219-228.
非专利文献2：Genomics(1988)2,90-95.
非专利文献3：Pediatr Res(2006)59,690-694.
非专利文献4：Biochem Biophys Res Commun(1996)226,445-449.
非专利文献5：J Clin Invest(1995)95,515-520.
非专利文献6：Lancet neurology(2009)8,873-875.
非专利文献7：The New England journal of medicine(2007)357,2677-2686.
非专利文献8：Lancet neurology(2009)8,918-928.
非专利文献9：Nature medicine(2006)12,175-177.
非专利文献10：J Clin Pharmacol(2007)47,430-444.
非专利文献11：Nature(2007)447,87-91.
非专利文献12：The Journal of biological chemistry(2004)279,24246-24252.
非专利文献13：Genes Cells(2008)13,233-244.
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种预防/改善剂，其特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物。
本发明人等在针对400名以上的肌营养不良患者分析其肌营养不良蛋白基因的突变时，发现了外显子31中具有根据背景技术中记载的读码框规则预测会成为重度DMD表现型的无义突变，但其症状却是BMD型的患者。对所述患者的肌营养不良蛋白基因的mRNA进行分析时，明确了：外显子31的该无义突变会诱发外显子31的跳跃，由此部分生成用于编码功能性截短型肌营养不良蛋白的成熟mRNA。因此，本发明人等探求促进外显子跳跃的低分子化合物，发现了：作为Clk特异性抑制剂的TG003依赖于用量地促进内在性肌营养不良蛋白基因的外显子31、外显子27的跳跃，能够增强患者的细胞中的功能性截短型肌营养不良蛋白的产生，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下预防/改善剂：(1)一种预防/改善剂，其特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物；(2)上述(1)所述的预防/改善剂，其特征在于，前述化合物为具有剪接调节作用的化合物；(3)上述(1)或(2)所述的预防/改善剂，其特征在于，前述化合物为具有诱发/促进包含突变的外显子的跳跃的效果的化合物；(4)上述(1)至(3)中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，前述化合物为Cdc-like激酶抑制化合物；(5)上述(4)所述的预防/改善剂，其特征在于，前述Cdc-like激酶抑制化合物为通式(1)所示的化合物，
[化学式1]
Figure BDA00002615926800041
[式中，R1和R2各自独立地表示直链状、支链状的C1-C10烃基；R3表示甲氧基、乙氧基、乙酰氧基或卤原子。]；
(6)上述(1)至(5)中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，前述突变为无义突变；(7)上述(6)所述的预防/改善剂，其特征在于，前述无义突变为抑制前述基因的外显子剪接增强子活性、和/或、使前述基因的外显子剪接沉默子活性提升的无义突变；(8)上述(1)至(7)中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，前述基因为肌营养不良蛋白基因，前述功能性截短型蛋白质为功能性截短型肌营养不良蛋白质，前述遗传性疾病为杜氏肌营养不良；(9)上述(8)所述的预防/改善剂，其特征在于，前述肌营养不良蛋白基因的外显子为肌营养不良蛋白基因的外显子31或外显子27；(10)上述(9)所述的预防/改善剂，其特征在于，前述肌营养不良蛋白基因的外显子31的突变为序列号1的多聚核苷酸序列的核苷酸编号4303中的鸟嘌呤向胸腺嘧啶的无义突变，外显子27的突变为序列号1的多聚核苷酸序列的核苷酸编号3613中的鸟嘌呤缺失的移码突变（アウトオブフレーム変異，out-of-frame mutation）。
根据本发明，通过诱发/促进包含成为遗传性疾病主要原因的突变的基因的外显子跳跃，从而诱发/提升功能性截短型蛋白质的表达，其结果可以预防/改善该遗传性疾病。另外，本发明中使用的分子量1500以下的化合物为低分子，组织转变性等优异，即使对于作为高分子的现有AON无法获得充分效果的心脏等脏器，也可期待充分的预防/改善效果。此外，由于本发明的对象突变不限定于无义突变，因此还可以期待其应用于作为遗传性疾病的主要原因的多种突变。
附图说明
图1为通过患者的肌营养不良蛋白基因的外显子31中的点突变而产生外显子跳跃，从而修复截短型肌营养不良蛋白基因的开放阅读框(ORF)的情况的示意图。(a)表示从患者编号KUCG797的肌营养不良蛋白基因中显现的点突变。用棒(bar)来表示外显子31的c.4303G＞T(p.Glu1435X)突变的位置。表示相邻的内含子区域的DNA序列以及因突变而改变的密码子。(b)组（panel）e~g表示用免疫组织化学法调查前述患者的肌营养不良蛋白表达的结果，组b~d表示用免疫组织化学法调查健康人的肌营养不良蛋白表达的结果。组e和b表示用DYS2染色的结果，组f和c表示用DYS3染色的结果，组g和d表示用MANDYS1染色的结果。比例尺=60μM。(c)表示对从对照和患者肌肉中得到的RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶分析的结果。左泳道(M)表示使用了用
Figure BDA00002615926800051
消化的DNA大小标记的结果，中间泳道(对照，Control)表示以来源于健康人的总RNA为模板的结果，右泳道(患者，Patient)表示以来源于KUCG797的总RNA为模板的结果。对这些带的DNA序列进行分析，将这些PCR产物的结构与其核苷酸长共同简要地示于组右侧。带编号的格子表示肌营养不良蛋白的外显子编号。组左侧中，将DNA大小标记的长度以核苷酸长的形式表示。(d)表示对前述的(c)中的小尺寸的扩增产物进行序列分析的结果。(e)表示包含肌营养不良蛋白基因的野生型(WT)或突变型(c.4303G＞T)中任一外显子31的杂合小基因质粒(hybrid minigene plasmid)的概略图。组右侧的格子和线分别表示外显子和内含子。(f)表示将从H492-dys Ex31m/Hela中回收的突变型mRNA、从H492-dys Ex31w/Hela中回收的野生型mRNA的RT-PCR产物等在琼脂糖凝胶上进行电泳的结果。最左侧的泳道(M)表示使用了用
Figure BDA00002615926800061
消化的DNA大小标记的结果，左侧第二个泳道(w)表示以来源于H492-dys Ex31w/Hela的总RNA为模板的结果，左侧第三个泳道(m)表示以来源于H492-dys Ex31m/Hela的总RNA为模板的结果。将这些PCR产物的结构简要地示于组右侧。另外，将DNA大小标记和PCR产物的核苷酸长分别示于组的左侧和右侧。另外，右侧第2个和第3个泳道表示将除了未添加逆转录酶(RT)之外同样地进行了RT-PCR处理的产物在琼脂糖凝胶上进行电泳的结果，右侧第2个泳道(w)表示以来源于H492-dysEx31w/Hela的总RNA为模板的结果，最右侧的泳道(m)表示以来源于H492-dys Ex31m/Hela的总RNA为模板的结果。
图2为预测与用于调节剪接的RNA结合蛋白质相对应的外显子31的结合序列的图。(a)表示通过SpliceAid程序预测能够结合于肌营养不良蛋白基因的野生型外显子31(左组)或c.4303G＞T的外显子31(右组)的RNA结合候选蛋白质的结果。对易于定义为外显子的ESE(外显子剪接增强子)模体等的序列赋予正分。按照相同基准，对易于定义为内含子的目标序列、即ESS(外显子剪接沉默子)模体赋予负分。在左右两侧的组中，对c.4303G＞T中发生突变的核苷酸进行强调表示。由是否存在所述突变而导致得分大幅变动的两种蛋白质(SRp30c/SRSF9和hnRNPA1)用白底格子表示。在与SRp30c/SRSF9(左组)或hnRNPA1(右组)的SELEX共有序列显示高相同性的周围序列下标附下划线。(b)表示SRp30c/SRSF9或hnRNPA1的SELEX共有序列与外显子31序列的排列。左组表示野生型外显子31RNA与SRp30c/SRSF9SELEX共有序列的相同性。R表示嘌呤残基。右组表示c.4303G＞T突变型外显子31与hnRNPA1SELEX共有序列的RNA序列相同性。W表示A或U。两组中的垂直棒连结有相同的残基。两组中，对c.4303G＞T中突变的核苷酸用白底格子进行强调。
图3为由于从患者基因中发现的肌营养不良蛋白外显子31的点突变，在体外和体内两种情况下与hnRNPA1的结合性增大、外显子跳跃增大的情况的示意图。(a)表示对GST-hnRNPA1和肌营养不良蛋白外显子31RNA进行迁移率变动分析的结果的图。泳道3~5表示分别使用100、200和400ng的GST-hnRNPA1、且使用肌营养不良蛋白的野生型外显子31RNA的结果，泳道8~10表示分别使用100、200和400ng的GST-hnRNPA1、且使用肌营养不良蛋白的突变型外显子31RNA的结果，泳道2和7表示仅使用GST的结果。泳道1和6表示RNA自身会在凝胶上移动到何处(组右侧表示为“游离RNA”（“Free RNA”）)。hnRNPA1和RNA的复合物表示为“结合RNA”（“Bound RNA”）。(b)表示包含肌营养不良蛋白外显子31的mRNA前体在体外进行剪接分析的结果。泳道1~5表示以将pCDC-dys Ex31w制成线状而得的产物作为体外转录的模板、且培养时间分别设为0、15、30、60、90分钟的结果，泳道6~10表示以将pCDC-dys Ex31m制成线状而得的产物作为体外转录的模板、且培养时间分别设为0、15、30、60、90分钟的结果。另外，将mRNA前体和两个不同的mRNA的结构示于组右侧。带编号的格子表示外显子、格子间的线表示内含子。外显子14和15为来源于CDCmRNA前体的鸡δ-晶状体球蛋白外显子。与通过CDC-dys Ex31c.4303G＞T mRNA前体来产生相比，通过CDC-dys Ex31 WT mRNA前体可更有效地产生包含肌营养不良蛋白外显子31的mRNA(黑点)。(c)表示为了调查若干RNA结合蛋白质的过度表达会对突变型外显子31的跳跃和内含物造成何种影响，而利用小基因进行的、细胞的剪接分析的结果。最左侧的泳道(M)表示用
Figure BDA00002615926800071
消化的DNA大小标记，左侧第2个泳道(模拟试验，mock)表示以来源于H492-dys Ex31m/Hela的总RNA为模板的结果，左边第3个泳道(SRp30c/SRSF9)表示以来源于H492-dysEx31m·Flag-SRp30c/Hela的总RNA为模板的结果，右侧第2个泳道(SRp75/SRSF4)表示以来源于H492-dys Ex31m·Flag-SRp75/Hela的总RNA为模板的结果，最右侧的泳道(hnRNPA)表示以来源于H492-dysEx31m·Flag-hnRNPA1质粒/Hela的总RNA为模板的结果。其中，将DNA大小标记和PCR产物的核苷酸长分别示于组的左侧和右侧。(d)表示由图3的(c)的结果算出的外显子跳跃/内含物比。图表表示分别进行的3次试验的比的平均值和标准偏差。＊P＜0.005
图4为TG003在Hela细胞中依赖于用量地促进突变型外显子31跳跃的情况的示意图。(a)表示为了调查各种化合物对外显子31跳跃产生何种影响，而利用H492-dys Ex31m/Hela进行的、细胞的剪接分析的结果。最左侧的泳道(M)表示用
Figure BDA00002615926800081
消化的DNA大小标记，左侧第2个泳道(DMSO)表示用DMSO处理H492-dys Ex31m/Hela时的结果，左边第3个泳道(TG003)表示用TG003处理H492-dys Ex31m/Hela时的结果，最右侧的泳道(SRPIN340)表示用SRPIN340处理H492-dys Ex31m/Hela时的结果。其中，将DNA大小标记和PCR产物的核苷酸长分别示于组的左侧和右侧。(b)表示由图4的(a)的结果算出的外显子跳跃/内含物比。图表表示分别进行的3次试验的比的平均值和标准偏差。＊P＜0.0001(c)表示为了调查促进突变型外显子31的跳跃的TG003是否会促进野生型外显子31的跳跃，而在H492-dys Ex31m/Hela的基础上利用H492-dys Ex31w/Hela进行的细胞的剪接分析的结果。左侧第1~6个泳道表示用具有组上部的浓度(μM)的TG003处理H492-dys Ex31w/Hela时的结果，右侧第1~6个泳道表示用具有组上部的浓度(μM)的TG003处理H492-dys Ex31m/Hela时的结果，中间泳道(M)表示用
Figure BDA00002615926800082
消化的DNA大小标记。(d)表示由图4的(c)的结果算出的外显子跳跃/内含物比。图表表示分别进行的3次试验的该比的平均值和标准偏差。
图5为TG003在Hela细胞中依赖于用量地促进突变型外显子27跳跃的情况的示意图。(a)表示利用H492-dys Ex27m/Hela和H492-dysEx27w/Hela进行的、细胞的剪接分析的结果。左侧第1~6个泳道表示用具有组上部的浓度(μM)的TG003处理H492-dys Ex27w/Hela时的结果，右侧第1~6个泳道表示用具有组上部的浓度(μM)的TG003处理H492-dysEx27m/Hela时的结果，中间泳道(M)表示用
Figure BDA00002615926800083
消化的DNA大小标记。(b)表示由图5的(a)的结果算出的外显子跳跃/内含物比。图表表示分别进行的3次试验的该比的平均值和标准偏差。
图6为TG003不仅促进突变型外显子31的跳跃、还会促进患者细胞中的截短型肌营养不良蛋白(缺失外显子31的肌营养不良蛋白)的表达的示意图。(a)表示利用用各种量的TG003处理的患者肌肉初代培养细胞进行的、细胞的剪接分析的结果。左侧第1个泳道(M)表示用消化的DNA大小标记，左侧第2~7个泳道分别表示用具有组上部记载数值的浓度(μM)的TG003处理初代培养细胞时的结果。其中，将DNA大小标记示于组的左侧，将PCR产物的核苷酸长和结构的概略示于组的右侧。组右侧的编号格子示出肌营养不良蛋白的外显子编号。(b)表示由图6的(a)的结果算出的外显子跳跃/内含物比。图表表示分别进行的2次试验的该比的平均值和标准偏差。(c)表示针对用TG003处理的患者细胞中的肌营养不良蛋白的表达而进行的蛋白印迹分析的结果。上侧组(Dystrophin(C－端，C-terminal))表示对肌营养不良蛋白的C末端使用了抗体的结果，中间组(Dystrophin(外显子31/32，Exon 31/32))表示对与肌营养不良蛋白的外显子31相应的部分使用了抗体的结果，下侧组(结蛋白，Desmin)表示使用了抗结蛋白抗体的结果。另外，左侧泳道(对照，Control)表示阳性对照的结果，正中间的泳道(0)表示使用了未经TG003处理的患者细胞的结果，右侧泳道(7)表示使用了经TG003处理的患者细胞的结果。其中，下侧组的结果示出该蛋白印迹分析中基本使用了相同数量的细胞。
图7为人肌营养不良蛋白的79个外显子配置的示意图。另外，还可以通过该图读取出外显子彼此的交界线对应于密码子的第几个文字。
具体实施方式
1.本发明的预防/改善剂
本发明的预防/改善剂只要是起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子(以下也简称为“突变型外显子”。)跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病(以下也表示为“本发明的对象遗传性疾病”。)的预防/改善剂，并且含有分子量1500以下的化合物(以下，也表示为“本发明的化合物”。)，则没有特别限定，优选为分子量1000以下的化合物，更优选为分子量700以下的化合物，进一步优选分子量500以下的化合物，更进一步优选为分子量300以下的化合物。另外，本发明的预防/改善剂中可以组合使用两种以上本发明的化合物。
作为本发明的化合物，只要是对本发明的对象遗传性疾病发挥预防效果和/或改善效果(以下，也表示为“本发明的预防/改善效果”。)的化合物，则没有特别限定，可优选例示出具有剪接调节作用的化合物，可更优选例示出具有诱发和/或促进突变型外显子跳跃的效果(以下，也表示为“本发明的诱发/促进跳跃的效果”。)的化合物，可进一步优选例示出具有诱发和/或促进突变型外显子跳跃、诱发和/或提升功能性截短型蛋白质的表达的效果(以下，也表示为“本发明的诱发/提升功能性截短型蛋白质的表达的效果”。)的化合物，可更进一步优选例示出Clk抑制化合物。所述Clk抑制化合物之中，可优选例示出上述通式(1)所示的化合物，[式中，R1和R2各自独立地表示直链状、支链状的C1-C10烃基；R3表示甲氧基、乙氧基、乙酰氧基或卤原子。]，其中，可特别优选例示出TG003(上述通式(1)中，R1和R2为甲基、R3为甲氧基的化合物)。上述通式(1)所示的化合物可以通过前述专利文献1所述的方法等合成。
对本发明的对象遗传性疾病的预防效果(以下，也表示为“本发明的预防效果”。)包括抑制该遗传性疾病的发病的效果、延迟发病的效果，对本发明的对象遗传性疾病的改善效果(以下，也表示为“本发明的改善效果”。)是指，除了包括改善该遗传性疾病的症状之外，还包括与不给药本发明的预防/改善剂的情况相比延迟症状恶化速度的效果。
某种化合物是否具有本发明的预防/改善效果可通过具有如下工序的方法进行确认：例如，工序A：对本发明的对象遗传性疾病的模型哺乳动物(即，具有成为本发明的对象遗传性疾病的主要原因的突变的模型哺乳动物(优选为模型非人哺乳动物))给药该被检测化合物；工序B：确认该模型哺乳动物的前述遗传性疾病的症状；工序C：将前述工序B的遗传性疾病的症状程度与未给药被检测化合物时的症状程度进行对比；工序D：前述工序B的遗传性疾病的症状程度比未给药被检测化合物时的症状程度低的情况下，将该被检测化合物评价为具有本发明的预防/改善效果的化合物。
另外，某种化合物是否具有本发明的诱发/促进跳跃的效果可通过具有如下工序的、具有本发明的诱发/促进跳跃的效果的化合物的判定方法进行确认：例如，将包含突变型外显子和与该外显子邻接的区域(外显子区域或内含子区域)的DNA断片(小基因)组入适当的哺乳动物细胞用表达载体中，制作重组载体的工序；将所述重组载体转染至哺乳动物细胞中的工序；在使通过转染得到的转化细胞(以下，也表示为“本发明的转化细胞”。)与被检测化合物接触的状态下，培养该转化细胞的工序；从已培养的转化细胞中分离RNA、通过RT-PCR对与小基因对应的RNA进行扩增的工序；通过分析扩增产物(例如电泳、序列分析)来确认是否诱发和/或促进突变型外显子的跳跃的工序；在已经诱发和/或促进突变型外显子的跳跃的情况下，将该被检测化合物评价为具有本发明的诱发/促进跳跃的效果的化合物的工序。
此外，某种化合物是否具有诱发/提升截短型蛋白质的表达的效果可通过包含如下工序的、具有诱发/提升截短型蛋白质的表达的效果的化合物的判定方法进行确认：在使本发明的转化细胞与被检测化合物接触的状态下，培养该转化细胞的工序；通过对已培养的转化细胞中表达的蛋白质进行分析，来确认是否诱发和/或提升截短型蛋白质的表达的工序；在诱发和/或提升截短型蛋白质的表达的情况下，将该被检测化合物评价为具有诱发/提升截短型蛋白质的表达的效果的化合物的工序。截短型蛋白质的检测可以通过确认如下等进行：在使用了突变型外显子编码的肽的抗体、除此以外的外显子编码的肽的抗体的蛋白印迹分析中，未检测到突变型外显子编码的肽的信号，且检测到除此以外的外显子编码的肽的信号。另外，该截短型蛋白质是否为功能性截短型蛋白质可以以在本发明的对象遗传性疾病的模型哺乳动物中使该截短型蛋白质表达时，该遗传性疾病的症状得到改善等为指标来进行确认。其中，本发明“功能性截短型蛋白质”是指，由成为遗传性疾病的主要原因的基因的外显子至少缺失1个的成熟mRNA编码的截短型蛋白质，且意味着与该基因对应的正常基因的全长蛋白质的功能(尤其是遗传性疾病的相关功能)至少在某种程度上残存的蛋白质。
另外，某种化合物是否为Clk抑制化合物可以通过具有如下工序的方法容易地确认：在被检测化合物的存在下，测定Clk的磷酸化活性的工序；将由测定结果所得的磷酸化活性值与不存在被检测化合物时的Clk的磷酸化活性值相比较的工序；存在被检测化合物时的Clk的磷酸化活性值比不存在被检测化合物时的Clk的磷酸化活性值低时，将该被检测化合物评价为Clk抑制化合物的工序。上述Clk可以通过根据公知的Clk序列信息从期望哺乳动物中分离Clk基因，并将该基因整合到适当的表达载体中使其表达后，分离该Clk来容易地获取。Clk的磷酸化活性可以使用将作为Clk基质的SR蛋白质进行磷酸化而得的磷酸化SR蛋白质上特异性地结合的抗体等进行测定。另外，作为成为Clk基因来源的前述哺乳动物，没有特别限定，可优选例示出人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、牛、猪、马、兔、绵羊、山羊、猫、狗等，其中，可更优选例示出人。
作为本发明的对象遗传性疾病的“突变”的种类，只要可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质则没有特别限定，除了无义突变、剪接异常之外，还可例示出与正常的野生型基因相比氨基酸的读码框偏离(移码，out of frame)的突变等，其中，可优选例示出无义突变、移码突变，其中，可更优选例示抑制成为该遗传性疾病的主要原因的基因的外显子剪接增强子活性、和/或、提升该基因的外显子剪接沉默子活性的无义突变、移码突变，其中，可特别优选例示出诱发/促进包含该无义突变、移码突变的外显子跳跃之类的无义突变、移码突变。其中，作为前述移码突变，可例示出基因缺失、重复或逆位，且与正常的野生型基因相比氨基酸的读码框偏离的突变。
本发明中，成为跳跃对象的“包含该突变的外显子”不仅限于包含所述突变的1个外显子，可以是包括该外显子在内的相邻的多个(优选为2~8个、更优选为2~5个、进一步优选为2~3个、更优选为2个)外显子，所述外显子的优选个数、范围的指标如下：以使所述外显子跳跃时剩余的外显子在读码框内的方式进行连结、由剩余外显子构成的成熟mRNA所编码的截短型蛋白质为功能性截短型蛋白质，本领域技术人员可以进行适当选择。例如，基因为肌营养不良蛋白基因时，可以基于公知的外显子信息(图7)来决定使其跳跃的外显子的个数、范围。该图7中，如果两个外显子的交界线为垂直的直线(例如参照外显子3和外显子4之间的直线)，则外显子的交界线与密码子的交界线一致；如果两个外显子的交界线为坡度较小的斜线(例如参照外显子1和外显子2之间的斜线)，则外显子的交界线处于密码子的第1个文字与第2个文字之间；如果两个外显子的交界线为坡度较大的斜线(例如参照外显子6与外显子7之间的斜线)，则外显子的交界线处于密码子的第2个文字与第3个文字之间。因此，例如移码突变存在于外显子51中时，如果使外显子51与52跳跃或者使外显子50与51跳跃，则剩余的外显子会在读码框内，另外，在移码突变存在于外显子53中时，使外显子53~58跳跃或使外显子52与53跳跃，则剩余的外显子会在读码框内。
本发明中的“外显子的跳跃”或“使外显子跳跃”是指，由基因转录生成的mRNA(mRNA前体)加工成熟mRNA时，该外显子从mRNA前体中消失或使该外显子消失。
作为本发明的对象遗传性疾病的种类，只要是起因于基因的外显子突变的遗传性疾病、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病则没有特别限定，其中，可优选例示出起因于基因的外显子突变、且包含该突变的外显子跳跃而部分生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病，更具体而言，在前述遗传性疾病中，可更优选例示出基因为肌营养不良蛋白基因、前述功能性截短型蛋白质为功能性截短型肌营养不良蛋白的杜氏肌营养不良，其中，在前述杜氏肌营养不良中，可优选例示出肌营养不良蛋白基因的外显子为肌营养不良蛋白基因的外显子31、外显子27的杜氏肌营养不良，其中，在前述杜氏肌营养不良中，可特别优选例示出肌营养不良蛋白基因的外显子31的突变为序列号1的多聚核苷酸序列(肌营养不良蛋白cDNA序列)的核苷酸编号4303中的鸟嘌呤向胸腺嘧啶的无义突变的杜氏肌营养不良、肌营养不良蛋白基因的外显子27的突变为序列号1的多聚核苷酸序列的核苷酸编号3613中的鸟嘌呤缺失的移码突变的杜氏肌营养不良。
作为成为本发明的预防/改善剂的给药对象的哺乳动物，没有特别限定，可优选例示出人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、牛、猪、马、兔、绵羊、山羊、猫、狗等，其中，可更优选例示出人。另外，在本发明的预防/改善剂中使用Clk抑制化合物的情况下，所述Clk抑制化合物发挥抑制作用的Clk的来源与成为本发明的预防/改善剂的给药对象的哺乳动物的种类一致时，可更好地享受本发明的预防效果、改善效果，因而优选。
作为本发明的化合物所具有的、本发明的诱发/促进跳跃的效果的优选程度，可优选例示出通过下述工序算出的外显子跳跃/内含物比与未使用本发明的化合物时的外显子跳跃/内含物比相比，上升2倍以上、优选为3倍以上、更优选为4倍以上、进一步优选为5倍以上，其中，所述工序包括：在使前述本发明中的转化细胞与本发明的化合物(30μM)接触的状态下，培养该转化细胞的工序；从已培养的转化细胞中分离RNA，通过RT-PCR对与小基因对应的RNA进行扩增的工序；通过分析扩增产物(例如电泳、序列分析)来算出突变型外显子发生跳跃的扩增产物相对于突变型外显子未发生跳跃的扩增产物的比率的工序。另外，未使用本发明的化合物时的外显子跳跃/内含物比为0时，由外显子跳跃/内含物比大于0的正值诱发的效果可作为本发明的诱发/促进跳跃的效果的特别优选程度而例示出。
本发明的预防/改善剂只要能够获得本发明的预防/改善效果，则除了前述本发明的化合物之外，还可以包含其它遗传性疾病预防/改善剂等任意成分。
本发明的预防/改善剂中含有的本发明的化合物可以通过通常方法制成适当的制剂。作为制剂的剂型，可以为散剂、颗粒剂等固体制剂，从可以获得更优异的本发明的预防/改善效果的观点出发，优选制成溶液剂、乳剂、悬浊剂等液体制剂。作为前述液体制剂的制造方法，例如可优选例示出将本发明的化合物与溶剂混合的方法；进一步混合悬浊化剂、乳化剂的方法。如上那样，将本发明的化合物制成制剂时，可根据制剂需要，配混适当的药学上允许的载体（担体），例如，赋形剂、结合剂、溶剂、溶解辅助剂、悬浊化剂、乳化剂、等渗剂、缓冲剂、稳定剂、安抚剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、润滑剂、崩解剂、湿润剂、吸附剂、甜味剂、稀释剂等任意成分。
作为本发明的预防/改善剂中含有的本发明的化合物的量，只要能够获得本发明的预防/改善效果，则没有特别限定，例如可优选例示出：相对于本发明的预防/改善剂的总量，例如为0.0001~99.9999质量%、优选为0.001~80质量%、更优选为0.001~50质量%、进一步优选为0.005~20质量%。
作为本发明的预防/改善剂的给药方法，只要能够获得本发明的预防/改善效果，则没有特别限定，可例示出静脉内给药、经口给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、经鼻给药、经肺给药等。另外，本发明的预防/改善剂的给药量可以根据给药对象的遗传性疾病的状态、给药对象的体重等进行适当调节，可优选例示出：按本发明的化合物换算，成人每人每日例如0.1μg~10000mg、更优选为1μg~3000mg、进一步优选为10μg~1000mg。
其中，含有本发明的化合物的本发明的预防/改善剂还可以用作诱发/促进外显子跳跃的外显子跳跃诱发/促进剂，其中，所述外显子为包含成为遗传性疾病的主要原因的突变的基因的外显子。另外，作为本发明的其它实施方法，还可例示出本发明的化合物在本发明的预防/改善剂的制造中的用途；将本发明的化合物用于本发明的预防/改善剂的方法；本发明的化合物在使包含成为遗传性疾病的主要原因的突变的基因的外显子跳跃从而诱发/提升功能性截短型蛋白质的表达中的用途；本发明的化合物在预防/改善本发明的对象遗传性疾病中的用途；通过向对象给药本发明的预防/改善剂，从而预防/改善本发明的对象遗传性疾病的方法；通过向对象给药本发明的外显子跳跃诱发/促进剂，从而诱发/促进包含成为遗传性疾病的主要原因的突变的基因的外显子跳跃的方法。这些用途、方法中的文字内容、其优选实施方式如前所述。
以下，通过实施例来详细说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
实施例1
[肌营养不良患者的肌营养不良蛋白基因的突变分析]
针对400名以上肌营养不良患者，通过以下方法分析其肌营养不良蛋白基因的突变。
(突变分析)
通过标准的苯酚-氯仿提取法，从患者的血液试样中分离DNA。使用Ficoll-Paque密度梯度法(Amersham Biosciences AB公司制造)从回收自全血的末梢淋巴细胞中分离总RNA、或者从将冻结肌肉试样制成薄片后的肌肉切片中分离总RNA。通过逆转录PCR(RT-PCR)和RT-nested PCR法，分析骨骼肌中表达的肌营养不良蛋白mRNA。关于来源于骨骼肌的肌营养不良蛋白mRNA，使用内侧引物对(正向c27f：CCTGTAGCACAAGAGGCCTTA(序列号2)以及反向2F：TCCACACTCTTTGTTTCCAATG(序列号3))，对包含外显子27~32的区域进行扩增。提纯扩增产物，直接或亚克隆至pT7Blue-T载体(Novagen公司制造)后，确定扩增产物的序列。该序列的确定使用了自动DNA序列分析装置(型号310；Applied Biosystems公司制造)。
经分析，肌营养不良患者中的一人(KUCG797)的症例如下所示。该患者为5岁男孩。该男孩的双亲为健康的日本人，无家族肌肉疾病史。1岁4个月开始独立行走，运动发展正常，但在2岁时进行的定期血液检查中，血清肌酸激酶(CK)值显示为2567IU/l(正常值为不足169IU/l)，住院。在神户大学病院接受检查，针对肌营养不良蛋白基因的突变进行调查。CK值在之后持续缓慢上升(1331~4740IU/l)，但未观察到肌肉无力、行走异常。5岁时进行了肌肉活检。以上研究在得到神户大学伦理委员会的批准后实施。
在前述KUCG797的肌营养不良蛋白基因中，观察到外显子31的点突变。该突变中，肌营养不良蛋白cDNA的4303号核苷酸的G被替换成T(RNA中由G替换为U)(c.4303G＞T：图1a)。该核苷酸的变更中，编码谷氨酸的GAG密码子被替换成编码终止密码子的TAG(p.Glu1435X)，因此根据背景技术中记载的读码框规则，可预测到该症例未产生肌营养不良蛋白，不会成为重度的DMD。
(骨骼肌活检和肌营养不良蛋白免疫染色)
接着，用以下方法对前述患者(5岁)进行骨骼肌活检，进行了肌营养不良蛋白免疫染色。
关于KUCG797，进行股直肌的活检，得到骨骼肌试样。将该骨骼肌试样用经液态氮冷却的异戊烷急速冻结。由冻结的骨骼肌试样制作厚度10μm的冻结连续切片，通过免疫组织化学染色对所述切片进行分析。具体而言，将前述厚度10μm的冻结连续切片放入冷却丙酮中5分钟，进行固定。将该切片用山羊正常血清封闭，在抗肌营养不良蛋白抗体(一次抗体)的共存下，于4℃培养一晚。作为抗肌营养不良蛋白抗体，使用了DYS2(Novocastra公司制造)、DYS3(Novocastra公司制造)以及MANDYS1(由Glenn E.Morris教授/博士赠送)这3种。DYS2识别肌营养不良蛋白基因的外显子77~79(C末端侧)的抗原决定部位，DYS3识别肌营养不良蛋白基因的外显子10~12(N末端侧)的抗原决定部位，MANDYS1识别肌营养不良蛋白基因的外显子31/32(杆域)的抗原决定部位。培养后的切片用PBS洗涤6次后，在作为二次抗体的用Alexa Fluor 488标记了的山羊抗小鼠抗体或山羊抗兔抗体的共存下，以室温培养90分钟。洗涤切片后，用荧光显微镜观察切片。将该结果示于图1b。图1b的组e表示用DYS2染色的结果，图1b的组f表示用DYS3染色的结果，图1b的组g表示用MANDYS1染色的结果。
根据KUCG797的肌营养不良蛋白基因的基因型预测其为重度的DMD，但免疫组织化学染色的结果与该预测相反，与BMD的情况相同，可观察到相对于识别N末端或C末端的肌营养不良蛋白域的抗体的、稀疏且不连续的信号(图1b的组e、组f)。另外，未观察到相对于识别肌营养不良蛋白基因的外显子31/32的MANDYS1抗体的信号(图1b的组g)。其中，作为阳性对照，对来源于健康人的骨骼肌试样进行了同样的免疫组织科学染色时，相对于DYS2、DYS3、MANDYS1中任一抗体均确认了信号(图1b的组b、组c、组d)。
(RT-PCR扩增产物的分析)
为了说明KUCG797的肌营养不良蛋白基因的基因型(DMD型)与免疫染色模型之间的这一矛盾，本发明人等推测为肌营养不良蛋白基因的外显子31的无义突变破坏了外显子剪接增强子(ESE)，引起了突变型外显子(包含突变的外显子)的跳跃。为了证明该推定的可能性，用RT-PCR扩增法对KUCG797的骨骼肌的肌营养不良蛋白mRNA进行了分析。
具体而言，以从KUCG797中分离的总RNA为模板，使用前述正向c27f和反向2F作为引物，对外显子27至外显子32为止的区域进行扩增。将该扩增产物在Tris-硼酸盐/EDTA缓冲液中、2%琼脂糖凝胶上进行电泳的结果示于图1c。最右侧的泳道(患者)表示以来源于KUCG797的总RNA为模板的结果，中间泳道(对照)表示以来源于健康人的总RNA为模板的结果。对照中，外显子27至外显子32为止的区域的扩增产物为一种，但KUCG797令人惊讶地得到两种几乎等量的扩增产物。这两种中的一种扩增产物是预测到的尺寸，而另一种的扩增产物为更小的尺寸(图1c)。对该小尺寸的扩增产物进行序列分析时，确认外显子31发生跳跃(图1d)。另一方面，对预测到的尺寸的扩增产物进行序列分析时，显示出包括外显子31的TAG终止密码子在内的、外显子27~32的序列(793nt)。另一方面，显示出小尺寸的扩增产物呈外显子31的序列完全缺失、而其它外显子为完整残存的序列(682nt)，突变型外显子31发生了跳跃(图1c)。针对KUCG797的肌营养不良蛋白基因的其它内含子的剪接也进行了调查，其它内含子被完全正确地剪接(未示出数据)。缺失外显子31(111nt)的肌营养不良蛋白mRNA(682nt)为读码框内，虽然为截短型，但产生残存功能的肌营养不良蛋白(截短型肌营养不良蛋白)。前述的免疫染色中，由于使用了识别N末端或C末端的肌营养不良蛋白域的抗体，因此前述截短型肌营养不良蛋白也应该被染色。因此，使用作为单克隆抗体的MANDYS1对包含外显子31的区域进行免疫染色时，所述截短型肌营养不良蛋白未被MANDYS1识别(图1b的组g)。
以上结果示出：c.4303G＞T(p.Glu 1435X)的点突变存在于该肌营养不良蛋白基因中的前述患者体内显现出完整长度的肌营养不良蛋白mRNA与外显子31缺失(Δ外显子31)的肌营养不良蛋白mRNA这两种。另外，这些结果还暗示了该点突变不仅破坏肌营养不良蛋白基因的ORF，还破坏外显子31的剪接信号。
(利用小基因进行的、细胞的剪接分析1)
为了进一步分析该假设，构建了在用于细胞的剪接分析的H492载体(Mol Genet Metab(2005)85,213-219.,J Med Genet(2006)43,924-930.,Hum Genet(2007)120,737-742.)中插入包括突变型外显子31和其两侧相邻的内含子在内的肌营养不良蛋白基因断片(突变型小基因)而成的质粒(H492-dys Ex31质粒)，在转染了所述质粒的Hela细胞中调查了该基因断片的mRNA。其中，H492载体编码两个盒式外显子(A和B)和包含多克隆位点的内含子序列。
H492-dys Ex31质粒用以下那样的方法构建。用PCR由KUCG797的基因组DNA扩增了包括肌营养不良蛋白基因的突变型外显子31和其两侧相邻的内含子区域在内的断片。作为引物，使用了内含子30f-NheI(GCGGCTAGCGTGATCCACCTGCCTCGAC：序列号4)以及内含子31r-BamHI(GCGGGATCCTCAAATCCAATCTTGCCAAT：序列号5)。将用NheI和BamHI(New England Biolabs公司制造)消化前述扩增产物而得的断片插入用这两种酶消化的H492中。由此，构建了包含包括来源于KUCG797的突变型外显子31和其两侧相邻的内含子区域在内的断片(突变型小基因)的质粒(H492-dys Ex31m质粒)(图1e)。另外，通过利用了健康人的基因组DNA的同样的方法，构建了包含包括肌营养不良蛋白基因的野生型外显子31和其两侧相邻的内含子区域在内的断片(野生型小基因)的质粒(H492-dys Ex31w质粒)(图1e)。对H492-dys Ex31m质粒和H492-dysEx31w质粒均进行了质粒的全序列的分析，确认包含目标断片。
将H492-dys Ex31m质粒、H492-dys Ex31w质粒分别转染至Hela细胞中，得到H492-dys Ex31m/Hela和H492-dys Ex31w/Hela。按照制造者手册使用lipofectamine 2000(invitrogen Corporation制造)进行转染。在通过转染得到的这些细胞中，由CMV启动子(CMVp)转录了mRNA前体。
以从H492-dys Ex31m/Hela或H492-dys Ex31w/Hela中分离的总RNA为模板，使用前述内含子30f和内含子30r作为引物，用RT-PCR对包含小基因的区域进行扩增。将该扩增产物在Tris-硼酸盐/EDTA缓冲液中、2%琼脂糖凝胶上进行电泳的结果示于图1f。左边第3个泳道(m)表示以来源于H492-dys Ex31m/Hela的总RNA为模板的结果，左侧第2个泳道(w)表示以来源于H492-dys Ex31w/Hela的总RNA为模板的结果。在包含野生型小基因的转化细胞(H492-dys Ex31w/Hela)中，观察到包含外显子A、31和B的一个RT-PCR产物。另一方面，在包含突变型小基因的转化细胞(H492-dys Ex31m/Hela)中，检测到两个PCR产物(图1f)。进行序列确定的结果，可确认小侧的DNA产物中不含外显子31(未示出数据)。其中，作为阴性对照，将除了未添加逆转录酶(RT)以外同样地进行RT-PCR处理而得的产物在琼脂糖凝胶上进行电泳的结果示于图1f的最右侧的泳道(m)和右侧第2个泳道(w)。从以上结果可以明确，该患者体内的点突变引起肌营养不良蛋白的外显子31的跳跃，克隆至H492载体中的肌营养不良蛋白基因的一部分具有重现在患者肌肉中观察到的外显子31的跳跃的能力。
实施例2
[与外显子31剪接相关的剪接调节因子的分析]
前述实施例1的结果显示：KUCG797的肌营养不良蛋白基因的外显子31的点突变会引起外显子跳跃，因此尝试着进行了调节外显子31跳跃、内含物(inclusion)的候选因子的鉴定。
(基于SpliceAid程序的序列分析)
用SpliceAid程序(http://www.introni.it/splicing.html)(Bioinformatics(2009)25,1211-1213.)分析肌营养不良蛋白基因的野生型外显子31和突变型外显子31的RNA序列时可知，该突变型外显子31的点突变会使其与作为SR蛋白质成员的SRp30c/SRSF9(SFSR9)的结合力降低(图2a)。已知SR蛋白质与多为富嘌呤的外显子剪接增强子(ESE)结合。外显子31的序列与用SELEX鉴定的SRp30c/SRSF9具有高亲和性结合序列和高类似性(图2b)(Rna(2007)13,1287-1300.)。上述突变型外显子31的突变不仅破坏与SRp30c/SRSF9的结合部位，还会产生hnRNPA1高亲和性结合部位(图2a)。换言之，上述突变型外显子31的突变会产生与hnRNPA1的SELEXwinner序列具有高相同性的RNA序列(图2b)(Embo J(1994)13,1197-1204.)。众所周知，hnRNPA1与外显子剪接沉默子(ESS)结合，会产生外显子跳跃。SpliceAid程序的结果暗示了：肌营养不良蛋白基因的外显子31的ESE被SRp30c/SRSF9识别，通过突变使ESE变为与hnRNPA1结合的ESS。
(迁移率变动分析法)
为了验证肌营养不良蛋白基因的外显子31的ESE被SRp30c/SRSF9识别，并通过突变使ESE变为与hnRNPA1结合的ESS这一假设，首先，通过迁移率变动分析法比较了突变型外显子31RNA与hnRNPA1的结合活性以及野生型外显子31RNA与hnRNPA1的结合活性。具体而言，通过以下方法进行比较。
对人hnRNPA1cDNA进行PCR扩增，将所得扩增断片插入GST-pCDNA3的BamHI部位和NotI部位之间，制作了GST-hnRNPA1质粒。进行该质粒的全序列的确定，确认包含目标断片。将该GST-hnRNPA1质粒转染至HEK293T细胞中，对所得转化细胞进行培养。按照文献(Methods Mol Biol(2008)488,357-365.)记载的方法由回收的转化细胞制备全细胞溶解物。除了在用色谱柱溶出之前用缓冲液E(20mMHepes-KOHpH7.9、1000mM KCl、0.2mM EDTA、10%甘油和1mM DTT)将树脂洗涤两次以外，基本上如文献(The Journal of biological chemistry(2002)277,7540-7545.)中记载的那样，使用抗GST亲和性树脂(SIGMA公司制造)，由前述全细胞溶解物提纯GST-hnRNPA1蛋白质。接着，将用32P标记的突变型外显子31RNA或野生型外显子31RNA与前述GST-hnRNPA1蛋白质混合，在20℃下培养30分钟，对所得复合物进行迁移率变动分析。具体而言，使用了以下方法。
迁移率变动分析基本上如文献(Nucleic acids research(1995)23,3638-3641.)中记载的方法那样进行。即，通过将前述各复合物用8%天然聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，从而进行分析。带的分析通过自动射线照相术进行。该分析所使用的结合缓冲液中含有16mM Hepes-KOH(pH7.9)、80mMKCl、0.16mM EDTA、0.8mM DTT、8%甘油、100ng/μl的BSA、50ng/μl的E.coli tRNA(Sigma Chemical Co.公司制造)、5×104cpm的RNA(用32P标记的肌营养不良蛋白基因的突变型外显子31RNA或野生型外显子31RNA)以及1U/μl的RNasin(注册商标)(Promega公司制造)。该迁移率变动分析法的结果示于图3a。
如图3a所示那样，hnRNPA1的浓度低时，野生型外显子31RNA和突变型外显子31RNA两者基本同样地结合(图3a的泳道3、4和泳道8、9)。可以认为这也许是因为野生型和突变型两者的外显子31上存在共通的hnRNPA1结合部位(Hum Mol Genet(2006)15,999-1013.)。但是，hnRNPA1浓度更高时，相比于与野生型外显子31RNA的结合，hnRNPA1与突变型外显子31RNA更有效地结合，从而形成包含hnRNPA1多聚体的更大的复合物(图3a的泳道5和泳道10)。这些结果暗示了：在前述患者体内观察到的外显子31的点突变使外显子31上产生相对于hnRNPA1的新的高亲和性结合部位，其结果使突变型外显子31RNA上易于分布更多的hnRNPA1。该结果强烈暗示了：由于突变型外显子31与hnRNPA1具有更强的结合亲和性，因此在剪接时，无法有效地以外显子的形式被识别出。为了调查该可能性，接着，进行了体外的剪接分析。
(体外的转录和剪接分析)
可以认为存在以下可能性：突变型外显子31与hnRNPA1具有更强的结合亲和性，因此在剪接时，无法有效地以外显子的形式被识别出。为了验证该可能性而进行了体外的剪接分析。
首先，为了进行所述分析，在鸡δ晶状体球蛋白(CDC)mRNA前体(Molecular cell(2000)6,673-682.)的内含子区域制备了包含肌营养不良蛋白基因的野生型外显子31或前述突变型外显子31的mRNA前体(参照图3b的组右侧的构建物)。具体而言，通过将用PCR扩增的野生型外显子31插入pCDC(Molecular cell(2000)6,673-682.)的SacI部位与StyI部位之间，制作了pCDC-dys Ex31w。另外，使用突变型外显子31来代替野生型外显子31，用同样的方法制作了pCDC-dys Ex31m。用SmaI分别将pCDC-dysEx31w和pCDC-dys Ex31m制成线状，作为体外转录的模板。按照文献(Molecular cell(2000)6,673-682.)中记载的方法，以mRNA前体被32P标记的方式在体外进行转录，接着，对已转录的mRNA前体进行提纯。另外，体外剪接分析如下进行：按照文献(Molecular cell(2000)6,673-682.)中记载的方法，以10μl规模将这些mRNA前体(CDC-dys Ex31w mRNA前体或CDC-dys Ex31m mRNA前体)与Hela细胞核提取物(Cilbiotech公司制造)混合，接着，在30℃下按照组上部所示的时间(0、15、30、60、90分钟)进行培养。将培养得到的mRNA产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，接着，通过自动射线照相术进行RNA带的分析。将该结果示于图3b。
对使用了包含野生型外显子31的CDC-dys Ex31w mRNA前体的结果(图3b的泳道3~5)与使用了包含突变型外显子31的CDC-dys Ex31mmRNA前体的结果(图3b的泳道8~10)进行了比较，与前者相比，后者的包含外显子31的mRNA产物(图3b的组右侧标黑点位置的结构的mRNA产物)的生成效率低。另一方面，关于不含外显子31的mRNA产物(包含外显子14和15的mRNA产物)，使用了包含突变型外显子31的CDC-dysEx31m mRNA前体时更有效地生成。
(利用小基因进行的、细胞的剪接分析2)
接着，通过在前述实施例1中制作的H492-dys Ex31m/Hela(转染了包含突变型小基因的质粒的Hela细胞)中，使RNA结合蛋白质(SRp30c/SRSF9或SRp75/SRSF4)进一步过度表达，调查了其对突变型小基因的剪接模型会造成何种影响。
用于SRp30c/SRSF9的过度表达的质粒(Flag-SRp30c质粒)通过将用PCR扩增的人SRp30c的cDNA插入Flag-pCDNA3(The Journal of biologicalchemistry(2004)279,7009-7013.)的BamHI部位与XhoI部位之间而制作，用于SRp75/SRSF4的过度表达的质粒(Flag-SRp75质粒)通过将用PCR扩增的小鼠SRp75的cDNA插入Flag-pCDNA3的BamHI部位与XhoI部位之间而制作。
另外，Flag-hnRNPA1质粒用以下那样的方法制作。对人hnRNPA1cDNA进行PCR扩增，将所得扩增断片插入Flag-pCDNA3(Nucleic acids research(2009)37,6515-6527.)的BamHI部位与NotI部位之间，由此制作了Flag-hnRNPA1质粒。进行该质粒的全序列的确定，确认了包含目标断片。将该Flag-hnRNPA1质粒转染至HEK293T细胞中，对所得转化细胞进行培养。按照文献(Methods Mol Biol(2008)488,357-365.)中记载的方法由回收的转化细胞制备全细胞溶解物。除了在用色谱柱溶出之前用缓冲液E(20mM Hepes-KOH pH7.9、1000mM KCl、0.2mMEDTA、10%甘油和1mM DTT)将树脂洗涤两次以外，基本上如文献(TheJournal of biological chemistry(2002)277,7540-7545.)中记载的那样，使用抗Flag-M2亲和性树脂(SIGMA公司制造)，由前述全细胞溶解物提纯Flag-hnRNPA1蛋白质。
使用lipofectamine 2000(invitrogen Corporation制造)对H492-dysEx31m质粒和Flag-SRp30c质粒进行共转染，得到H492-dysEx31m·Flag-SRp30c/Hela。另外，使用lipofectamine 2000(invitrogenCorporation制造)对H492-dys Ex31m质粒和Flag-SRp75质粒进行共转染，得到H492-dys Ex31m·Flag-SRp75/Hela。此外，使用lipofectamine 2000(invitrogen Corporation制造)对H492-dys Ex31m质粒和Flag-hnRNPA1质粒进行共转染，得到H492-dys Ex31m·Flag-hnRNPA1质粒/Hela。
针对这些各转化细胞，进行与前述实施例1的“利用小基因进行的、细胞的剪接分析1”同样的剪接分析，将其结果示于图3c。图3c的最左侧的泳道表示标记，左侧第2个泳道(模拟试验)表示以来源于H492-dysEx31m/Hela的总RNA为模板的结果，左边第3个泳道(SRp30c/SRSF9)表示以来源于H492-dys Ex31m·Flag-SRp30c/Hela的总RNA为模板的结果，右侧第2个泳道(SRp75/SRSF4)表示以来源于H492-dysEx31m·Flag-SRp75/Hela的总RNA为模板的结果，最右侧的泳道(hnRNPA)表示以来源于H492-dys Ex31m·Flag-hnRNPA1质粒/Hela的总RNA为模板的结果。另外，对图3c的带浓度进行定量，算出外显子31发生跳跃的mRNA相对于包含外显子31的mRNA的比率(Exon skip/inclusion ratio：外显子跳跃/内含物比)，将其结果示于图3d。
由图3c和图3d的结果可知，与对照时(图3c和图3d的模拟试验)相比，SRp30c/SRSF9过度表达时(图3c和图3d的SRp30c/SRSF9)，外显子跳跃/内含物比显著降低。另一方面，与对照时(图3c和图3d的模拟试验)相比，hnRNPA1过度表达时(图3c和图3d的hnRNPA1)，外显子跳跃/内含物比显著上升。其中，使用作为SR蛋白质其它成员的SRp75/SRSF4(Molecular and cellular biology(1993)13,4023-4028.)作为其它对照时(图3c和图3d的SRp75/SRSF4)，外显子跳跃/内含物比与对照的情况(图3c和图3d的模拟试验)相比没有变化，剪接模型未发生变化。
以上结果强烈暗示了：肌营养不良蛋白外显子31包含SRp30c/SRSF9依赖性ESE，通过该ESE突变而转变为与hnRNPA1结合的ESS，会引起外显子31跳跃。
实施例3
[TG003对H492-dys Ex31m/Hela的突变型外显子31的跳跃的效果]
本发明人等为了找到能够促进肌营养不良蛋白基因的外显子31跳跃的低分子化合物，对各种低分子化合物进行了探索。作为其代表例，以下记载了TG003和SRPIN340的结果。
TG003和SRPIN340均作为影响替代剪接的低分子化合物而为人所知。SRPIN340是SR蛋白激酶(SRPKs)(Proc Natl Acad Sci USA(2006)103,11329-11333.)的特异性抑制剂，估计是可以通过由SRPK引起的SR蛋白质的磷酸化抑制来调节替代剪接(Biochem J(2009)417,15-27.,GenomeBiol(2009)10,242.)。另一个是命名为TG003的Clk激酶的抑制剂。现已明确：TG003会影响腺病毒E1A、SC35和Clk自身(非专利文献12和13)的替代剪接。
(利用小基因进行的、细胞的剪接分析3)
将H492-dys Ex31m/Hela(转染了包含突变型小基因的质粒的Hela细胞)在30μM的包含TG003的DMSO溶液或30μM的包含SRPIN340的DMSO溶液中培养24小时。作为阴性对照，使用DMSO溶液同样进行培养。针对所培养的各细胞，进行与前述实施例1的“利用小基因进行的、细胞的剪接分析1”同样的剪接分析(使用了从细胞提取出的总RNA的RT-PCR分析)，将其结果示于图4a。图4a的最左侧的泳道表示用
Figure BDA00002615926800241
消化的DNA大小标记，左侧第2个泳道(DMSO)表示将H492-dys Ex31m/Hela用DMSO处理时的结果，左边第3个泳道(TG003)表示将H492-dysEx31m/Hela用TG003处理时的结果，最右侧的泳道(SRPIN340)表示将H492-dys Ex31m/Hela用SRPIN340处理时的结果。另外，将对图4a的带浓度进行定量、从而算出的外显子跳跃/内含物比的结果示于图4b。
由图4a和图4b的结果可知，用SRPIN340处理时(图4a和图4b的SRPIN340)，显示与对照时(图4a和图4b的DMSO)基本无变化的外显子跳跃/内含物比，但与对照时(图4a和图4b的DMSO)相比，用TG003处理时(图4a和图4b的TG003)的外显子跳跃/内含物比显著上升。即表示：SRPIN340对外显子31的跳跃基本无影响，TG003显著地促进外显子31的跳跃。
(利用小基因进行的、细胞的剪接分析4)
“利用小基因进行的、细胞的剪接分析3”的结果还存在TG003不仅促进突变型外显子31的跳跃、还会促进野生型外显子31的跳跃的可能。因此，使用了H492-dys Ex31m/Hela(转染了包含突变型小基因的质粒的Hela细胞)和H492-dys Ex31w/Hela(转染了包含野生型小基因的质粒的Hela细胞)，通过与前述“利用小基因进行的、细胞的剪接分析3”同样的方法进行了剪接分析。其中，作为用于处理细胞的溶液，使用了各种浓度(0μM、5μM、10μM、20μM、30μM、50μM)的包含TG003的DMSO溶液。将其结果示于图4c。另外，将对图4c的带浓度进行定量、从而算出的外显子跳跃/内含物比的结果示于图4d。
由图4c和图4d的结果可知，在H492-dys Ex31m/Hela(转染了包含突变型小基因的质粒的Hela细胞)中，TG003依赖于用量地促进了外显子31的跳跃。另一方面，在H492-dys Ex31w/Hela(转染了包含野生型小基因的质粒的Hela细胞)中，即使TG003为50μM，也不会引起外显子31的跳跃，图4d的图表基本变成沿着横轴的结果。这些结果显示了：TG003不会促进野生型外显子31的外显子跳跃，但会特异性地促进突变型外显子31的外显子31的跳跃。
实施例4
[TG003对H492-dys Ex27m/Hela的突变型外显子27的跳跃的效果]
为了确认TG003对除肌营养不良蛋白基因的外显子31以外的外显子的突变是否也会发挥促进跳跃的效果，对来源于与KUCG797患者不同的肌营养不良患者的肌营养不良蛋白基因的突变进行了分析。在该患者的肌营养不良蛋白基因的突变中观察到外显子27。该突变是肌营养不良蛋白cDNA(序列号1)的3613号的鸟嘌呤核苷酸缺失的突变(c.3613delG)。该突变是使肌营养不良蛋白cDNA(序列号1)的读码框迁移的移码突变，其结果，使该突变的偏近C末端侧(肌营养不良蛋白cDNA(序列号1)的3641号至3643号核苷酸部分)产生了终止密码子(stop codon)。根据本说明书的背景技术中记载的读码框规则，由该基因型可以预测该症例不会产生肌营养不良蛋白，并会成为重度DMD，但其实际症状却比预测轻。
用PCR由该患者的基因组DNA扩增了包括肌营养不良蛋白基因的突变型外显子27和其两侧相邻的内含子区域在内的断片。作为引物，使用了内含子26f-NheI (GCGGCTAGCAAATTTATGGAAGAGACTGGAGTTCA：序列号6)以及内含子27r-BamHI (GCGGGATCCCAAGTTAAGCAAATGGCCCAAA：序列号7)。将用NheI(New England Biolabs公司制造)和BamHI(New England Biolabs公司制造)消化该增副产物而得的断片插入用这两种酶消化的H492载体中。由此，构建了包含包括来源于该患者的突变型外显子27和其两侧相邻的内含子区域在内的断片的质粒(H492-dysEx27m)。另外，通过与利用了健康人的基因组DNA的同样的方法，构建了包含包括肌营养不良蛋白基因的野生型外显子27和其两侧相邻的内含子区域在内的断片的质粒(H492-dys Ex27w)。对H492-dys Ex27m质粒和H492-dys Ex27w质粒均进行了质粒的全序列的分析，确认包含目标断片。
用与前述“利用小基因进行的、细胞的剪接分析1”的方法同样的方法，将H492-dys Ex27m和H492-dys Ex27w分别转染至Hela细胞中，得到H492-dys Ex27m/Hela和H492-dys Ex27m/Hela。
除了分别使用H492-dys Ex27m/Hela和H492-dys Ex27m/Hela来代替H492-dys Ex31m/Hela和H492-dys Ex31m/Hela之外，用与前述“利用小基因进行的、细胞的剪接分析4”的方法同样的方法进行了剪接分析。将其结果示于图5a。另外，将对图5a的带浓度进行定量、从而算出的外显子跳跃/内含物比的结果示于图5b。
由图5a和图5b的结果可知，在利用了突变型外显子27的H492-dysEx27m/Hela中，TG003依赖于用量地促进了该外显子27的跳跃。另一方面，在利用了野生型外显子27的H492-dys Ex27w/Hela中，即使TG003为50μM，也不会引起外显子27的跳跃，图5b的图表基本变成沿着横轴的结果。即表示：TG003不会促进野生型外显子27的外显子跳跃，但会特异性地促进突变型外显子27的外显子27的跳跃。由这些结果可以明确：TG003不仅促进突变型外显子31的跳跃，还会促进突变型外显子27的跳跃。
实施例5
[TG003对来源于KUCG797的细胞中的、突变型外显子31的跳跃的效果]
接着，利用来源于患者(KUCG797)的肌细胞调查TG003对肌营养不良蛋白基因的剪接的影响。
(来源于KUCG797的肌细胞的剪接分析)
首先，对采取自KUCG797的肌细胞进行初代培养。具体而言，按照以下那样的方法进行。用在6孔板(Gelatin-Coated micro plate 6 well withLid；IWAKI公司制造)中添加20%的FBS(Gibco公司制造)、4%的Ultroser(注册商标)G(PALL公司制造)和1%的Antibiotic-Antimyotic(Gibco公司制造)直至其铺满的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Sigma公司制造)培养来源于患者的肌细胞。为了使肌细胞分化成肌管，在添加了2%马血清(Gibco公司制造)和1%Antibiotic-Antimyotic(Gibco公司制造)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Sigma公司制造)中，在存在或不存在各种浓度(1μM、2μM、5μM、7μM、10μM)的TG003的条件下，对前述初代肌细胞进行两周的培养。每隔两天更换培养基和TG003。
使用这些经培养的肌细胞，进行了剪接分析。作为其方法，除了使用前述正向c27f和反向2F的两引物代替内含子30f-NheI和内含子31r-BamHI的两引物以外，使用了与前述“利用小基因进行的、细胞的剪接分析3”同样的方法。前述正向c27f和反向2F的两引物为对肌营养不良蛋白基因的外显子27至32为止的区域进行扩增而得的引物对。将所述剪接分析的结果示于图6a。另外，将对图6a的带浓度进行定量、从而算出的外显子跳跃/内含物比的结果示于图6b。
由图6a和图6b的结果可知，即使使用来源于KUCG797的肌细胞时，TG003也依赖于用量地促进外显子31的跳跃。这些结果暗示了：TG003能够促进患者细胞的突变型外显子31的跳跃，进而，还可强烈期待其能够增加在某种程度上残存肌营养不良蛋白的功能的截短型肌营养不良蛋白的表达。
(来源于KUCG797的肌细胞中的截短型肌营养不良蛋白的表达分析)
为了确认前述来源于KUCG797的肌细胞中截短型肌营养不良蛋白实际上是否会表达，进行了以下蛋白印迹分析。
在添加了2%马血清(Gibco公司制造)和1% Antibiotic-Antimyotic(Gibco公司制造)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Sigma公司制造)中，在存在或不存在7μM的TG003的条件下，对前述来源于KUCG797的初代肌细胞进行两周的培养。每隔两天更换培养基和TG003。将这些经培养的肌细胞用PBS洗涤两次，使用1XCell Lysis Buffer(Cell SignalingTechnology公司制造)进行回收。将从回收的细胞中提取的总蛋白质涂布在3~10%梯度聚丙烯酰胺凝胶(PAGEL、ATTO公司制造)上。其中，作为总蛋白质的涂布量，将对照设为4μg、突变TG003(0μM)设为20μg、突变TG003(7μM)设为60μg。将用聚丙烯酰胺凝胶电泳而得的蛋白质成分转移至HYBOND-P膜(GE Healthcare公司制造)上。按照制造者手册使用ECLadvance Western Blotting Detection kit(GE Healthcare公司制造)，对前述膜进行蛋白印迹分析。肌营养不良蛋白的C末端的抗体(NCL-DYS2、Leica公司制造)或与肌营养不良蛋白的外显子31相应的部分的抗体(8H11、SantaCruz公司制造)分别以1:10和1:100的稀释倍率使用，对前述膜进行培养。肌营养不良蛋白抗肌营养不良蛋白免疫复合物的检测使用抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare公司制造)。通过与上述产物相同的方案，进行结蛋白的蛋白印迹分析。以1:50的稀释倍率使用结蛋白抗体(H-76、Santa Cruz公司制造)。结蛋白抗结蛋白免疫复合物的检测使用抗兔IgG抗体(GE Healthcare公司制造)。
将以上蛋白印迹分析的结果示于图6c。从使用了肌营养不良蛋白的C末端的抗体的结果(Dystrophin(C-terminal))可知，给药TG003时显示肌营养不良蛋白的表达增加。其中，该肌营养不良蛋白中未检测到与外显子31相应的部分的抗体(图6的Dystrophin(Exon 31/32)的结果)，因此可以认为该肌营养不良蛋白中与外显子31相应的部分(编码外显子31的肽)缺失。以上结果显示出：TG003通过促进来源于具有c.4303G＞T突变的KUCG797的细胞的外显子31的跳跃，促进截短型肌营养不良蛋白的表达。
产业上的可利用性
本发明可优选用于预防/改善遗传性疾病的领域。更详细而言，可优选用于预防/改善起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的领域。
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Figure IDA00002615927400041
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Figure IDA00002615927400071
Figure IDA00002615927400081

Claims (10)

1.一种预防/改善剂，其特征在于，该预防/改善剂为起因于基因外显子的突变、且可使包含该突变的外显子跳跃而生成功能性截短型蛋白质的遗传性疾病的预防/改善剂，含有分子量1500以下的化合物。
2.根据权利要求1所述的预防/改善剂，其特征在于，所述化合物为具有剪接调节作用的化合物。
3.根据权利要求1或2所述的预防/改善剂，其特征在于，所述化合物为具有诱发/促进包含突变的外显子的跳跃的效果的化合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，所述化合物为Cdc-like激酶抑制化合物。
5.根据权利要求4所述的预防/改善剂，其特征在于，所述Cdc-like激酶抑制化合物为通式(1)所示的化合物，
[化学式1]
Figure FDA00002615926700011
式(1)中，R1和R2各自独立地表示直链状、支链状的C1-C10的烃基；R3表示甲氧基、乙氧基、乙酰氧基或卤原子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，所述突变为无义突变。
7.根据权利要求6所述的预防/改善剂，其特征在于，所述无义突变为抑制所述基因的外显子剪接增强子活性、和/或、使所述基因的外显子剪接沉默子活性提升的无义突变。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的预防/改善剂，其特征在于，所述基因为肌营养不良蛋白基因，所述功能性截短型蛋白质为功能性截短型肌营养不良蛋白质，所述遗传性疾病为杜氏肌营养不良。
9.根据权利要求8所述的预防/改善剂，其特征在于，所述肌营养不良蛋白基因的外显子为肌营养不良蛋白基因的外显子31或外显子27。
10.根据权利要求9所述的预防/改善剂，其特征在于，所述肌营养不良蛋白基因的外显子31的突变为序列号1的多聚核苷酸序列的核苷酸编号4303中的鸟嘌呤向胸腺嘧啶的无义突变，外显子27的突变为序列号1的多聚核苷酸序列的核苷酸编号3613中的鸟嘌呤缺失的移码突变。
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