CN103096885B - 不饱和脂肪酸用于抑制病毒复制和/或感染的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了不饱和脂肪酸芥酸和亚油酸或其可药用盐或酯用于抑制丙型肝炎病毒复制或者预防和/或治疗丙型肝炎病毒感染的用途。
Description
技术领域
本发明涉及不饱和脂肪酸用于抑制病毒复制或者预防和/或治疗病毒感染的用途，更具体而言，本发明涉及不饱和脂肪酸用于抑制肝炎病毒（特别是丙型肝炎病毒）复制或者预防和/或治疗肝炎病毒（特别是丙型肝炎病毒）感染的用途。
背景技术
病毒感染是一种常见的疾病，严重影响人们的健康。病毒性肝炎是由肝炎病毒感染所引起的，是世界上流传广泛，危害很大的传染病之一。按照其病毒系列主要分为甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、己型和庚型病毒性肝炎7种。在病毒性肝炎中，丙型病毒性肝炎对人类的危险仅次于乙型病毒性肝炎。自1989年医学界发现丙型肝炎病毒以来，全球已经有1.7亿人受到感染，我国一般人群中丙型肝炎的感染率为3.2%。据临床研究发现，急性丙型肝炎感染后约50%-70%可转为慢性，20%的人最终发展为肝硬化或肝癌，且其演变为肝癌的速度较乙肝病毒来得快。因此，丙型肝炎病毒感染对人的危害性也很大。
目前，治疗丙型肝炎的药物主要有以下几种：（1）抑制病毒复制（抗病毒）的药物；（2）免疫调节剂；（3）保肝药物。免疫调节剂和保肝药物起到辅助治疗作用，但不能从根本上治疗丙型肝炎。在抗病毒药物中，干扰素是治疗丙型肝炎的较理想药物，有效率可达60%-70%。但是干扰素不能口服给药，治疗费用较高，并且引起严重的副作用，比如抑郁症、甲状腺机能障碍、诱发自身免疫病、间质性肺炎、眼疾患和心血管疾病等，这大大限制了其广泛应用。也可使用其它抗病毒药物，比如阿糖腺苷、阿昔洛韦等，这些药物的临床疗效不确定或副作用大，还不能广泛应用。因此，仍然迫切需要开发新的有效的抗丙型肝炎病毒的药物。
不饱和脂肪酸具有多种功能，包括预防肥胖（PaniaguaJA，etal.DiabetesCare2007，30:1717-23）、调节脂蛋白的代谢作用（ZhengCY，etal.AmericanJournalofClinicalNutrition2008，88(2):272-81）、抗炎（SongC，etal.Stress，2004，7(1):43）、抗心血管疾病（TerésS，etal.ProcNatlAcadSciUSA2008，105(37):13811-13816；BucherHC，etal.AmJMed，2002，112(4)：298）、抗精神病（NemetsB，etal.AmJPsychiatry，2002，159(3)：477；PerM，etal.SchizophrRes，2001，49(3)：243）、抗糖尿病（MinamiA，etal.BrJNutr，2002，87:157）和抗癌（ValeriaPala，etal.JournaloftheNationalCancerInstitute2001，93(14):1088-1095；NovakTE，etal.AmJPhysiol，2003，284:L84）等作用。但是，对不饱和脂肪酸的抗病毒作用的报道甚少。
板蓝根是一种常用中药，已知其能够用于预防和/或治疗病毒感染，例如在2003年急性呼吸窘迫综合症（SARS）在中国和全世界流行期间，板蓝根被大量用于SARS的预防和治疗。然而迄今为止尚未鉴定出板蓝根中起抗病毒作用的活性成分。经过大量研究，发明人意外地发现，板蓝根至少可以通过不饱和脂肪酸来发挥其抗病毒作用；具体来说，所述不饱和脂肪酸包括单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸；更具体来说，所述单不饱和脂肪酸包括芥酸，所述多不饱和脂肪酸包括亚油烯酸（即亚麻酸）。
发明内容
本发明的一个目的在于提供不饱和脂肪酸或其可药用盐或酯用于抑制病毒复制的用途。
本发明的另一个目的在于提供不饱和脂肪酸或其可药用盐或酯在制备用于预防或治疗病毒感染的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸为单不饱和脂肪酸。
在另一个实施方案中，所述单不饱和脂肪酸含有12至32个碳原子。
在又一个实施方案中，所述单不饱和脂肪酸为芥酸：
芥酸
在一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸为多不饱和脂肪酸。
在另一个实施方案中，所述多不饱和脂肪酸含有12至32个碳原子。
在又一个实施方案中，所述多不饱和脂肪酸为亚油烯酸：
亚油烯酸
在又一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸为单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的组合。所述单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸可同时、依次或分开施用。
在一个实施方案中，所述病毒选自肝炎病毒、肠道病毒、呼吸道病毒、腺病毒、人类疱疹病毒、人乳头瘤病毒等。
在一个优选实施方案中，所述病毒为肝炎病毒。
在一个进一步优选的实施方案中，所述肝炎病毒选自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒或庚型肝炎病毒。
在一个更优选的实施方案中，所述肝炎病毒为丙型肝炎病毒。
本发明的另一个目的在于提供一种预防或治疗病毒感染的方法，其包括向有此需求的对象施用预防或治疗有效量的不饱和脂肪酸或其可药用盐或酯。
在一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸为单不饱和脂肪酸。
在另一个实施方案中，所述单不饱和脂肪酸含有12至32个碳原子。
在又一个实施方案中，所述单不饱和脂肪酸为芥酸：
芥酸
在一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸为多不饱和脂肪酸。
在另一个实施方案中，所述多不饱和脂肪酸含有12至32个碳原子。
在又一个实施方案中，所述多不饱和脂肪酸为亚油烯酸：
亚油烯酸
在又一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸为单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的组合。所述单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸可同时、依次或分开施用。
在一个实施方案中，所述病毒选自肝炎病毒、肠道病毒、呼吸道病毒、腺病毒、人类疱疹病毒、人乳头瘤病毒等。
在一个优选的实施方案中，所述病毒为肝炎病毒。
在一个进一步优选的实施方案中，所述肝炎病毒选自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒或庚型肝炎病毒。
在一个更优选的实施方案中，所述肝炎病毒为丙型肝炎病毒。
本发明的又一个目的在于提供包含不饱和脂肪酸或其可药用盐或酯的药物组合物。所述药物组合物包含预防或治疗有效量的不饱和脂肪酸或其可药用盐或酯以及任选地可药用载体。
在一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸为单不饱和脂肪酸。
在另一个实施方案中，所述单不饱和脂肪酸含有12至32个碳原子。
在又一个实施方案中，所述单不饱和脂肪酸为芥酸：
芥酸
在一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸为多不饱和脂肪酸。
在另一个实施方案中，所述多不饱和脂肪酸含有12至32个碳原子。
在又一个实施方案中，所述多不饱和脂肪酸为亚油烯酸：
亚油烯酸
在又一个实施方案中，所述不饱和脂肪酸为单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的组合。所述单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸可同时、依次或分开施用。
具体实施方式
根据本发明，所述“不饱和脂肪酸”指包含至少一个碳碳双键的脂肪酸。应当理解的是，所述不饱和脂肪酸包括非对映异构体、对映异构体、互变异构体和几何异构体，所述几何异构体表示为“E”或“Z”构型异构体或E和Z异构体混合物。根据双键个数的不同，不饱和脂肪酸分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。单不饱和脂肪酸（monounsaturatedfattyacid，MUFA）指含有一个碳碳双键的脂肪酸，多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid，PUFA）指含有两个或两个以上碳碳双键的脂肪酸。
根据本发明，所述不饱和脂肪酸可以是单不饱和脂肪酸。
根据本发明，所述单不饱和脂肪酸可以是含有12至32个碳原子、优选含有18至22个碳原子、更优选含有18或22个碳原子的单不饱和脂肪酸，最优选芥酸（即顺式-13-二十二碳烯酸）：
芥酸
可通过本领域公知的任何方法制备芥酸，例如从板蓝根、菜油、海甘蓝油、芥子油中提取，也可从提取物或化合物制备商处商购。
根据本发明，所述不饱和脂肪酸也可以是多不饱和脂肪酸。
根据本发明，所述多不饱和脂肪酸可以是含有12至32个碳原子、优选含有18至22个碳原子、更优选含有18或22个碳原子的多不饱和脂肪酸，最优选亚油烯酸（即9，12，15-十八碳三烯酸，或称为亚麻酸）：
亚油烯酸
可通过本领域公知的任何方法制备亚油烯酸，例如从植物或植物提取物（如板蓝根或亚麻籽油中）提取，或者，也可从供应商（例如Sigma-Aldrich）处购得。
根据本发明，所述不饱和脂肪酸可以为单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的组合。所述单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸可同时、依次或分开施用。其中对于所述同时施用而言，以方便施用和剂量均一的单一剂型配制所述药物组合物是特别有利的。所述单一剂型指适于作为单一剂量的物理上分开的单位，每个单位含有预定量的活性成分，以与任选所需的药物载体一起产生所期望的疗效。这样的单位剂型的实例是片剂、胶囊、丸剂、粉末、栓剂、注射溶液或混悬液等。
根据本发明，所述病毒可选自肝炎病毒、肠道病毒、呼吸道病毒、腺病毒、人类疱疹病毒、人乳头瘤病毒。
根据本发明，所述肝炎病毒可选自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒或庚型肝炎病毒，优选为丙型肝炎病毒。
根据本发明，所述对象包括哺乳动物，尤其是人。
所述化合物的“可药用盐”是这样的盐，其适用于接触人或动物的组织而没有过度的毒性或致癌性，优选没有刺激、过敏反应或其它问题或并发症。这些盐包括可药用的酸加成盐和碱加成盐。合适的可药用酸加成盐可通过与无机酸或有机酸反应来制备。合适的无机酸的实例包括盐酸、硫酸和磷酸等。合适的有机酸的实例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、丁香酸等。合适的可药用碱加成盐包括由锂、钠、钾、镁、钙、铝和锌制备的金属盐等。可药用盐的其它信息可见于Remington'sPharmaceuticalSciences，第19版，MackPublishingCo.，Easton，PA1995。
本发明的化合物以预防或治疗有效量施用。预防或治疗有效量指至少部分实现所期望作用、或延缓所治疗具体病症的发作、抑制其发展、或者完全终止其发作或发展所必需的量。施用剂量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化，这些因素是本领域技术人员众所周知的，并且仅通过常规实验就可确定。
本发明的药物组合物可通过任何已知的方法制备。各组分可以用常规方法简单混合。根据本发明，可任选地添加可药用载体。所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等。
本发明的药物组合物可按照各种制剂类型的常规方法使用。根据本发明，所述药物组合物可以配制成任何合适的形式，包括但不限于片剂、胶囊剂、丸剂、粉末、混悬剂、颗粒、喷雾剂、气雾剂、滴丸剂、口服液、注射剂、茶剂。根据本发明，所述药物组合物可以任意合适的途径施用，包括但不限于用于口服、注射、经直肠、胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内等。
为了更好地理解本发明，下面将以芥酸和亚油烯酸为例对本发明作进一步说明。
实施例
发明人已经发现，亚油烯酸和芥酸是板蓝根的有效成分。利用HCV复制子细胞模型，研究了芥酸和亚油烯酸对HCV复制子的体外抑制作用。
材料与方法
1、材料
1.1研究药物亚油烯酸和芥酸，购自SIGMA公司。
1.2HCV复制子细胞模型该细胞模型是用合成的HCV亚基因组复制子转染人肝癌细胞株Huh-7并通过用含G418的培养基培养而获得的克隆，这些克隆可持续表达复制子RNA，参考文献[1]。本研究使用的细胞株由美国ATCC公司提供，细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM中。
1.3主要试剂荧光定量PCR检测试剂盒(TAKARA)，细胞计数试剂盒CCK-8(Dojindo)，SYBRGreenI，Calibration(BIO-RAD)，PCR引物由美国ATCC公司提供。
1.4主要仪器酶标仪(BIO-RADBenchmark)，荧光定量PCR仪(BIO-RAD)，电泳系统(Hoefer)，台式离心机(SORVALLpico)。
2实验方法
2.1细胞毒性实验取长满的Replicon细胞1瓶，加0.25%胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液。细胞计数，并调整浓度为1×105细胞/mL，接种96孔板(100μL/孔)。细胞于37℃、5%CO2培养过夜，次日弃去培养上清液，依次加入含有药物（芥酸、亚油烯酸）的完全培养基，药物最高浓度为20μM，按10倍进行稀释，共5个浓度，每浓度7孔。同时设正常细胞对照作为阴性对照，重组人干扰素对照（rIFNa-2b，浓度为2IU/ml）作为阳性药对照，每种浓度设7个复孔。药物作用72h后收集细胞，MTT法测定细胞的存活率。抑制率(IC)的计算方法：IC=1-(A药物处理组/A阴性对照组)×100%（结果见表1）。
2.2HCV复制子细胞模型的建立：含HCV-(1b)复制子cDNA质粒pNNeo/3-5BRG经XBalⅠ酶切线性化后，经酚/氯仿抽提后，用MegainVitroT7TranscriptKit进行体外转录成HCV复制子RNA，再经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收后，用脂质体(lipofectin)转染Huh7细胞，经G418筛选(500μg/mlDMEM)，约经2～3周后，有耐G418的细胞克隆形成，将其发展成细胞株，由于HCV复制子RNA结构中重组有Neo基因，因此能表达抗G418的酶，故含有HCV复制子的细胞能够在含G418的培养基中生长。
2.3Trizol法提取HCVRNA，参考文献[2]，提取细胞HCVRNA。荧光定量PCR反应检测HCVRNA拷贝数，与对照组比较，计算抑制率(IC)和半数有效剂量(EC50)。IC=1-(给药组拷贝数/阴性对照组拷贝数)×100%；
EC50使用Logit法计算（结果见表2）。
2.4荧光定量PCR反应检测HCVRNA[2]。
参考文献
[1]巨立中,成军,钟彦伟.丙型肝炎病毒复制模型系统[J].世界华人消化杂志,2003,11(12):1954-1956.
[2]王健,赵金红,江水清,等.慢性乙肝患者CXC趋化因子IP-10的表达[J].中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(12):1049-1050.
3结果
3.1药物的细胞毒性作用芥酸、亚油烯酸在最高浓度20μM时细胞毒性分别为100.8%、107%，而对照药物重组人干扰素rIFNa-2b在浓度2IU/ml时，细胞毒性为95.3%。
3.2药物对HCV的抑制作用芥酸、亚油烯酸对HCV复制子RNA具有抑制作用。芥酸20μM可导致74.6%HCVRNA减少，亚油烯酸20μM可导致93.7%HCVRNA减少，对照药物重组人干扰素rIFNa-2b在浓度2IU/ml时可导致95.3%HCVRNA减少。结果见表1。芥酸、亚油烯酸对HCVRNA的抑制程度与芥酸、亚油烯酸剂量相关，见表2。
表1：芥酸和亚油烯酸对丙型肝炎病毒复制子的抑制作用
表2：芥酸和亚油烯酸对丙型肝炎病毒复制子抑制作用的IC50、IC90、EC50、EC90、SI50
由表1和表2的结果可见，芥酸和亚油烯酸均具有显著的丙型肝炎病毒复制抑制作用，尤其是亚油烯酸，有开发为药品的潜力。这为预防或治疗肝炎提供了参考资料。
然而，本领域技术人员应当理解的是，提供这些实施例的目的仅在于举例说明，它们不以任何方式限制本发明的范围。凡是在本发明范围内所做出的具体实施方式及应用上的各种变动，都落在本发明的范围内。
Claims (3)
1.芥酸或其可药用盐与亚油烯酸或其可药用盐的组合用于抑制病毒复制的非诊断或治疗的用途；
所述病毒选自丙型肝炎病毒。
2.芥酸或其可药用盐与亚油烯酸或其可药用盐的组合在制备用于预防或治疗病毒感染的药物中的用途；
所述病毒选自丙型肝炎病毒。
3.权利要求1或2的用途，其中所述芥酸或其可药用盐与亚油烯酸或其可药用盐可同时、依次或分开施用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |