CN103087903B - 核酸纯化柱系统及其在核酸提取中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了提供一种核酸纯化柱系统及该系统在核酸提取上的应用。该核酸纯化柱系统包括两个相互独立又能上下位叠加在一起的生物样品制备柱，所述生物样品制备柱包括本体，本体的上部具有加样口，本体的下部具有出样管嘴，生物样品制备柱的加样口上部设置有一保持部件，其中居于上方的制备柱下部紧密扣合在居于下方的制备柱保持部件内。本发明采用可相互叠加的纯化柱系统，满足实验的连续性操作和不同样本之间的转化作用。

Description

核酸纯化柱系统及其在核酸提取中的应用

技术领域

本发明涉及生物样品提取领域，尤其涉及一种核酸纯化柱系统及该系统在核酸提取的应用。

背景技术

在生物学领域，经常需要对样品进行过滤和纯化。尤其是在分子生物学领域，经常需要提取生物样品中的DNA、RNA等大分子物质，并对这些大分子物质进行分离纯化。高效率地分离纯化核酸物质成为分子生物学领域的关键技术。利用制备柱从生物样品中分离和提取核酸已经成为分子生物学领域常用的手段。通常的制备柱为一个圆形的管状结构，包括圆形管柱体，柱体的一端带有密封盖，另一端填充有多孔筛板或膜，在多空筛板上添加了能吸附核酸等生物物质的材料。常采用负压法和离心法提取核酸。采用负压法时，首先将制备柱插到负压装置的插口上，用核酸结合缓冲液溶解需要分离的样品，如PCR产物、酶切、酶标或测序产物并转移至制备柱中，开启并调节负压至-25-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。保持负压，加入洗涤液对管中的残留物进行洗涤后，将制备柱置于新离心管中，在制备柱膜中央加洗脱液或去离子水，室温静置1min后12,000×g离心1min洗脱核酸。采用离心法时，用核酸结合缓冲液溶解需要分离的样品，如PCR产物、酶切、酶标或测序产物，混匀后转移到制备柱中，将制备柱置于离心管中，12,000×g离心1min，弃滤液。将制备柱置回新的离心管，加洗涤液，12,000×g离心1min，弃滤液。再次将制备柱置于洁净的离心管中，在制备柱膜中央加一定量的洗脱液或去离子水，室温静置1min后12,000×g离心1min洗脱得到核酸。现有的核酸提取技术中受到制备柱本身结构的影响，每经过一次洗脱或离心，制备柱都要重新置于新的离心管中，因此不同样本之间的转化步骤复杂。现有的制备柱相互之间是不能相互组合使用，因此不能满足核酸提取的连续性操作。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供核酸纯化柱系统，至少包括两个相互独立又能上下位叠加在一起的生物样品制备柱，所述生物样品制备柱包括本体，本体的上部具有加样口，本体的下部具有出样管嘴，生物样品制备柱的加样口上部设置有一保持部件，其中居于上方的制备柱下部紧密扣合在居于下方的制备柱保持部件内。

优选的，居于下方的制备柱保持部件的内径与居于上方的制备柱下部的外径相同。

优选的，居于上方的制备柱的出样管嘴的外周还包括固定框，所述固定框插入居于下方的制备柱保持部件内，该固定框的外径与居于下方的制备柱的保持部件的内径相同。

优选的，制备柱出样管嘴包括出口端，所述出口端暴露在固定框外。

优选的，制备柱保持部件与本体的连接处还包括支撑面。

优选的，制备柱的本体内具有过滤膜或硅胶膜，或两者的组合。

本发明还提供一种核酸纯化柱系统在核酸提取中的应用，包括以下提取步骤：

1)取30ml在LB培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液，或100ml过夜培养的低拷贝质粒/Cosmid菌液至于离心管中，以大于等于3,000×g离心8min，弃上清，弃上清；

2)加4.5ml的溶液I悬浮细菌沉淀；

3)加4.5ml溶液II，温和并充分地上下翻转6-8次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；此步骤不宜超过5min；向透明溶液中加4.5ml4℃预冷的溶液III，温和并充分地上下翻转10次混合均匀，直至形成紧实的凝集块；室温放置5min；

4)利用本发明所述核酸纯化柱系统，并将居于下方的生物样品制备柱插到负压装置的插口上；将步骤3中所得溶液缓慢加入居于上方的制备柱中，开启并调节负压至-25至-30英寸汞柱，缓慢吸走制备柱中溶液；

5)待步骤4中的溶液吸干后，移除居于上方的制备柱，继续保持负压，向居于下方的制备柱中加5ml溶液IV，吸尽制备柱中溶液；

6)向居于下方的制备柱中加5ml溶液V，吸尽管中溶液；

7)将步骤6中的制备柱置于洁净的15ml离心管中，加0.3ml溶液V，8,000×g离心5min；

8)将步骤7中的制备柱置于另一洁净的15ml离心管中，加0.3ml洗脱液或去离子水，室温静置1min，8,000×g离心2min收集得到质粒DNA；

其中：

溶液I包括2mmol/L KH₂PO₄，10mmol/L Na₂HPO₄，137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，1％Tween20，pH6.0-8.0，加入RNa s e A后，混合均匀，4℃贮存；

溶液II包括0.1-2.5mol/L NaOH，0.05％-1％SDS室温密闭贮存；

溶液III包括0.1-0.5mol/L(NH₄)₂HPO₄·NH₄H₂PO₄，0.5-3mol/LKCl，pH4.5；

溶液IV包括200m mol/L Tris，2M EDTA，1.5mol/L NaCl，3mol/LGuHCl，室温密闭贮存；

溶液V包括50-100％无水乙醇；

洗脱液包括2.5m mol/L Tris-HCl，pH8.5，室温密闭贮存。

本发明的有益效果是：本发明所述的核酸纯化柱系统包括两个相互独立又能上下位叠加在一起的生物样品制备柱。由于在制备柱的上部具有保持部件，并且保持部件的内部直径被设计成与相同类型制备柱的下部外径相同，或者比其大的不同类型的制备柱的固定框的外径相同。当需要进行连续性操作时，其中一个制备柱的下部或固定框就可以紧密的扣合在另一个制备柱的保持部件中，实现了将多个制备柱叠加的方式。更优的方式是制备柱还包括一个支撑面，由于支撑面对插入其中的另一个制备柱下部或制备柱固定框的抵挡作用，进一步保证了两个制备柱扣合的稳固性。从而实现同类型制备柱之间或不同类型制备柱之间的相互叠加，满足了实验的连续性操作要求。制备柱之间的相互叠加，可以减少离心管去杂质的步骤，使生物样品提取和纯化的操作连续性更强。减少中间的操作步骤，可以减少提取过程的产物对环境和操作人员的污染和危害，也可避免过多步骤的操作会增加提取样品污染的几率。另外离心管的使用量也可大大减少，节约成本。

附图说明

图1是第一种生物样品制备柱结构示意图。

图2是第一种核酸纯化柱系统结构示意图。

图3是图2A处的局部放大图。

图4是第二种生物样品制备柱结构示意图。

图5是第二种核酸纯化柱系统结构示意图。

图6图5B处的局部放大图。

图7是生物样品制备柱俯视图，包括内部的隔板结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体附图对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。

如图1所示的生物样品制备柱1包括中空的本体2，所述本体2的上部具有加样口3，本体的下部具有出样管嘴4，在加样口的上部设置有一保持部件5。保持部件用于容纳另一个制备柱插入其中，并能紧紧地卡住插入其中的另一个制备柱，从而能够将两个制备柱叠加在一起使用。保持部件5的内部直径可以根据插入其中的制备柱外径的不同而不同。若相互叠加的制备柱是同种类型的，则保持部件5的内部直径与制备柱本体的外径相同。若相互叠加的制备柱是同种类型，但该制备柱的本体是上大下小或上小下大的圆锥体，则制备柱的保持部件与该制备柱叠加部分即制备柱下部的外径相同。若相互叠加的制备柱是不同类型的，则保持部件5内部直径与插入其中的另一款不同型号的制备柱的下部外径相同。优选的方案中保持部件5与本体2的连接处还包括支撑面6，支撑面6可以是一个水平的结构并将保持部件5和本体相互连接。支撑面也可以是具有一定角度的斜面结构将保持部件5和本体相互连接。支撑面的斜面斜度可以与本体底部7的斜面斜度相同。

在一个实施方案中制备柱还包括密封盖8，密封盖8通过连接臂9与本体2连接。在一个优选的方案中，制备柱的底部与出样管嘴4之间还可以包括隔板10。如图7所示的隔板10结构为多孔的网状结构。

如图2所示是核酸纯化柱系统，包括两个大小相同的同种类型的生物样品制备柱相互叠加在一起。在该核酸纯化柱系统中，下面的制备柱1的保持部件5的内径与上面的制备柱1下部外壁直径相同，使得居于上面的制备柱能够插入到下面的制备柱中，并被下面的制备柱的保持部件紧紧卡住。图3是图2A部分的局部放大图，居于上面的制备柱的本体底部7的一部分正好靠在居于下面的制备柱的支撑面6上，从而进一步巩固了两个制备柱之间的扣合力，两个制备柱被牢固的叠加在一起。

如图4所示的本发明的另一种生物样品制备柱11包括具有空腔的本体2，所述本体2的上部具有加样口3，本体的下部具有出样管嘴4，在加样口的上部设置有一保持部件5，保持部件5的内部直径可以根据插入其中的制备柱外径的不同而不同。保持部件5与本体2的连接处还包括支撑面6，支撑面6可以是一个水平的结构或具有一定斜度的斜面。在出样管嘴4的外周还包括固定框12，固定框12的一段连接在本体的底部7上。在一个优选的方案中，出样管嘴的出口端伸出固定框12，即出样管嘴12出口端暴露在固定框外。由于在出口端的出口端伸出了固定框外，不被固定框包围，因此在生物样品提取时，从出口端出来的物质不会喷射到固定框上，保证了提取的纯度。在一个实施方案中制备柱11还包括密封盖8，密封盖8通过连接臂9与本体连接。在一个优选的方案中，制备柱11的底部与出样管嘴4之间还可以包括隔板10。

如图5所示是本发明另一种核酸纯化柱系统，包括两个不相同类型的生物样品制备柱叠加在一起。在该核酸纯化柱系统中，居于下面的是小体积制备柱1，居于上面的为大体积制备柱11。其中小体积制备柱的保持部件5的内壁直径与插入其中大体积制备柱出样管嘴外周的固定框外壁直径相同，使得居于上面的大体积制备柱11能够插入到居于下面的小体积制备柱中，并被小体积制备柱的保持部件紧紧的扣合住。图6是图5A部分的局部放大图，在优选的方案中，居于上面的大体积制备柱11出样管嘴固定框12的一部分正好抵靠在居于下面的小体积制备柱1的支撑面6上，由于支撑面的支撑，进一步保证了两个制备柱相互叠加的稳定性。

发明所述的核酸纯化柱系统，可以用于提取核酸，如DNA、RNA等生物物质，可以用于除去生物样品预处理时的杂质等。

该生物样品提取柱用于提取核酸时，在本发明所述的制备柱本体内部装入核酸吸附性多孔膜，例如硅胶膜、玻璃纤维膜、二氧化硅纳米材料、石墨烯、二氧化钛晶体薄膜等。这些材料耐受酸碱，能特异性的吸附核酸，而对其他生物材料基本不吸附，可以保障最大程度地回收样品中的DNA或RNA，同时去除其他杂质。在pH为5.0到6.5，含有4M的盐酸胍的高盐环境下，硅胶膜会选择性的吸附DNA、RNA。当处于低盐高pH环境下时，吸附在该硅胶膜上的DNA、RNA会释放出来从而达到纯化的目的。这些多孔膜的孔径为0.1微米至5微米，优选的为1微米。多孔膜的厚度为0.1毫米到2毫米，优选1毫米的厚度。

本发明所述的制备柱的材质为医疗级的聚丙烯，生产过程严格控制，无DNA、Dnase、Rnase等污染。

本发明的核酸纯化柱系统可用于连续负压抽气方法提取核酸。

实施例1高纯度质粒DNA大量提取

1.材料与试剂

核酸纯化柱系统，是由直径适合用于15mL的离心管的小体积制备柱和直径适合用于50mL的离心管的大体积制备柱相互叠加在一起；

硅胶膜：能特异性吸附核酸；

过滤膜：该过滤膜不会与质粒DNA发生特异性结合，其孔径能使质粒DNA顺利通过，而蛋白、菌体等物质不能通过该过滤膜；

离心管。

溶液I：细菌悬浮液，包括2mmol/L KH₂PO₄，10mmol/L Na₂HPO₄，137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，1％Tween20，pH6.0-8.0，加入RNase A后，混合均匀，4℃贮存；

溶液II：细菌裂解液，包括0.1-2.5mol/L NaOH，0.05％-1％SDS室温密闭贮存；

溶液III：中和液，包括0.1-0.5mol/L(NH₄)₂HPO₄·NH₄H₂PO₄，0.5-3mol/L KCl，pH4.5；

溶液IV：洗涤液，包括200m mol/L Tris，2mol/L EDTA，1.5mol/LNaCl，3mol/L GuHCl，室温密闭贮存；

溶液V：去盐液，包括50-100％无水乙醇；

洗脱液：2.5m mol/L Tris-HCl，pH8.5，室温密闭贮存；RNase A。

2.步骤

1)取30ml在LB培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液，或100ml过夜培养的低拷贝质粒/Cosmid菌液(若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少)，≥3,000×g离心8min，弃上清。将离心管倒置于纸巾上数分钟，除尽上清。

2)加4.5ml的溶液I(细菌悬浮液，已加入RNase A)悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

3)加4.5ml溶液II(细菌裂解液)，温和并充分地上下翻转6-8次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；此步骤不宜超过5min。向透明溶液中加4.5ml4℃预冷的溶液III(中和液)，温和并充分地上下翻转10次混合均匀，直至形成紧实的凝集块；室温放置5min。

4)如图5所示，将大体积生物样品制备柱11安装在小体积生物样品制备柱1上，小体积制备柱1插到负压装置的插口上。将步骤3中所得溶液缓慢加入大体积制备柱中，开启并调节负压至-25-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。

5)待步骤4中的溶液吸干后，将大体积制备柱从小体积制备柱中拔除，大体积制备柱由于过滤膜的存在，截留下被裂解的菌体残片，并让核酸等目标物质顺利通过进入小体积制备柱中。继续保持负压，在小体积制备柱中加5ml溶液IV(洗涤液)，吸尽小体积制备柱中溶液。

6)向小体积制备柱中加5ml溶液V(去盐液)，吸尽管中溶液。

7)将步骤6中的小体积制备柱置于洁净的15ml离心管中，加0.3ml溶液V(去盐液)，8,000×g离心5min

8)将小体积制备柱置于另一洁净的15ml离心管中，加0.3ml洗脱液或去离子水。室温静置1min。8,000×g离心2min收集质粒DNA。

3.检测

用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测，回收所得质粒DNA的浓度和纯度符合要求。

在该实施例1中所述的核酸纯化柱系统及其提取质粒DNA的方法。由于该核酸纯化柱系统中的大体积制备柱包括过滤膜，该过滤膜可以截留下被裂解的菌体残片，并让核酸等目标物质顺利通过进入小体积制备柱中。大体积制备柱的存在代替了用离心的方法除去菌体残片的步骤。又由于在该核酸纯化柱系统中大体积制备柱是与小体积制备柱相连的，使得去除菌体残片和提纯核酸等目标产物实现了连续操作无缝对接。因此大大减少了操作步骤提高了效率，实现了自动化。

Claims (3)

1.连续负压抽气提取核酸的方法，包括以下提取步骤：

1)取30ml在LB培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液，或100ml过夜培养的低拷贝质粒/Cosmid菌液置于离心管中，以大于等于3,000×g离心8min，弃上清；

2)加4.5ml的溶液I悬浮细菌沉淀；

3)加4.5ml溶液II，温和并充分地上下翻转6-8次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；此步骤不超过5min；向透明溶液中加4.5ml 4℃预冷的溶液III，温和并充分地上下翻转10次混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温放置5min；

4)利用核酸纯化柱系统，并将核酸纯化柱系统居于下方的生物样品制备柱插到负压装置的插口上；将步骤3中所得溶液缓慢加入居于上方的制备柱中，开启并调节负压至-25至-30英寸汞柱，缓慢吸走制备柱中溶液；所述的核酸纯化柱系统，至少包括两个组合在一起使用的生物样品制备柱，所述生物样品制备柱分别包括本体，本体的上部具有加样口，本体的下部具有出样管嘴，其特征在于，生物样品制备柱的加样口上部设置有一保持部件，其中居于上方的制备柱下部紧密扣合在居于下方的制备柱保持部件内，使所述的两个制备柱相互独立又能上下位叠加在一起；

5)待步骤4中的溶液吸干后，移除居于上方的制备柱，继续保持负压，向居于下方的制备柱中加5ml溶液IV，吸尽制备柱中溶液；

6)向居于下方的制备柱中加5ml溶液V，吸尽管中溶液；

7)将步骤6中的制备柱置于洁净的15ml离心管中，加0.3ml溶液V，8,000×g离心5min；

8)将步骤7中的制备柱置于另一洁净的15ml离心管中，加0.3ml洗脱液或去离子水，室温静置1min，8,000×g离心2min收集得到质粒DNA；

其中：

溶液I包括2mmol/L KH₂PO₄，10mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，137mmol/LNaCl，2.7mmol/L KCl，1％Tween 20，pH6.0-8.0，加入RNase A后，混合均匀，4℃贮存；

溶液II包括0.1-2.5mol/L NaOH，0.05％-1％SDS室温密闭贮存；

溶液III包括0.1-0.5mol/L(NH₄)₂HPO₄·NH₄H₂PO₄，0.5-3mol/LKCl，pH 4.5；

溶液IV包括200mmol/L Tris，2M EDTA，1.5mol/L NaCl，3mol/LGuHCl，室温密闭贮存；

溶液V包括50-100％无水乙醇；

洗脱液包括2.5mmol/L Tri s-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的居于下方的制备柱保持部件的内径与居于上方的制备柱下部的外径相同。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，居于上方的制备柱的出样管嘴的外周还包括固定框，所述固定框插入居于下方的制备柱保持部件内，该固定框的外径与居于下方的制备柱的保持部件的内径相同，制备柱出样管嘴包括出口端，所述出口端暴露在固定框外。