CN103087182B - 一种定点修饰n-末端的聚乙二醇化生长激素拮抗剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种定点修饰N-末端的聚乙二醇（PEG）化生长激素拮抗剂（GHA），以及其制备方法。所述方法包括以下：（1）以分子量为20kDa和40kDa的PEG醛分别定点修饰GHA的N末端；（2）用凝胶过滤色谱分离纯化上述两种PEG修饰产物；（3）两种PEG修饰产物的药效动力学的初步评价。其中，分子量为20kDa的PEG醛为优化的PEG，修饰产物具有较高的药效。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种定点修饰N-末端的聚乙二醇（PEG）化生长激素拮抗剂，以及其制备方法。
背景技术
生长激素的主要作用在于促进生长，涉及调节身体的生长，以及调节蛋白质、碳水化合物和脂类的代谢。生长激素的代谢作用由胰岛素样生长因子-I（IGF-I）介导。垂体生长激素腺瘤是常见的垂体肿瘤之一，由于生长激素（GH）过度分泌、IGF-I浓度增高，导致巨人症和肢端肥大症，其病亡率可高达20%-30%。目前的治疗方法主要是减少或抑制生长激素的分泌，以降低生长激素的水平，防止生长激素的过度分泌，但是治疗效果不佳。
生长激素拮抗剂（GHA）可通过阻止生长激素与其受体（GHR）的结合，阻止后续的信号转导，降低血浆IGF-I的水平，从而达到治疗的目的。GHA是通过置换人生长激素（hGH）的8个氨基酸残基，并用基因工程的方法表达出来的一种蛋白质。这8个氨基酸残基在人生长激素第1结合位点内，对生长激素与GHR的结合功能特别重要。其中，第18位天冬氨酸取代组氨酸（H18D）、第21位天冬酰胺取代组氨酸（H21N）、第167位天冬酰胺取代精氨酸（R167N）、第168位丙氨酸取代赖氨酸（K168A）、第171位丝氨酸取代天冬氨酸（D171S）、第172位精氨酸取代赖氨酸（K172R）、第174位丝氨酸取代谷氨酸（E174S）和第179位苏氨酸取代异亮氨酸（I179T）。通过氨基酸的置换，使第1结合位点与GHR的亲和力大为增加。
此外，B2036是一种人生长激素的9个氨基酸残基被置换的蛋白质。除了置换上述8个氨基酸残基以外，还有第1结合位点的第120位甘氨酸取代赖氨酸（G120K）。然而，B2036分子与GHR二聚体的亲和力却与人生长激素相当。这是由于尽管B2036的第1结合位点与GHR的亲和力有所增加，但第2结合位点几乎失去了与GHR的结合能力，从而能够抑制生长激素的生物学功能。由于B2036在体内的血浆半衰期短，仅为15-20分钟，所以不能持续阻断生长激素的功能。在临床使用时需要加大给药量和给药次数，并带来一定的毒副作用，增加了病人的痛苦与经济负担。
聚乙二醇（PEG）修饰被认为是一种能有效克服蛋白质药物血浆半衰期短的方法之一。这是因为PEG自身有着巨大的优势，它是一种线性的、在溶液中可自由卷曲且不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性，已被美国FDA批准用于人体。目前已有多种PEG修饰的蛋白质药物被美国FDA批准上市，如PEG修饰的干扰素α2a（Pegasys,Roche公司）等。使用PEG共价修饰蛋白质，可以延长蛋白质的体内循环半衰期，降低蛋白质的免疫原性，增加蛋白质的溶解性以及改变蛋白质在人体内的生物学分布。PEG修饰蛋白质和多肽主要是氨基修饰（包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N端氨基的烷基化修饰）、羧基修饰以及巯基修饰等。其中，定点修饰主要包括N-末端修饰和半胱氨酸残基修饰。N-末端修饰是通过PEG醛与一定量的还原剂如氰基硼氢化钠（NaCNBH3）在偏酸的环境下进行的还原烷基化反应。
Kopchick等（Endocr.Rev.2002,23:623-646）将B2036分子共价修饰上4~6个分子量为5kDa的PEG分子，得到的生长激素类似物称为PEG-B2036，即培维索孟（Pegvisomant）。由于Pegvisomant第168位和172位都不是赖氨酸残基，所以PEG化对Pegvisomant的第1结合位点的影响小于PEG-hGH（G120K）。而Pegvisomant第120位为赖氨酸残基，可被PEG化，进一步降低了它与第2结合位点的亲和力。Pegvisomant于2003年获得美国FDA的批准上市，用于治疗垂体生长激素腺瘤引起的肢端肥大症，商品名索马沃（Somavert）。目前，欧洲也已将其用于肢端肥大症的临床治疗。但是，由于Pegvisomant是在B2036分子上接上4~6个分子量为5kDa的PEG分子。这种修饰产物不均一，修饰位点随机性强，每种成分无法定量、也无法进行分离，使得批次间的重复性较差，不同批次间的产物生物活性或有差别，不利于产品的质量控制和临床应用。Ross等（J.Clin.Endocrinol.Metab.2001,86:1716-1723）的研究也表明Pegvisomant与GHR二聚体的亲和力要低于人生长激素。Pegvisomant与GHR二聚体的亲和力为PEG-hGH（G120K）的6.6倍，但只有人生长激素的1/40。因此，Pegvisomant的浓度要远高于人生长激素才能达到拮抗的目的。这可能是因为在B2036分子的8个赖氨酸残基及N-末端残基上修饰4~6个5kDa的PEG分子后，降低了Pegvisomant第1结合位点与GHR的亲和力。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种PEG修饰GHA的方法。分别采用分子量为20kDa和40kDa的PEG醛定点修饰GHA的N-末端的α-氨基，制备分子量均一的定点修饰N-末端的PEG化GHA，即每个GHA分子的N-末端结合1个PEG分子。最终修饰产物成分单一，易于分离纯化，产物收率高，预期能减少GHA生物活性的损失。
本发明的另一个目的还在于解决PEG修饰后GHA的半衰期增加而其药效降低的问题。通过比较分子量为20kDa和40kDa的PEG修饰产物对血浆IGF-1的抑制作用，探讨不同链长PEG对GHA生物活性的影响，寻找PEG修饰GHA的药代动力学与药效动力学间的平衡点。在实施方案中发现，20kDa的PEG修饰产物（M-P20K-GHA）表现出较高的药效，而40kDa的PEG修饰产物（M-P40K-GHA）的药效几乎消失。因此，20kDa的PEG醛为优选的PEG用于修饰GHA。
本发明制备N-末端PEG单修饰的生长激素拮抗剂的方法，包括以下步骤：
（1）确定M-P20K-GHA的制备条件：将GHA置换到50mM NaAc-HAc缓冲液（pH5.5）中。调整GHA浓度为2.2mg/mL（0.1mM），按GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3的不同摩尔比例，于4℃分别反应过夜（~16小时）。以Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm）检测PEG修饰产物，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。
（2）修饰产物M-P20K-GHA的纯化及鉴定：根据步骤1所述，选择GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3摩尔比1:8:80用于制备M-P20K-GHA。以Superdex200凝胶过滤柱（1.6cm×60cm）对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。收集修饰产物的洗脱峰，浓缩后用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱对修饰产物进行鉴定。
（3）确定M-P40K-GHA的制备条件：将GHA置换到50mM NaAc-HAc缓冲液（pH5.5）中。调整GHA浓度为2.2mg/mL（0.1mM），按GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3的不同摩尔比例，于4℃分别反应过夜（~16小时）。以Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm）检测PEG修饰产物，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。
（4）修饰产物M-P40K-GHA的纯化及鉴定：根据步骤3所述，选择GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3摩尔比1:4:80用于制备M-P40K-GHA。以Superdex200凝胶过滤柱（1.6cm×60cm）对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。收集产物的洗脱峰，浓缩后用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱进行产物鉴定。
（5）M-P20K-GHA和M-P40K-GHA的修饰位点鉴定：将GHA、M-P20K-GHA及M-P40K-GHA置换到含2.0M脲的NH4HCO3（0.05M，pH8.3）溶液中，将蛋白浓度调整为1.0mg/mL。将胰蛋白酶和蛋白以质量比为1:100的比例，于37℃下孵育10小时，酶解产物使用反相HPLC柱（Proteonavi，0.46cm×25cm）进行酶切片段的分离和鉴定。
（6）M-P20K-GHA与M-P40K-GHA的药效动力学：选取250~300克雄性SD大鼠20只，随机分为4组。其中，第1组为对照组，皮下注射0.15M的NaCl（500μl）；第2-4组分别为GHA、M-P20K-GHA及M-P40K-GHA组。注射剂量为2mg GHA/kg SD大鼠，共注射500μl。经皮下注射后，于第1、4、24、48、72、96、120和144小时进行眼眶采血，离心收集血浆。用ELISA试剂盒测定血浆中IGF-I的含量。
与传统的GHA修饰策略相比，本发明的优势在于提供了一种将不同分子量的PEG醛修饰在GHA的N-末端的方法，从而得到均一且定点的PEG单修饰产物，使GHA的活性中心不被PEG修饰，减少GHA生物活性的损失。以M-P20K-GHA及M-P40K-GHA为例，通过比较不同分子量的PEG醛单修饰产物，考察其对血浆IGF-I的抑制作用，探讨不同链长PEG对GHA生物活性的影响，确定修饰GHA的最佳PEG链长。
附图说明
图1分子量为20kDa的PEG醛修饰GHA的凝胶过滤色谱图。使用的是Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm），洗脱液流速为0.5ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。样品为不同反应比例下制备的PEG修饰产物。
图2分子量为40kDa的PEG醛修饰GHA的凝胶过滤色谱图。使用的是Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm），洗脱液流速为0.5ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。样品为不同反应比例下制备的PEG修饰产物。
图3凝胶过滤柱分离纯化PEG修饰产物。使用的是Superdex200凝胶过滤柱（1.6cm×60cm），洗脱液流速为1.0ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。收集箭头所示的洗脱峰，即对应于纯化的M-P20K-GHA和M-P40K-GHA。
图4PEG修饰产物的纯度鉴定。凝胶过滤色谱图使用的是Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm），洗脱液流速为0.5ml/min，洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。插图是SDS-PAGE分析结果。第1泳道是标准蛋白，第2泳道是GHA，第3泳道是M-P20K-GHA，第4泳道是M-P40K-GHA。
图5PEG修饰位点的鉴定图谱。使用反相HPLC柱（Proteonavi，0.46cm×25cm）进行酶切肽段分离。
图6SD大鼠血浆中IGF-I的浓度变化曲线。SD大鼠经皮下注射PEG修饰产物，血浆中IGF-I的含量由IGF-I ELISA定量试剂盒测定。
具体实施方式
实施例1M-P20K-GHA制备条件的确定
将GHA置换到50mM NaAc-HAc缓冲液（pH5.5）中。调整GHA浓度为2.2mg/mL（即0.1mM），按GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3摩尔比为1:4:40、1:4:80、1:6:80、1:6:60、1:6:120、1:8:40、1:8:80以及1:8:160，4℃分别反应过夜（~16小时）。以Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm）对修饰产物进行检测，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。20kDa PEG醛修饰GHA的结果如图1所示，以M-P20K-GHA的峰面积与总的峰面积比值大小来衡量产率。随着20kDa PEG醛和NaCNBH3反应比例的提高，M-P20K-GHA的产率也随之提高。但是，随着反应比例的增加，出现了多修饰的GHA，即D-P20K-GHA，并随着反应比例的增加而增加。此外，随着反应比例的增加，GHA的残留量显著下降；当GHA：PEG醛：NaCNBH3的摩尔比为1:8:160时，GHA基本反应完全。虽然GHA：PEG醛：NaCNBH3的摩尔比为1:8:160时，能够得到较多的GHA修饰产物，但是由于D-P20K-GHA的产率较多，因而GHA：PEG醛：NaCNBH3的摩尔比为1:8:160时，M-P20K-GHA的产率要低于摩尔比为1:8:80(~75%)。因此，选择GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3摩尔比1:8:80用于制备M-P20K-GHA。
实施例2M-P40K-GHA制备条件的确定
将GHA置换到50mM NaAc-HAc缓冲液（pH5.5）中。调整GHA浓度为2.2mg/mL（即0.1mM），按GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3摩尔比为1:4:40、1:4:80、1:6:60、1:6:120、1:8:40以及1:8:80，4℃分别反应过夜（~16小时）。以Superdex200凝胶过滤柱（1cm×30cm）对得到的结合产物进行检测，洗脱液为20mM磷酸缓冲液（pH7.2）。如图2所示，与20kDa的PEG醛修饰GHA的情况基本相同，采用40kDa的PEG醛修饰GHA，随着GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3摩尔比例的增加，M-P40K-GHA的产率增加，GHA残量逐渐减少。虽然GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3的摩尔比为1:8:80时，能够得到较多的GHA修饰产物，但是由于D-P40K-GHA的产率较多，因而GHA：PEG醛：NaCNBH3的摩尔比为1:8:80时，M-P40K-GHA的产率要低于摩尔比为1:4:80(~71%)。因此，选择GHA：PEG醛：NaCNBH3摩尔比1:4:80用于制备M-P40K-GHA。
实施例3M-P20K-GHA与M-P40K-GHA的分离纯化及鉴定
根据实施例1所述，选择GHA：PEG醛（20kDa）：NaCNBH3摩尔比1:8:80用于制备M-P20K-GHA。根据实施例2所述，选择GHA：PEG醛（40kDa）：NaCNBH3摩尔比1:4:80用于制备M-P40K-GHA。以Superdex200凝胶过滤柱（1.6cm×60cm）对修饰产物进行分离纯化，洗脱液为20mM磷酸盐缓冲液（pH7.2）。如图3所示，经洗脱后出现了三个洗脱峰，分别对应于PEG的二修饰产物（每个GHA结合2个PEG）、PEG的单修饰产物（每个GHA结合1个PEG）和未修饰的GHA。分别收集两种PEG修饰的单修饰产物，浓缩后用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱鉴定。收集修饰产物的洗脱液，浓缩后用于后续的产品鉴定。
实施例4M-P20K-GHA与M-P40K-GHA的鉴定
用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱鉴定M-P20K-GHA与M-P40K-GHA。如图4插图所示，M-P20K-GHA与M-P40K-GHA在SDS-PAGE电泳图上均表现出一条带，这表明这两种PEG修饰产物具有较高的纯度。M-P40K-GHA电泳带的迁移速率要慢于M-P20K-GHA，而M-P20K-GHA要慢于GHA。这表明PEG修饰能增加GHA的分子量，且M-P40K-GHA的分子量要高于M-P20K-GHA。如图4所示，经缓冲液洗脱后，M-P20K-GHA与M-P40K-GHA分别在Superdex200凝胶过滤柱（1.0cm×30cm）出现1个单一的洗脱峰。其中，M-P20K-GHA的出峰时间要快于M-P40K-GHA，而要慢于GHA。这表明M-P20K-GHA与M-P40K-GHA具有较高的纯度，且分子量要大于GHA。
实施例5PEG修饰位点的鉴定
将GHA、M-P20K-GHA与M-P40K-GHA经含2.0M脲的NH4HCO3（0.05M，pH8.3）的缓冲液中充分透析，而后调节浓度至1.0mg/mL。取胰蛋白酶，用超纯水配置浓度为1.0mg/mL的储液。按照胰蛋白酶和蛋白的质量比为1:100的比例，分别加入胰蛋白酶储液，于37℃孵育10小时。使用反相HPLC柱（Proteonavi，0.46cm×25cm）进行酶切肽段分离。反相HPLC柱使用95%的溶液A（含0.1%三氟乙酸的超纯水）和5%的溶液B（含0.1%三氟乙酸的乙腈）充分平衡，流速为0.5mL/min。采用线性洗脱方式于100min从5%溶液B升至50%溶液B，检测流出液在214nm的吸收值。
结果如图5所示，胰蛋白酶可以将GHA及其PEG修饰产物切成不同的肽段。其中以T2肽段作为对照，M-P20K-GHA和M-P40K-GHA与未修饰的GHA相比，由8个氨基酸残基组成且N-末端所在的T1肽段（FPTIPLSR）消失，这是因为T1段经PEG修饰后，出峰位置发生改变，这说明了M-P20K-GHA和M-P40K-GHA的修饰位点均在N-末端的α-氨基。除此之外，其它酶切片段与GHA相比无显著变化。这表明PEG能特异性地修饰GHA的N末端。
实施例6M-P20K-GHA和M-P40K-GHA的药效动力学评价
选取250~300克雄性SD大鼠20只，随机分为4组。其中，第1组为对照组，皮下注射0.15mol/L的NaCl（500μl）；第2-4组分别为GHA、M-P20K-GHA及M-P40K-GHA组。注射剂量为2mg GHA/kg SD大鼠，注射500μl，经皮下注射后，于1、4、24、48、72、96、120和144小时进行眼眶采血，离心收集血浆。
以IGF-1浓度高低作为评价GHA药效的指标。血浆中IGF-I的含量由IGF-I ELISA定量试剂盒（R&D Systems,Inc.,USA）测定。如图6所示，对照组、GHA组和M-P40K-GHA组的IGF-I水平相差不大，而M-P20K-GHA的IGF-I水平比对照组约低30~43%。这说明M-P20K-GHA抑制了IGF-1的水平，即M-P20K-GHA的药效要显著优于M-P40K-GHA。GHA组的IGF-I的水平与对照组差异不大，这是由于GHA在体内被快速消除，体内的循环半衰期为15~20分钟，未能有效降低IGF-1水平。对于M-P20K-GHA而言，PEG的链长较短，会部分屏蔽GHA分子上与GHR的结合位点，降低GHA的活性。然而M-P20K-GHA的半衰期延长能够抵消GHA生物活性的降低，从而能够显著降低IGF-I水平。对于M-P40K-GHA而言，由于将40kDa的PEG修饰在GHA的N-末端，高分子量的PEG能完全屏蔽GHA与GHR的结合位点，使GHA的活性几乎完全丧失。尽管M-P40K-GHA的半衰期显著延长，却无法弥补GHA的生物活性丧失。因此，M-P20K-GHA在延长GHA的半衰期的同时，能最大程度地保留GHA的生物活性。分子量为20kDa的PEG醛可作为优化的PEG用于修饰GHA。
Claims (3)
1.一种定点修饰N-末端的聚乙二醇化生长激素拮抗剂，其特征在于聚乙二醇化生长激素拮抗剂是由1个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇醛共价修饰到生长激素拮抗剂的N-末端，而且生长激素拮抗剂是通过置换人生长激素的9个氨基酸残基得到的蛋白质，其中这9个氨基酸残基的置换情况为H18D、H21N、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S、I179T和G120K。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化生长激素拮抗剂，其特征在于生长激素拮抗剂与单甲氧基聚乙二醇醛发生修饰反应的摩尔比为1:8。
3.权利要求1所述的聚乙二醇化生长激素拮抗剂的制备方法，其特征在于单甲氧基聚乙二醇醛与生长激素拮抗剂发生修饰反应的反应时间为6-48小时，反应温度在4-37℃，反应pH为4.0-7.0，缓冲体系为20mM的磷酸缓冲液，用氰基硼氢化钠作为还原剂。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant |