CN103096926A - 无岩藻糖基化cd20抗体与抗vegf抗体的联合疗法 - Google Patents

无岩藻糖基化cd20抗体与抗vegf抗体的联合疗法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及无岩藻糖基化抗CD20抗体与抗VEGF抗体用于治疗癌症的联合疗法，特别地涉及用无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体和抗VEGF抗体治疗表达CD20的癌症的联合疗法。

Description

无岩藻糖基化CD20抗体与抗VEGF抗体的联合疗法
本发明涉及无岩藻糖基化CD20抗体与抗VEGF抗体用于治疗癌症的联合疗法。
发明背景
无岩藻糖基化的抗体
单克隆抗体的细胞介导的效应器功能可以通过工程化改造其寡糖组分来增强，如记载于
Figure BDA00002775548700011
P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及US6,602,684的。IgG1型抗体（即在癌症免疫疗法中最常使用的抗体）是在每个CH2域中的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。附着于Asn297的两个复合双触角寡糖掩埋于各CH2域间，与多肽主链形成广泛的接触，并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely，M.R.等,Glycobiology5(1995)813-822;Jefferis,R.等,Immunol.Rev.163(1998)59-76;Wright,A和Morrison,S.L.,TrendsBiotechnol.15(1997)26-32)。
Figure BDA00002775548700012
P.等.Nature Biotechnol.17(1999)176-180和WO99/54342显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)（一种催化两分型寡糖形成的糖基转移酶）在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高抗体的体外ADCC活性。N297碳水化合物的组成变化或其消除也影响Fc结合FcγR和C1q(P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180;Davies,J.等,Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294;Mimura,Y.等,J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547;Radaev,S.等,J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483;Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740;Simmons,L.C.等,J.Immunol.Methods263(2002)133-147)。
已经报告了讨论无岩藻糖基化的和岩藻糖基化的抗体（包括抗CD20抗体）的活性的研究(例如Iida,S.等,Clin.Cancer Res.12(2006)2879-2887;Natsume,A.等,J.Immunol.Methods306(2005)93-103;Satoh,M.等,ExpertOpin.Biol.Ther.6(2006)1161-1173;Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688;Davies,J.等,Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294。
CD20和抗CD20抗体
CD20分子（又称作人B淋巴细胞限制性分化抗原或Bp35）是一种已经广泛描述的位于前B和成熟B淋巴细胞上的疏水性跨膜蛋白(Valentine,M.A.等,J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287;及Einfeld,D.A.等,EMBO J.7(1988)711-717;Tedder,T.F.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212;Stamenkovic,I.等,J.Exp.Med.167(1988)1975-1980;Tedder，T.F.等,J.Immunol.142(1989)2560-2568)。CD20在大于90%的B细胞非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson,K.C.等,Blood63(1984)1424-1433)，但是在造血干细胞、原B细胞、正常的浆细胞、或其它正常的组织上没有找到(Tedder,T.F.等,J.Immunol.135(1985)973-979)。
存在着在其CD20结合模式和生物学活性方面显著不同的两种不同类型的抗CD20抗体(Cragg,M.S.等,Blood103(2004)2738-2743;及Cragg,M.S.等,Blood101(2003)1045-105)。I型抗体，如例如利妥昔单抗(rituximab)（一种具有85%或更高的岩藻糖量的非无岩藻糖基化抗体）在补体介导的细胞毒性中是有力的。
II型抗体，如例如托西莫单抗(Tositumomab)(B1)、11B8、AT80或人源化B-Ly1抗体经由不依赖于胱天蛋白酶的凋亡及伴随的磷脂酰丝氨酸暴露而有效启动靶细胞死亡。
表1中汇总了I型和II型抗CD20抗体共享的共同特征。
表1：I型和II型抗CD20抗体的特性
Figure BDA00002775548700021
Figure BDA00002775548700031
VEGF和抗VEGF抗体
人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)记载于例如Leung,D.W.等,Science246(1989)1306-1309;Keck,P.J.等,Science246(1989)1309-1312及Connolly,D.T.等,J.Biol.Chem.264(1989)20017-20024。VEGF牵涉调节正常的和异常的血管发生及与肿瘤和眼内病症有关的新血管化(Ferrara,N.和Davis-Smyth,T.,Endocr.Rev.18(1997)4-25;Berkman,R.A.等,J.Clin.Invest.91(1993)153-159;Brown,L.F.等,Human Pathol.26(1995)86-91;Brown,L.F.等,Cancer Res.53(1993)4727-4735;Mattern,J.等,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934;及Dvorak,H.等,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是已经从数种来源分离的同二聚体糖蛋白。VEGF对内皮细胞显示高度特异的促有丝分裂活性。VEGF在胚胎血管生成期间在新血管形成中和在成年期间在血管发生中具有重要的调节功能(Carmeliet,P.等,Nature,380(1996)435-439;Ferrara,N.等,Nature,380(1996)439-442;综述见Ferrara,N.和Davis-Smyth,T.,Endocrine Rev.,18(1997)4-25)。已经在研究中证明了VEGF发挥的作用的意义，该研究显示了单个VEGF等位基因的失活由于不能形成血管系统(vasculature)而导致胚胎致死性(Carmeliet,P.等,Nature,380(1996)435-439;Ferrara,N.等,Nature,380(1996)439-442)。另外，VEGF对单核细胞具有强化学引诱物活性，能诱导内皮细胞中的血纤维蛋白溶酶原激活剂和血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂，而且还能诱导微血管通透性。由于后一种活性，它有时称为血管通透性因子(VPF)。已经综述了VEGF的分离和特性；见Ferrara,N.等,J.Cellular Biochem.,47(1991)211-218和Connolly,J.Cellular Biochem.,47(1991)219-223。单个VEGF基因的mRNA可变剪接产生5种VEGF同等型。
抗VEGF中和性抗体抑制多种人肿瘤细胞系在小鼠中的生长(Kim,K.J.等,Nature362(1993)841-844;Warren,S.R.等,J.Clin.Invest.95(1995)1789-1797;Borgstrom,P.等,Cancer Res.56(1996)4032-4039;和Melnyk,O.等,Cancer Res.56(1996)921-924)。
在一个实施方案中，抗VEGF抗体包括与由杂交瘤ATCC HB10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；依照Presta,L.G.等,Cancer Res.57(1997)4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为“贝伐单抗(BV)”（又称为“rhuMAb VEGF”或“AVASTIN”）的抗体。贝伐单抗包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区，所述鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1阻断人VEGF与其受体的结合。贝伐单抗约93%的氨基酸序列（包括大多数框架区）自人IgG1衍生，而约7%的序列自鼠抗体A4.6.1衍生。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，并且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。别的优选抗体包括G6或B20系列抗体（例如，G6-23、G6-31、B20-4.1），如记载于PCT申请公开文本No.WO2005/1012359的。关于别的优选抗体，见美国专利No.US7,060,269、US6,582,959、US6,703,020；US6,054,297；WO98/145332；WO96/130046；WO94/110202；EP0666868B1；美国专利申请公开文本No.US2006009360、US20050186208、US20030206899、US20030190317、US20030203409、和US20050112126；及Popkov.,M.等,Journal of ImmunologicalMethods288(2004)149-164。它们以结合人和鼠VEGF为特征；这是研究其在小鼠模型中对鼠muVEGF刺激的血管发生的效力的前提。依照本发明的“G6系列抗体”是自依照PCT申请公开文本No.WO2005/1012359的图7、24-26、和34-35之任一的G6抗体或G6衍生抗体序列衍生的抗VEGF抗体。依照本发明的“B20系列抗体”是自依照PCT申请公开文本No.WO2005/1012359的图27-29之任一的B20抗体或B20衍生抗体序列衍生的抗VEGF抗体。
WO94/10202、WO98/45332、WO2005/00900和WO00/35956提及针对VEGF的抗体。人源化单克隆抗体贝伐单抗（以商品名
Figure BDA00002775548700041
出售）是一种在肿瘤疗法中使用的抗VEGF抗体(WO98/45331)。
兰尼单抗(ranibizumab)（商品名
Figure BDA00002775548700042
）是一种与贝伐单抗（Avastin）自同一亲本鼠抗体衍生的单克隆抗体片段。它比亲本分子小得多，并且已经经过亲和力成熟，从而提供更强的对VEGF-A的结合(WO98/45331)。它是一种已经被批准用于治疗“湿”型年龄相关的黄斑变性(ARMD)(即，一种常见形式的年龄相关的视力丧失)的抗血管生成剂。
另一种抗VEGF抗体是例如记载于WO2005/012359A3中在US2007/0141065中的B20-4.1。
另一种抗VEGF抗体是例如记载于WO2005/012359A3的HuMab G6-31。
已经有使用贝伐单抗与利妥昔单抗和其它药物的组合进行临床前和/或临床研究的报告（例如Ganjoo,K.N.等,Leuk Lymphoma47(2006)998-1005;Ruan,J.等,Annals of Oncology20(2009)413-424）。
发明概述
我们现在已经发现了无岩藻糖基化抗CD20抗体与抗VEGF抗体的组合显示协同抗增殖效果。
本发明包括具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体用于制造与抗VEGF抗体联合治疗癌症的药物的用途。
本发明的一个方面是一种治疗患有癌症的患者的方法，其通过与VEGF抗体组合抗对需要此类治疗的患者施用具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体来进行。
本发明的另一个方面是具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体，其用于与抗VEGF抗体联合治疗癌症。
在一个实施方案中，岩藻糖量介于占Asn297处的寡糖（糖）总量的40%和60%之间。
在另一个实施方案中，岩藻糖量占Asn297处的寡糖（糖）总量的0%。
在一个实施方案中，无岩藻糖基化抗CD20抗体是IgG1抗体。
在另一个实施方案中，所述癌症是表达CD20的癌症，优选地，B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，在一个实施方案中，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体。
在一个实施方案中，所述抗VEGF抗体是贝伐单抗、B20系列抗体或G6系列抗体，在一个实施方案中是B20系列抗体，而在一个实施方案中是贝伐单抗。
在一个实施方案中，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体，并且所述抗VEGF抗体是贝伐单抗、B20系列抗体或G6系列抗体，而所述癌症是表达CD20的癌症，在一个实施方案中是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
在一个实施方案中，无岩藻糖基化抗CD20抗体以10-8M至10-13M的KD结合CD20。
本发明的一个实施方案是一种用于治疗癌症的组合物，其包含具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体（在一个实施方案中是无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体）和抗VEGF抗体（在一个实施方案中是贝伐单抗或B20系列抗体）。
附图简述
图1：小鼠异种移植物（具有SU-DHL-4人淋巴瘤细胞）的体内肿瘤生长抑制；比较单独的或组合的抗CD20抗体（糖工程化人源化B-Ly1；B-HH6-B-KV1GE=GA101）和抗VEGF抗体B20-4.1。该组合在肿瘤生长抑制方面显示协同效果。
发明详述
本发明包括IgG1或IgG3同种型的具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体用于制造与抗VEGF抗体联合治疗癌症的药物的用途。
在一个实施方案中，岩藻糖量占Asn297处的寡糖（糖）总量的40%至60%。
术语“抗体”涵盖各种抗体形式，包括但不限于完整的抗体、人抗体、人源化抗体和遗传工程抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体或重组抗体及此类抗体的片段，只要依照本发明的特征性特性得到保留。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。因而，术语“人单克隆抗体”指具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的展现出单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤生成的，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的自具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，例如转基因小鼠获得的B细胞。
术语“嵌合抗体”指通常通过重组DNA技术制备的包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是特别优选的。此类鼠/人嵌合抗体是包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段的所表达免疫球蛋白基因的产物。本发明所涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是那些其中类别或亚类已经自初始抗体的类别或亚类修饰或改变的。此类“嵌合”抗体又称为“类别转换抗体”。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本领域现在公知的常规重组DNA和基因转染技术。参见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad Sci.USA81(1984)6851-6855;US5,202,238和US5,204,244。
术语“人源化抗体”指其中的框架或“互补决定区”(CDR)已经进行过修饰以包含与亲本免疫球蛋白的特异性相比不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接入人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.等,Nature332(1988)323-327;及Neuberger,M.S.等,Nature314(1985)268-270。特别优选的CDR对应于那些代表上文对嵌合和双功能性抗体记录的识别抗原的序列的。
如本文中所使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374)。基于此类技术，可以生成针对极其多种靶物的人抗体。人抗体的例子记载于例如Kellermann,S.A.等,Curr.Opin.Biotechnol.13(2002)593-597。
如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或者自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体而言转基因的动物（例如小鼠）分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但可以不天然存在于体内的人抗体种系全集内的序列。
如本文中所使用的，术语“结合”或“特异性结合”指用纯化的野生型抗原在体外测定法中，优选地在等离振子共振测定法(BIAcore,GE-HealthcareUppsala,Sweden)中抗体对肿瘤抗原的表位的结合。结合亲和力通过术语ka（来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数）、kD（解离常数）、和KD(kD/ka)限定。结合或特异性结合意指10-8M或更小，优选地10-8M至10-13M（在一个实施方案中，10-9M至10-13M）的结合亲和力(KD)。如此，依照本发明的无岩藻糖基化抗体以10-8mol/l或更小，优选地10-8M至10-13M（在一个实施方案中，10-9M至10-13M）的结合亲和力(KD)特异性结合肿瘤抗原。
如本文中所使用的，术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但是优选的是双链DNA。
“恒定域”不直接牵涉抗体对抗原的结合，但是牵涉效应器功能（ADCC、补体结合、和CDC）。
如本文中所使用的，“可变区”（轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)）意为直接牵涉抗体结合抗原的轻链和重链域对之每种。人轻链和重链可变域具有相同的一般结构，并且每个域包含通过三个“高变区”（或互补决定区，CDR）连接的其序列广泛保守的四个框架(FR)区。框架区采用b-片层构象，而CDR可以形成连接b-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结构，并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。
术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是与如本文中所限定的高变区残基不同的那些可变域区。因此，抗体的轻链和重链包含自N至C端的域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区。CDR和FR区依照Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。
术语“无岩藻糖基化抗体”指在Fc区中在Asn297处具有改变的糖基化样式且具有降低的岩藻糖残基水平的IgG1或IgG3同种型的（优选地IgG1同种型的）抗体。在Asn297处发生人IgG1或IgG3的糖基化，作为以多至两个Gal残基为末端的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。根据末端Gal残基的量，这些结构称为G0、G1（α1,6或α1,3）或G2聚糖残基(Raju,T.S.,BioProcess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207描述。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体在Asn297处通常以至少85%的量进行岩藻糖基化。应当理解，如本文中所使用的，术语无岩藻糖基化抗体包括在其糖基化样式中没有岩藻糖的抗体。通常已知的是，抗体中典型的糖基化残基位置是依照EU编号系统的第297位的天冬酰胺(“Asn297”)。
“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用（例如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中报告的EU索引，通过提及而将其明确收入本文）。
如此，依照本发明的无岩藻糖基化抗体意指其中的岩藻糖量占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少（这意味着在Fc区中Asn297处的寡糖的至少40%或更多是无岩藻糖基化的）的IgG1或IgG3同种型的（优选地IgG1同种型的）抗体。在一个实施方案中，岩藻糖量占Fc区中Asn297处的寡糖的40%至60%。在另一个实施方案中，岩藻糖量是50%或更小，并且在又一个实施方案中，岩藻糖量占Fc区中Asn297处的寡糖的30%或更小。依照本发明，“岩藻糖的量”意指通过MALDI-TOF质谱术测量的，并以平均值计算的，相对于附着于Asn297的所有寡糖（糖）（例如复合的、杂合的和高甘露糖结构）的总和，Asn297处寡糖（糖）链内所述寡糖（岩藻糖）的量（关于测定岩藻糖量的详细规程，见例如WO2008/077546）。此外，在一个实施方案中，Fc区的寡糖是两分的。可以在工程化改造成表达至少一种核酸的糖修饰的宿主细胞中表达依照本发明的无岩藻糖基化抗体，所述核酸编码具有GnTIII活性的多肽，其量足以部分岩藻糖基化Fc区中的寡糖。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。或者，可以依照US6,946,292降低或消除宿主细胞的α1,6-岩藻糖基转移酶活性以生成糖修饰的宿主细胞。可以例如通过发酵条件（例如发酵时间）或者通过组合至少两种具有不同岩藻糖基化量的抗体来预先确定抗体岩藻糖基化的量。此类无岩藻糖基化抗体及相应的糖工程方法记载于WO2005/044859,WO2004/065540,WO2007/031875,Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180,WO99/154342,WO2005/018572,WO2006/116260,WO2006/114700,WO2005/011735,WO2005/027966,WO97/028267,US2006/0134709,US2005/0054048,US2005/0152894,WO2003/035835,WO2000/061739。这些糖工程抗体具有升高的ADCC。依照本发明产生无岩藻糖基化抗体的其它糖工程方法记载于例如Niwa,R.等,J.Immunol.Methods306(2005)151-160;Shinkawa,T.等,J.Biol.Chem.278(2003)3466-3473;WO03/055993或US2005/0249722。
如此，本发明的一方面是IgG1或IgG3同种型的（优选地IgG1同种型的），特异性结合CD20的，具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体用于制造与抗VEGF抗体联合治疗癌症的药物的用途。优选地，岩藻糖量占Asn297处的寡糖（糖）总量的40%至60%。
CD20（又称为B淋巴细胞抗原CD20、B淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16、Bp35、BM5、和LF5；序列以SwissProt数据库条目P11836为特征）是一种位于前B和成熟B淋巴细胞上的具有约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白(Valentine,M.A.等,J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287;Tedder,T.F.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212;Stamenkovic,I.等,J.Exp.Med.167(1988)1975-1980;Einfeld,D.A.等,EMBO J.7(1988)711-717;Tedder，T.F.等,J.Immunol.142(1989)2560-2568)。相应的人基因是跨膜4域，A亚家族，成员1，又称为MS4A1。此基因编码跨膜4A基因家族的一个成员。此初生蛋白质家族的成员以共同的结构特征和相似的内含子/外显子剪接边界为特征，并且在造血细胞和非淋巴样组织中展现出独特的表达样式。此基因编码B淋巴细胞表面分子，其在B细胞发育及分化成浆细胞中发挥作用。在一簇家族成员中，此家族成员定位于11q12。此基因的可变剪接产生编码同一蛋白质的两种转录物变体。
术语“CD20”和“CD20抗原”在本文中可互换使用，包括由细胞天然表达的或者在用CD20基因转染的细胞上表达的人CD20的任何变体、同等型和物种同系物。本发明的抗体对CD20抗原的结合通过灭活CD20而介导对表达CD20的细胞（例如，肿瘤细胞）的杀伤。可以通过下列一项或多项机制而发生对表达CD20的细胞的杀死：细胞死亡/凋亡诱导、ADCC和CDC。
如本领域中认可的，CD20的同义词包括B淋巴细胞抗原CD20、B淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16、Bp35、BM5、和LF5。
依照本发明的术语“抗CD20抗体”是特异性结合CD20抗原的抗体。根据抗CD20抗体对CD20抗原的结合特性和生物学活性，两种类型的抗CD20抗体（I型和II型抗CD20抗体）可以依照Cragg,M.S.等,Blood103(2004)2738-2743;及Cragg,M.S.等,Blood101(2003)1045-1052区别，参见表2。
表2：I型和II型抗CD20抗体的特性
Figure BDA00002775548700101
II型抗CD20抗体的例子包括例如人源化B-Ly1抗体IgG1（一种嵌合的人源化IgG1抗体，如披露于WO2005/044859中的）、11B8IgG1（如披露于WO2004/035607中的）、和AT80IgG1。通常，IgG1同种型的II型抗CD20抗体显示特征性的CDC特征。与IgG1同种型的I型抗体相比，II型抗CD20抗体具有降低的CDC（若为IgG1同种型的话）。
I型抗CD20抗体的例子包括例如利妥昔单抗、HI47IgG3（ECACC，杂交瘤）、2C6IgG1（如披露于WO2005/103081中的）、2F2IgG1（如披露于WO2004/035607和WO2005/103081的）和2H7IgG1（如披露于WO2004/056312中的）。
依照本发明的无岩藻糖基化抗CD20抗体在一个实施方案中是II型抗CD20抗体，在另一个实施方案中是无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体。
与没有降低岩藻糖的抗CD20抗体不一样，依照本发明的无岩藻糖基化抗CD20抗体具有升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。
“具有升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的无岩藻糖基化抗CD20抗体”意指具有如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测定的升高的ADCC的无岩藻糖基化抗CD20抗体，如该术语在本文中所定义的。一种公认的体外ADCC测定法如下：
1)该测定法使用已知表达受抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；
2)该测定法使用自随机选定的健康供体的血液分离的人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞；
3)依照下列方案来实施测定法：
i)使用标准的密度离心规程来分离PBMC，并将其以5x106个细胞/ml在RPMI细胞培养基中悬浮；
ii)将靶细胞通过标准的组织培养方法来培养，自具有高于90%的存活力的指数生长期收获，在RPMI细胞培养基中清洗，用100微居里51Cr标记，用细胞培养基清洗两次，并以105个细胞/ml的密度在细胞培养基中重悬浮；
iii)将100微升上述最终靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每孔；
iv)将抗体在细胞培养基中自4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml，并将50微升所得的抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞，一式三份测试覆盖上述整个浓度范围的多种抗体浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，含有经标记的靶细胞的平板中的3个另外的孔接受50微升非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的2%(VN)水溶液，代替抗体溶液（上述第iv点）；
vi)对于自发释放(SR)对照，含有经标记的靶细胞的平板中的3个另外的孔接受50微升RPMI细胞培养基，代替抗体溶液（上述第iv点）；
vii)然后，将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟，并于4°C温育1小时；
viii)将50微升PBMC悬浮液（上述第i点）添加至每孔以产生效应:靶细胞比率25:1，并将平板在培养箱中在5%CO2气氛下于37°C放置4小时；
ix)收获来自每孔的无细胞上清液，并使用γ计数器来量化实验释放的放射性(ER)；
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x100对每个抗体浓度计算比溶解的百分比，其中ER是对所述抗体浓度量化（参见上述第ix点）的平均放射性，MR是对MR对照（参见上述第v点）量化（参见上述第ix点）的平均放射性，而SR是对SR对照（参见上述第vi点）量化（参见上述第ix点）的平均放射性；
4)“升高的ADCC”定义为上文测试的抗体浓度范围内观察到的比溶解的最大百分比的增加和/或达到上文测试的抗体浓度范围内观察到的比溶解的最大百分比的一半所需要的抗体浓度降低。ADCC的升高相对于用上述测定法测量的，使用本领域技术人员已知的相同的标准生成、纯化、配制和贮存方法，由相同类型的宿主细胞产生的，但是并非由工程化改造成过表达GnTIII的宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。
可以通过所述抗体的糖工程化来获得所述“升高的ADCC”，其意味着通过工程化改造其寡糖组分来增强单克隆抗体的所述天然的、细胞介导的效应器功能，如记载于Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及US6,602,684的。
术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”指在存在补体的情况中依照本发明的抗体对人肿瘤靶细胞的溶解。优选地，通过在存在补体的情况中用依照本发明的抗CD20抗体处理表达CD20的细胞的制备物来测量CDC。若抗体在浓度100nM时在4小时后诱导20%或更多的肿瘤细胞溶解（细胞死亡），则发现CDC。优选地，用经51Cr或Eu标记的肿瘤细胞及释放的51Cr或Eu测量来实施测定法。对照包括将肿瘤靶细胞与补体但不与抗体一起温育。
“利妥昔单抗”抗体（参照抗体；I型抗CD20抗体的例子）是一种针对人CD20抗原的含有人γ1鼠恒定域的遗传工程嵌合单克隆抗体。此嵌合抗体含有人γ1恒定域，并且在1998年4月17日公告的归于IDEC PharmaceuticalsCorporation的US5,736,137（Andersen等）中以名称“C2B8”鉴定。利妥昔单抗批准用于治疗复发性或顽固性低级或滤泡性、CD20阳性、B细胞非何杰金氏淋巴瘤患者。体外作用机制研究已经显示了利妥昔单抗展现出人补体依赖性细胞毒性(CDC)(Reff,M.E.等,Blood83(1994)435-445)。另外，它在测量抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测定法中展现出显著的活性。利妥昔单抗不是无岩藻糖基化的。
Figure BDA00002775548700131
术语“人源化B-Ly1抗体”指如WO2005/044859和WO2007/031875中所披露的人源化B-Ly1抗体，其通过用来自IgG1的人恒定域嵌合化及接着的人源化自鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1（鼠重链可变区(VH)：SEQ ID NO:1；鼠轻链可变区(VL)：SEQ ID NO:2（参见Poppema,S.和Visser,L.,Biotest Bulletin3(1987)131-139）获得（参见WO2005/044859和WO2007/031875）。这些“人源化B-Ly1抗体”详细披露于WO2005/044859和WO2007/031875中。
在一个实施方案中，“人源化B-Ly1抗体”具有选自下组的重链可变区(VH)：SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:20（WO2005/044859和WO2007/031875的B-HH2至B-HH9和B-HL8至B-HL17）。在一个具体的实施方案中，此类可变域选自下组：SEQ ID No.3、4、7、9、11、13和15（WO2005/044859和WO2007/031875的B-HH2、B-HH3、B-HH6、B-HH8、B-HL8、B-HL11和B-HL13）。在一个具体的实施方案中，“人源化B-Ly1抗体”具有轻链可变区(VL)SEQ ID No:20（WO2005/044859和WO2007/031875的B-KV1）。在一个具体的实施方案中，“人源化B-Ly1抗体”具有重链可变区(VH)SEQ ID No:7（WO2005/044859和WO2007/031875的B-HH6）和轻链可变区(VL)SEQ IDNo:20（WO2005/044859和WO2007/031875的B-KV1）。此外，在一个实施方案中，人源化B-Ly1抗体是IgG1抗体。依照本发明，依照记载于WO2005/044859、WO2004/065540、WO2007/031875、Umana,P.等,NatureBiotechnol.17(1999)176-180及WO99/154342中的规程在Fc区中糖工程化改造(GE)此类无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体。在一个实施方案中，无岩藻糖基化糖工程人源化B-Ly1是B-HH6-B-KV1GE。此类糖工程人源化B-Ly1抗体在Fc区中具有改变的糖基化样式，优选地具有降低的岩藻糖残基水平。在一个实施方案中，岩藻糖量占Asn297处的寡糖总量的60%或更少（在一个实施方案中，岩藻糖的量是40%至60％，在另一个实施方案中，岩藻糖的量是50%或更少，且在又一个实施方案中，岩藻糖的量是30%或更少。在另一个实施方案中，优选地，Fc区的寡糖是两分的。这些糖工程人源化B-Ly1抗体具有升高的ADCC。
如本文中使用的，术语“VEGF”指人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)，其记载于例如Leung,D.W.等,Science246(1989)1306-1309;Keck,P.J.等,Science246(1989)1309-1312及Connolly,D.T.等,J.Biol.Chem.264(1989)20017-20024。VEGF牵涉调节正常的和异常的血管发生及与肿瘤和眼内病症有关的新血管化(Ferrara,N.和Davis-Smyth,T.,Endocr.Rev.18(1997)4-25;Berkman,R.A.等,J.Clin.Invest.91(1993)153-159;Brown,L.F.等,Human Pathol.26(1995)86-91;Brown,L.F.等,Cancer Res.53(1993)4727-4735;Mattern,J.等,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934;及Dvorak,H.等,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是已经从数种来源分离的同二聚体糖蛋白。VEGF对内皮细胞显示高度特异的促有丝分裂活性。VEGF在胚胎血管生成期间在新血管形成中和在成年期间在血管发生中具有重要的调节功能(Carmeliet,P.等,Nature,380(1996)435-439;Ferrara,N.等,Nature,380(1996)439-442;综述见Ferrara,N.和Davis-Smyth,T.,Endocrine Rev.,18(1997)4-25)。已经在研究中证明了VEGF发挥的作用的意义，该研究显示了单个VEGF等位基因的失活由于不能形成血管系统(vasculature)而导致胚胎致死性(Carmeliet,P.等,Nature,380(1996)435-439;Ferrara,N.等,Nature,380(1996)439-442)。另外，VEGF对单核细胞具有强化学引诱物活性，能诱导内皮细胞中的血纤维蛋白溶酶原激活剂和血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂，而且还能诱导微血管通透性。由于后一种活性，它有时称为血管通透性因子(VPF)。已经综述了VEGF的分离和特性；见Ferrara,N.等,J.Cellular Biochem.,47(1991)211-218和Connolly，D.T.,J.Cellular Biochem.,47(1991)219-223。单个VEGF基因的mRNA可变剪接产生5种VEGF同等型。
依照本发明的术语“抗VEGF抗体”是特异性结合VEGF抗原的抗体。在一个实施方案中，抗VEGF抗体包括与由杂交瘤ATCC HB10709生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；依照Presta,L.G.等,Cancer Res.57(1997)4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为“贝伐单抗(BV)”（又称为“rhuMAb VEGF”或“AVASTIN”）的抗体。贝伐单抗包含突变的人IgGl框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区，所述鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1阻断人VEGF与其受体的结合。贝伐单抗约93%的氨基酸序列（包括大多数框架区）自人IgG1衍生，而约7%的序列自鼠抗体A4.6.1衍生。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，并且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。别的优选抗体包括G6或B20系列抗体（例如，G6-23、G6-31、B20-4.1），如记载于PCT申请公开文本No.WO2005/1012359的。关于别的优选抗体，见美国专利No.US7,060,269、US6,582,959、US6,703,020；US6,054,297；WO98/145332；WO96/130046；WO94/110202；EP0666868B1；美国专利申请公开文本No.US2006009360、US20050186208、US20030206899、US20030190317、US20030203409、和US20050112126；及Popkov.,M.等,Journal of ImmunologicalMethods288(2004)149-164。它们以结合人和鼠VEGF为特征；这是研究其在小鼠模型中对鼠muVEGF刺激的血管发生的效力的前提。依照本发明的“G6系列抗体”是自依照PCT申请公开文本No.WO2005/1012359的图7、24-26、和34-35之任一的G6抗体或G6衍生抗体序列衍生的抗VEGF抗体。依照本发明的“B20系列抗体”是自依照PCT申请公开文本No.WO2005/1012359的图27-29之任一的B20抗体或B20衍生抗体序列衍生的抗VEGF抗体。
寡糖组分可以显著影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性，包括物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫系统的相互作用、药动学、和特定(specific)生物学活性。此类特性可能不仅取决于寡糖的存在或缺乏，而且还取决于寡糖的特定结构。可以做出寡糖结构与糖蛋白功能间的一些概括。例如，某些寡糖结构经由与特定碳水化合物结合蛋白的相互作用而介导糖蛋白自血流的快速清除，而其它寡糖结构可以被抗体结合，并触发不想要的免疫反应(Jenkins,N.等,Nature Biotechnol.14(1996)975-981)。
由于哺乳动物细胞以对于人应用最相容的形式糖基化蛋白质的性能，它是用于生成治疗性糖蛋白的卓越的宿主(Cumming,D.A.等,Glycobiology1(1991)115-130;Jenkins,N.等,Nature Biotechnol.14(1996)975-981)。细菌糖基化蛋白质非常罕见，并且与其它类型的常见宿主，诸如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞一样，其产生与自血流快速清除、不想要的免疫相互作用、和（在一些特定的情况中）降低的生物学活性有关的糖基化样式。在哺乳动物细胞中，在过去二十年期间最常使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在给予合适的糖基化样式外，这些细胞容许遗传稳定的、高生产性克隆细胞系的一致生成。它们可以使用无血清培养基在简单的生物反应器中培养至高密度，并容许开发安全且可再现的生物工艺。其它通常使用的动物细胞包括幼仑鼠肾(BHK)细胞、NSO和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞。新近，还已经测试了自转基因动物的生成(Jenkins,N.等,Nature Biotechnol.14(1996)975-981)。
所有抗体在重链恒定区中的保守位置处都含有碳水化合物结构，其中每种同种型拥有独特的一批N连接的碳水化合物结构，其易变地影响蛋白质装配、分泌或功能性活性(Wright,A.和Morrison,S.L.,Trends Biotech.15(1997)26-32)。根据加工程度，附着的N连接的碳水化合物结构变化得相当大，并且可以包括高甘露糖的、多分支的及双触角的复合寡糖(Wright,A.和Morrison,S.L.,Trends Biotech.15(1997)26-32)。通常，存在着特定糖基化位点处附着的核心寡糖结构的异质加工，使得甚至单克隆抗体以多种糖形存在。同样地，已经显示了细胞系间存在抗体糖基化的主要差异，而且甚至对不同培养条件下培养的给定细胞系看到次要差异(Lifely，M.R.等,Glycobiology5(1995)813-822)。
一种在维持简单的生成过程并潜在地避免显著的、不想要的副作用的情况中获得效力大幅升高的方式是通过工程化改造单克隆抗体的寡糖组分来增强其天然的、细胞介导的效应器功能，如记载于Umana,P.等,NatureBiotechnol.17(1999)176-180及US6,602,684的。IgG1型抗体（即在癌症免疫疗法中最常使用的抗体）是在每个CH2域中的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。附着于Asn297的两个复合双触角寡糖掩埋于各CH2域间，与多肽主链形成广泛的接触，并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely,M.R.等,Glycobiology5(1995)813-822;Jefferis,R.等,Immunol.Rev.163(1998)59-76;Wright,A和Morrison,S.L.,Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。
先前显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶I11(“GnTII17y”)（一种催化两分型寡糖形成的糖基转移酶）在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高由工程化改造的CHO细胞生成的抗成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性（参见Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180；及WO99/154342，在此通过提及而收录其全部内容）。抗体chCE7属于具有高肿瘤亲和力和特异性，但是在缺乏GnTIII酶的标准工业细胞系中生产时具有太少的效力以致在临床上无用的一大类未缀合的单克隆抗体(Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180)。所述研究第一次显示了可以通过工程化改造抗体生成细胞以表达GnTIII来获得ADCC活性的大幅升高，其还导致恒定区(Fc)结合的两分型寡糖（包括两分型非岩藻糖基化寡糖）比例的增加，高于天然存在的抗体中找到的水平。
如本文中所使用的，术语“癌症”包括淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金(Hodgkin)氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌(biliary cancer)、中枢神经系统(CNS)赘生物、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形细胞瘤、神经鞘瘤(schwanoma)、室鼓膜瘤(ependymona)、髓母细胞瘤、脑脊膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式、或一种或多种上述癌症的组合。在一个实施方案中，术语癌症指表达CD20的癌症。
术语“表达CD20”抗原意图指示分别来自肿瘤或癌症，优选地非实体瘤的细胞中，优选地在T或B细胞，更优选地B细胞的细胞表面上的CD20抗原的显著水平的表达。可以通过本领域已知的标准测定法来确定具有“表达CD20的癌症”的患者。例如，可以使用免疫组织化学(IHC)检测、FACS或者经由相应mRNA的基于PCR的检测来测量CD20抗原表达。
如本文中所使用的，术语“表达CD20的癌症”指癌细胞显示CD20抗原表达的所有癌症。优选地，如本文中所使用的表达CD20的癌症指淋巴瘤（优选地B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)）和淋巴细胞性白血病。此类淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤、b)小无核裂细胞淋巴瘤(SmallNon-Cleaved Cell Lymphoma)/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤（包括地方性伯基特氏淋巴瘤、散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤）、c)边缘区淋巴瘤（包括结外边缘区B细胞淋巴瘤（粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT）、结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤）、d)套细胞淋巴瘤(MCL)、e)大细胞淋巴瘤（包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性混合细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤）、f)毛细胞白血病、g)淋巴细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦(waldenstrom)氏巨球蛋白血症、h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、i)浆细胞赘生物、浆细胞骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、j)何杰金氏病。
在一个实施方案中，表达CD20的癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。在另一个实施方案中，表达CD20的癌症是套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、边缘区淋巴瘤、移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、HIV有关的淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、或原发性CNS淋巴瘤。
术语“治疗方法”或其等同用语在应用于例如癌症时指设计为降低或消除患者中的癌细胞数目，或者减轻癌症症状的规程或作用过程。癌症或另一种增殖性病症的“治疗方法”不必意味着实际上会消除癌细胞或其它病症，实际上会降低细胞数目或病症，或实际上会减轻癌症或其它病症的症状。经常，甚至会实施具有较低的成功概率，但是然而鉴于医学史和估计的患者存活预期认为诱导总体有益的作用过程的治疗癌症的方法。
术语“共施用”指作为一种单一配制剂或者作为两种分开的配制剂施用所述无岩藻糖基化抗CD20和所述抗VEGF抗体。共施用可以是同时的或者以任意次序序贯的，其中优选地，存在着所有活性剂同时施加其生物学活性的时段。同时或序贯（例如经由静脉内(i.v.)经由连续输注；对于抗CD20抗体一次，及最终对于所述抗VEGF抗体一次）共施用所述无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述抗VEGF抗体。在序贯共施用这两种治疗剂时，在同一天在两次分开的施用中施用剂量，或者在第1天施用药剂之一，而在第2天至第7天，优选地在第2天至第4天共施用第二种。如此，术语“序贯地”意指在第一组分（抗CD20抗体或抗VEGF抗体）的剂量后7天内，优选地在第一组分的剂量后4天内；而术语“同时地”意指同一时间。术语“共施用”就所述无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述抗VEGF抗体的维持剂量而言意指若治疗周期对于这两种药物都是合适的，例如每周，则可以同时共施用维持剂量。或者，例如，例如每第一至第三天施用所述抗VEGF抗体，而每周施用所述无岩藻糖基化抗体。或者，在一天内或在几天内序贯共施用维持剂量。
不证自明的是，以“治疗有效量”（或仅为“有效量”）对患者施用抗体，所述治疗有效量是相应化合物或组合会引发研究人员、兽医、医学医生或其它临床医生寻找的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的量。
所述无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述抗VEGF抗体的共施用量和共施用时机会取决于所治疗患者的类型（物种、性别、年龄、重量、等）和状况和所治疗疾病或状况的严重性。可以一次或在一系列治疗里，例如在同一天或在次日对患者适当地共施用所述无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述抗VEGF抗体。
若施用是静脉内的，则所述无岩藻糖基化抗CD20抗体或所述抗VEGF抗体的初始输注时间可以比随后的输注时间长，例如初始输注为约90分钟，而随后的输注为约30分钟（若初始输注耐受良好的话）。
根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至50mg/kg（例如0.1-20mg/kg）所述无岩藻糖基化抗CD20抗体和1μg/kg至50mg/kg（例如0.1-20mg/kg）所述抗VEGF抗体是对患者共施用这两种药物的初始候选剂量。在一个实施方案中，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体（优选地无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体）的优选剂量会在约0.05mg/kg至约30mg/kg的范围中。如此，可以对患者共施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg或30mg/kg（或其任何组合）的一剂或多剂。在一个实施方案中，所述抗VEGF抗体（优选地，贝伐单抗）的优选剂量的范围会是约0.05mg/kg至约30mg/kg。如此，可以对患者共施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg或30mg/kg（或其任何组合）。
根据患者的类型（物种、性别、年龄、重量、等）和状况及无岩藻糖基化抗CD20抗体的类型，所述无岩藻糖基化抗体的剂量和施用日程表可以与所述抗VEGF抗体不同。例如，可以例如每1至3周施用所述无岩藻糖基化抗CD20抗体，并且可以每天或每2至10天施用所述抗VEGF抗体。也可以施用较高的初始加载剂量，接着是较低的一剂或多剂。
在一个实施方案中，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体（优选地，无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体）的优选剂量会是一个3至6周剂量周期的第1天、第8天、第15天的800至1200mg，然后剂量是多至8个3至4周剂量周期的第1天的800至1200mg。在一个实施方案中，贝伐单抗的优选剂量是5mg/kg至15mg/kg，优选地，5mg/kg至10mg/kg，且更优选地，5mg/kg（每14天一次以iv输注）。在治疗乳腺、脑（成胶质细胞瘤）或肾（肾细胞）癌中推荐的贝伐单抗剂量是每4天通过iv输注对每kg给予10mg。推荐剂量会随是否存在有别的共施用化疗剂及基于化疗剂的类型而变化（每kg为5或10mg）（例如，在R-CHOP的情况中每周为5mg/kg贝伐单抗，或者对于周期1，第1天15mg/kg贝伐单抗，接着是第2天R-CHOP；以及周期2-8第1天R-CHOP（以可能的施用方式））。
或者，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体的优选剂量可以是多至8个3周剂量周期第1天的800至1200mg（优选地，1000mg）。贝伐单抗的优选剂量是5mg/kg至15mg/kg，优选地，5mg/kg至10mg/kg，且更优选地，5mg/kg（每14天一次以iv输注）。
在一个实施方案中，药物可用于预防或降低患有癌症，优选地表达CD20的癌症的此类患者中的转移或进一步散布。药物可用于延长此类患者的存活持续时间，延长此类患者的无进展存活，延长响应的持续时间，导致经治疗的患者的统计学显著的且临床上有意义的改善，如通过存活的持续时间、无进展存活、响应率或响应的持续时间所测量的。在一个优选的实施方案中，药物可用于提高患者组中的响应率。
在本发明的上下文中，可以在无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述抗VEGF抗体的癌症联合治疗中使用额外的其它细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或增强此类药剂的效果的化合物（例如细胞因子）。合适地，此类分子以对于意图的目的有效的量组合存在。在一个实施方案中，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述抗VEGF抗体联合治疗不与所述额外的细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或增强此类药剂的效果的化合物一起使用。
此类药剂包括例如：烷化剂或具有烷基化作用的药剂，诸如环磷酰胺(cyclophosphamide)（CTX；例如
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）、苯丁酸氮芥(chlorambucil)（CHL；例如瘤可宁
Figure BDA00002775548700212
）、顺铂(cisplatin)（CisP；例如）、白消安(busulfan)（例如，马利兰
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）、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、链脲菌素(streptozotocin)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)(TEM)、丝裂霉素C(mitomycin C)，等等；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(MTX)、依托泊苷(etoposide)（VP16；例如凡毕士
Figure BDA00002775548700215
）、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6-thiocguanine)(6TG)、阿糖胞苷(cytarabine)(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)（例如，希罗达
Figure BDA00002775548700216
）、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)，等等；抗生素，诸如放线菌素D(actinomycin D)、多柔比星(doxorubicin)（DXR；例如阿霉素
Figure BDA00002775548700217
）、柔红霉素(daunorubicin)（道诺霉素(daunomycin)）、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)，等等；生物碱，诸如长春花生物碱诸如长春新碱(vincristine)(VCR)、长春碱(vinblastine)，等等；及其它抗肿瘤剂，诸如帕西他赛(paclitaxel)（例如泰素）和帕西他赛衍生物、细胞抑制剂、糖皮质激素诸如地塞米松(dexamethasone)（DEX；例如地卡特隆
Figure BDA00002775548700219
）和皮质类固醇诸如泼尼松(prednisone)、核苷酶抑制剂诸如羟基脲、氨基酸消减酶(amino acid depleting enzyme)诸如天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸(leucovorin)和其它叶酸衍生物、和相似的多种多样的抗肿瘤剂。也可以使用下列药剂作为额外的药剂：氨磷汀(arnifostine)（例如
Figure BDA000027755487002110
）、更生霉素(dactinomycin)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)（氮芥）、链佐星(streptozocin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、多柔比星脂质体(doxorubicin lipo)（例如，
Figure BDA000027755487002111
）、吉西他滨(gemcitabine)（例如健择
Figure BDA000027755487002112
）、柔红霉素脂质体(daunorubicin lipo)（例如
Figure BDA000027755487002113
）、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素(mitomycin)、多西他赛(docetaxel)（例如泰索帝
Figure BDA000027755487002114
）、阿地白介素(aldesleukin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、克拉屈滨(cladribine)、喜树碱(camptothecin)、CPT11（伊立替康(irinotecan)）、10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊达比星(idarubicin)、美司钠(mesna)、干扰素β、干扰素α、米托蒽醌(mitoxantrone)、托泊替康(topotecan)、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤、普卡霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酪(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶芥(uracilmustard)、长春瑞滨(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)。在一个实施方案中，无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述抗VEGF抗体联合治疗不与此类额外的药剂一起使用。
上文所描述的细胞毒剂和抗癌剂及抗增殖性靶物特异性抗癌药物，如蛋白质激酶抑制剂在化学疗法方案中的使用一般在癌症疗法领域中得到充分表征，并且其在本文中的使用归入关于监测耐受性和效力及关于控制施用路径和剂量的相同考虑，伴有一些调整。例如，细胞毒剂的实际剂量可以随通过使用组织培养方法测定的患者的培养细胞应答而变化。一般地，与在没有额外的其它药剂的情况中使用的量相比，剂量会是降低的。
有效细胞毒剂的典型剂量可以在制造商推荐的范围中，并且在通过体外应答或动物模型中的应答指示的情况中，可以降低多至约一个数量级的浓度或量。如此，实际剂量会取决于内科医生的判断、患者的状况、和治疗方法的效力，其基于原代培养的恶性细胞或组织培养组织样品的体外响应性，或合适的动物模型中观察到的响应。
在本发明的上下文中，在表达CD20的癌症的无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述抗VEGF抗体联合治疗外，可以实施有效量的电离辐射和/或可以使用放射性药物。放射源可以是在所治疗的患者外部或内部。在来源在患者外部时，疗法称为外部束放射疗法(EBRT)。在放射源在患者内部时，治疗称作近程疗法(BT)。本发明的上下文中使用的放射性原子可以选自下组，包括但不限于镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131、和碘-111。也有可能用此类放射性同位素标记抗体。在一个实施方案中，无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述抗VEGF抗体联合治疗不与此类电离辐射一起使用。
放射疗法是一种用于控制不可切除的或不能手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗。已经在组合放射疗法与化学疗法时看到改善的结果。放射疗法基于如下的原则，即对靶区域投递的高剂量放射会导致肿瘤和正常组织两者中的生殖细胞(reproductive cell)死亡。放射剂量方案一般在放射吸收剂量(Gy)、时间和分级方面限定，并且必须由肿瘤学家小心限定。患者接受的放射量会取决于各种考虑因素，但是两项最重要的是肿瘤相对于身体的其它重要结构或器官的位置和肿瘤已经扩散的程度。经历放射疗法的患者的一种典型治疗过程会是在1至6周时段里的治疗日程表，以单一每日分数约1.8至2.0Gy一周5天对患者施用10-80Gy的总剂量。在本发明的一个优选的实施方案中，在用本发明的联合治疗和放射治疗人患者中的肿瘤时存在着协同。换言之，在与放射组合时（任选地有额外的化学治疗剂或抗癌剂），依靠构成本发明组合的药剂对肿瘤生长的抑制得到增强。例如，辅助放射疗法的参数包含在WO99/60023中。
依照已知的方法通过静脉内施用（以推注或者通过在一段时间里连续输注），通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、或鞘内路径对患者施用无岩藻糖基化抗CD20抗体。在一个实施方案中，静脉内或皮下施用抗体。
依照已知的方法通过静脉内施用（以推注或者通过在一段时间里连续输注），通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、或鞘内路径对患者施用抗VEGF抗体。在一个实施方案中，静脉内或皮下施用抗体。
如本文中所使用的，“药学可接受载体”意图包括与药学施用相容的任何和所有材料，包括溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、和与药学施用相容的其它材料和化合物。除非任何常规的介质或药剂与活性化合物不相容，涵盖其在本发明的组合物中的使用。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
药物组合物：
可以通过用药学可接受的无机或有机载体加工依照本发明的抗CD20抗体和/或抗VEGF抗体来获得药物组合物。可以使用乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等，例如用于片剂、包衣片剂、锭剂和硬明胶胶囊的此类载体。适合于软明胶胶囊的载体是例如植物油、蜡、脂肪、半固体和液体多元醇等。然而，根据活性物质的性质，通常在软明胶胶囊的情况中不需要载体。适合于生成溶液和糖浆剂的载体是例如水、多元醇、甘油、植物油等。适合于栓剂的载体是例如天然的或硬化的油、蜡、脂肪、半液体或液体多元醇等。
此外，药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、增甜剂、着色剂、香料、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂或抗氧化剂。它们也可以含有其它治疗上有价值的物质。
在本发明的一个实施方案中，组合物包含具有60%或更小的岩藻糖量的所述无岩藻糖基化抗CD20抗体（优选地，所述无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体）和所述抗VEGF抗体两者，其在治疗癌症，特别是表达CD20的癌症（例如，B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)）中使用。
所述药物组合物可以进一步包含一种或多种药学可接受载体。
本发明进一步提供了例如在癌症中使用的药物组合物，其包含(i)第一有效量的具有60%或更小的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体（优选地，无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体），和(ii)第二有效量的抗VEGF抗体。任选地，此类组合物包含药学可接受载体和/或赋形剂。
通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水溶液形式制备依照本发明使用的仅无岩藻糖基化抗CD20抗体的药物组合物，供贮存。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所采用的剂量和浓度对于接受者无毒，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（小于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子诸如钠；金属复合物（例如，Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
抗VEGF抗体的药物组合物可以与上文对无岩藻糖基化抗CD20抗体描述的药物组合物类似。
在本发明的又一个实施方案中，将无岩藻糖基化抗CD20抗体和抗VEGF抗体以两种分开的药物组合物配制。
活性成分还可以包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊），在胶状药物投递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊），或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington’sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯(US3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
要用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这容易通过过滤流过无菌滤膜来实现。
一个实施方案是用于治疗癌症的组合物，其包含具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体和贝伐单抗或B20系列抗体。
本发明进一步提供了一种用于治疗癌症的方法，包括对需要此类治疗的患者施用(i)第一有效量的具有60%或更小的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体（优选地，无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体），和(ii)第二有效量的抗VEGF抗体。
在一个实施方案中，岩藻糖量是40%至60%。
优选地，所述癌症是表达CD20的癌症。
优选地，所述表达CD20的癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
优选地，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体是II型抗CD20抗体。
优选地，所述抗体是人源化B-Ly1抗体。
优选地，所述抗VEGF抗体是贝伐单抗、B20系列抗体或G6系列抗体，更优选地，B20系列抗体，更优选地，贝伐单抗。
优选地，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体，并且所述抗VEGF抗体是贝伐单抗、B20系列抗体或G6系列抗体，而所述癌症是表达CD20的癌症，优选地，B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
如本文中所使用的，术语“患者”优选地指出于任何目的需要用无岩藻糖基化抗CD20抗体治疗的人（例如，患有表达CD20的癌症的患者），且更优选地需要此类治疗以治疗癌症、或癌前状况或损伤的人。然而，术语“患者”也可以指非人动物，优选地哺乳动物诸如犬、猫、马、牛、猪、绵羊和非人灵长类，等等。
本发明进一步包括与抗VEGF抗体联合治疗癌症的具有60%或更小的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体。
本发明进一步包括在治疗癌症中使用的具有60%或更小的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体和抗VEGF抗体。
优选地，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体。
优选地，所述抗VEGF抗体是贝伐单抗、B20系列抗体或G6系列抗体，更优选地，B20系列抗体，更优选地，贝伐单抗。
优选地，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体，并且所述抗VEGF抗体是贝伐单抗、B20系列抗体或G6系列抗体，而所述癌症是表达CD20的癌症，优选地，B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
提供以下实施例和图以帮助理解本发明，其真正的范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明精神的前提下对列出的规程做出修改。
Figure BDA00002775548700261
实验规程
在小鼠异种移植物中无岩藻糖基化抗CD20抗体与抗VEGF抗体B20-4.1的联合处理的抗肿瘤活性
测试剂：
无岩藻糖基化抗CD20抗体B-HH6-B-KV1GE（=人源化B-Ly1，糖工程化B-HH6-B-KV1=GA101；见WO2005/044859和WO2007/031875）和B20-4.1自GlycArt,Schlieren,Switzerland提供。抗体缓冲液包括组氨酸、海藻糖和聚山梨酯20。自储液将抗体溶液在PBS中适当稀释，用于在先注射。
因为贝伐单抗不是小鼠交叉反应性的(Fuh,G.等,J.Biol.Chem.281(2006)6625-631)，所以取而代之使用B20-4.1抗体作为抗VEGF抗体（作为为贝伐单抗建立的替代抗体）来显示无岩藻糖基化抗CD20抗体（具有低于60%的岩藻糖量)B-HH6-B-KV1GE（=人源化B-Ly1，糖工程化B-HH6-B-KV1=GA101）与抗VEGF抗体在肿瘤生长抑制方面的协同效果。
细胞系和培养条件
购买SU-DHL-4人淋巴瘤细胞系和培养基，并且由Oncodesign提供。
细胞系 类型 起源 来源
SU-DHL-4 淋巴瘤 人 DSMZ*
*德国微生物和培养物保藏中心
将肿瘤细胞以悬浮液于37°C在增湿的气氛（5%CO2,95%空气）中培养。培养基是含有2mM L-谷氨酰胺(目录号BE12-702F，批号8MB0056,Lonza,Verviers,Belgium)并补充有10%胎牛血清(目录号3302,批号P282005,Lonza)的RPMI1640。在血球计中对细胞计数，并通过0.25%锥虫蓝排斥评估其存活力。
动物
雌性CB17SCID米色小鼠（5-6周龄并且重量为16-20g）购自Charles River(L’Arbresle,France)。在处理前在我们的无特定病原体(SPF)动物护理单元中对动物观察7天。
动物护理单元得到法国农业和研究部授权（协议No A21231011）。依照动物实验伦理准则(1)和英国实验性新生物形成动物福利准则(2)实施动物实验。
在SCID米色小鼠中诱导SC SU-DHL-4肿瘤
将100μl具有基质胶的PBS(50:50,BD Biosciences,France)中的1000万(107)个SU-DHL-4肿瘤细胞皮下(SC)注射入52只雌性SCID米色小鼠的右体侧中。
监测
使用Vivo软件(Biosystemes,Dijon,France)来管理所有研究数据，包括动物体重测量、肿瘤体积、临床和死亡率记录、和药物处理管理。
使用异氟烷Forene(Minerve,Bondoufle,France)来麻醉动物，之后SC接种肿瘤细胞，IV注射化合物，并处死。每天记录死亡率、临床体征和行为。一周两次监测并记录动物体重和肿瘤体积。
动物的处理
在肿瘤达到均值体积172±95mm3时，将52只携带肿瘤的裸鼠中的40只在4个10只小鼠的组中分配。如下选择处理日程表：
来自组1的小鼠接受一周一次IV推注媒介物达连续4周(Q7Dx4)。
来自组2的小鼠接受以3mg/kg/inj一周一次IV推注抗CD20抗体B-HH6-B-KV1GE达连续4周(Q7Dx4)。
来自组3的小鼠接受以10mg/kg/inj一周一次IV推注B20-4.1达连续4周(Q7Dx4)。
来自组4的小鼠接受与以10mg/kg/inj一周一次IV推注B20-4.1(Q7Dx4)组合的以3mg/kg/inj一周一次推注抗CD20抗体B-HH6-B-KV1GE(Q7Dx4)。
体内肿瘤生长抑制研究
检查单独的和与B20-4.1组合的抗CD20抗体B-HH6-B-KV1GE（=人源化B-Ly1，糖工程化B-HH6-B-KV1=GA101）的抗肿瘤效力。使用以单一药剂注射的B20-4.1作为参照化合物。作为单一药剂，3mg/kg次佳剂量的抗CD20抗体B-HH6-B-KV1GE或10mg/kg的B20-4.1导致中等的肿瘤生长抑制。与单独的任一种药剂相比，抗CD20抗体B-HH6-B-KV1GE加B20-4.1的联合处理改善体内抗肿瘤活性。用3mg/kg抗CD20抗体B-HH6-B-KV1GE加10mg/kgB20-4.1处理的组中的9只受试者变得无肿瘤。一致地，肿瘤生长在联合处理组中比在单一药剂组中慢。由于联合处理组中显著的抗肿瘤活性，不可能计算肿瘤生长延迟和肿瘤倍增时间值。在肿瘤细胞注射后第46天，处理组与媒介物组相比的T/C(%)值在抗CD20抗体B-HH6-B-KV1GE、B20-4.1和这两者的组合的情况中分别是51、33和4。
Figure IDA00002775549300011
Figure IDA00002775549300021
Figure IDA00002775549300031
Figure IDA00002775549300051
Figure IDA00002775549300061
Figure IDA00002775549300081
Figure IDA00002775549300091
Figure IDA00002775549300101
Figure IDA00002775549300111

Claims (15)

1.具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体用于制造与抗VEGF抗体联合治疗癌症的药物的用途。
2.依照权利要求1的用途，其特征在于所述癌症是表达CD20的癌症。
3.依照权利要求1至2中任一项的用途，其特征在于所述表达CD20的癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
4.依照权利要求1至3中任一项的用途，其特征在于所述抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体。
5.依照权利要求1至4中任一项的用途，其特征在于所述抗VEGF抗体是贝伐单抗(bevacizumab)、B20系列抗体或G6系列抗体。
6.依照权利要求1至3中任一项的用途，其特征在于所述抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体，而所述抗VEGF抗体是贝伐单抗或B20系列抗体。
7.依照权利要求1至6中任一项的用途，其特征在于施用一种或多种额外的其它细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或增强此类药剂效果的化合物或电离辐射。
8.一种用于治疗癌症的组合物，其包含具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体，且包含贝伐单抗或B20系列抗体。
9.一种治疗患有癌症的患者的方法，其通过与抗VEGF抗体组合对需要此类治疗的患者施用具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体来进行。
10.依照权利要求9的方法，其特征在于所述癌症是表达CD20的癌症。
11.依照权利要求9至10中任一项的方法，其特征在于所述表达CD20的癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
12.依照权利要求9至11中任一项的方法，其特征在于所述抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体。
13.依照权利要求9至12中任一项的方法，其特征在于所述抗VEGF抗体是贝伐单抗、B20系列抗体或G6系列抗体。
14.依照权利要求9至13中任一项的方法，其特征在于所述抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体，而所述抗VEGF抗体是贝伐单抗或B20系列抗体。
15.依照权利要求9至14中任一项的方法，其特征在于施用一种或多种额外的其它细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或增强此类药剂效果的化合物或电离辐射。
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