CN103080329A - 含有半乳寡聚糖的组合物及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有半乳寡聚糖的组合物的生产方法，以及含有这种半乳寡聚糖的组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有半乳寡聚糖（galacto-oligosaccharide）的组合物以及一种生产其的有效方法。
背景技术
已知人类的母乳中含有许多不同的寡糖（低聚糖，oligosaccharide），母乳喂养对婴儿健康的有益影响要归因于这些寡糖（Kunz et al.(2000)）。例如，将某些寡糖（如FOS、GOS、或菊糖（inulin））称为益菌素（益生元，prebiotic），这意味着它们促进胃肠系统的有益细菌并且抑制有害细菌。由于寡糖促进健康的作用，常常将它们用于功能性食品中，如婴儿配方和临床营养品。
存在一些方法来生产寡糖。一种方法是基于从天然存在的来源中分离寡糖。例如在洋姜（Jerusalem artichoke）、牛蒡、菊苣、韭葱（leek）、洋葱、和芦笋中天然发现的果寡糖（FOS）和菊糖，并且可以从这些农作物中将它们分离。例如在Frank（2002）中描述了由菊苣根茎制备菊糖。合适的农作物的可用性限制了寡糖的这种生产方法，而且对于更复杂的寡糖的实施而言可以是不可能的。
另一种方法是基于酶促合成，其中酶类催化寡糖的合成。Yun（1996）描述了使用具有果糖基转移酶活性的酶类并使用蔗糖作为酶的底物的果寡糖（低聚果糖，fructo-oligosaccharide）的酶法生产（enzymatic production）。在WO 01/90,317 A2中描述了酶促合成的另一个实例，其披露了一种使用特定β-半乳糖苷酶和乳糖作为底物生产式为Gal-Gal-Glc的半乳寡糖（GOS）的方法。
发明内容
本发明的目的是提供生产半乳寡聚糖的改进的方法。此外本发明的目的使提供改进的含有半乳寡聚糖的组合物。
本发明人已经出乎意料地发现，可以使用具有β-半乳糖苷酶活性的酶类（优选具有T值为最多0.9）来高效地合成特定类型的半乳寡聚糖，其中半乳糖基受体与半乳糖基供体不同。
从而，本发明的一方面涉及一种包含一种或多种半乳寡聚糖的组合物的生产方法，该方法包括以下步骤：
a）提供包含以下的混合物
-包含结合至离去基团的半乳糖基基团的半乳糖基供体，
-不同于半乳糖基供体的半乳糖基受体，以及
其中半乳糖基受体和半乳糖基供体之间的摩尔比至少为1:10，其中该混合物包含至少0.05mol/L的半乳糖基受体，
b）提供具有β-半乳糖苷酶活性的酶，所述酶与混合物接触，
c）使酶释放半乳糖基供体的离去基团并将半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至半乳糖基受体上，从而形成半乳寡聚糖，由此获得包含一种或多种半乳寡聚糖的组合物。
本发明公开了用于高产率低廉且有效地生产复杂的半乳寡聚糖组合物。此外本发明表现出降低可能导致不期望的副产品的半乳糖基供体的自身半乳糖苷化（self-galactosylation）程度，从组合物中除去这类副产品是昂贵的。
优选地，除β-半乳糖苷酶活性之外，酶也具有转半乳糖苷（transgalactosylation）活性。也可以优选具有最多为0.9的T值的酶。
在本发明的背景下，术语β-半乳糖苷酶的“转半乳糖苷活性”指的是酶将半乳糖基基团从供体分子（例如乳糖分子）转移至非水分子（例如另一种乳糖分子）的能力。
T值是β-半乳糖苷酶使用乳糖既作为半乳糖基供体又作为半乳糖基受体的转半乳糖苷效率的度量。β-半乳糖苷酶的T值的测定是根据试验以及在实施例2中描述的公式进行的。利用以下公式计算T值：
在没有任何转半乳糖苷活性的情况下，对于使用的每mol的乳糖，乳糖酶将产生1mol的半乳糖，并将具有的T值为1。具有极高转半乳糖苷活性的β-半乳糖苷酶将使用几乎所有的来自乳糖的半乳糖基基团用于转半乳糖苷而不是产生半乳糖，随之得到接近0的T值。
本发明的又一方面涉及包含一种或多种半乳寡聚糖的组合物，其中组合物可以通过如本文中描述的方法获得。
将本发明另外的目的和优点描述如下。
附图说明
图1a显示了在实施例3中描述的混合物（含有乳糖和L-岩藻糖）在用酶温育之前的HPLC色谱图。
图1b显示了实施例3的混合物在用酶温育之后的HPLC色谱图，其中清晰地给出了含有L-岩藻糖的半乳寡聚糖的峰（峰6、峰7、和峰8）。
图2包括实施例3的混合物中的乳糖、葡萄糖、和半乳糖在酶促反应期间的浓度（任意单位）的曲线图。
图3包括实施例3的混合物中的寡糖Gal-Fuc、Gal-Gal-Fuc/Gal-Gal-Glc、和Gal-Gal-Gal-Fuc/Gal-Gal-Gal-Glc在酶促反应期间的浓度（任意单位）的曲线图。
图4包括实施例4的混合物中的寡糖Gal-Fuc、Gal-Gal-Fuc/Gal-Gal-Glc、和Gal-Gal-Gal-Fuc/Gal-Gal-Gal-Glc在酶促反应期间的浓度（任意单位）的曲线图。
图5包括实施例5的混合物中的寡糖Gal-GalNAc、Gal-Gal-GalNAc/Gal-Gal-Glc、和Gal-Gal-Gal-GalNAc/Gal-Gal-Gal-Glc在酶促反应期间的浓度（任意单位）的曲线图。
图6包括实施例6的混合物中的寡糖Gal-Xyl、Gal-Gal-Xyl/Gal-Gal-Glc、和Gal-Gal-Gal-Xyl/Gal-Gal-Gal-Glc在酶促反应期间的浓度（任意单位）的曲线图。
具体实施方式
如上所述，本发明的一方面涉及一种包含一种或多种半乳寡聚糖的组合物的生产方法，该方法包括以下步骤：
a）提供混合物，包含
-包含结合至离去基团的半乳糖基基团的半乳糖基供体，
-不同于半乳糖基供体的半乳糖基受体，以及
其中半乳糖基受体和半乳糖基供体之间的摩尔比至少是1:10，其中该混合物包含至少0.05mol/L的半乳糖基受体，
b）提供具有β-半乳糖苷酶活性和优选具有最多为0.9的T值的酶，所述酶与混合物接触，以及
c）使酶释放半乳糖基供体的离去基团并将半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至半乳糖基受体，从而形成半乳寡聚糖，由此获得包含一种或多种半乳寡聚糖的组合物。
在本发明的背景下，术语“糖基基团”（glycosyl group）指的是通过从单糖或较低寡聚糖（如二糖或三糖）上或从相应的糖醇上除去一个或两个羟基而得到的基团。本文中的术语用来描述半乳糖基供体、半乳糖基受体、和寡聚糖的各种结构单元（building block）。
大多数常见糖类和它们相应的糖基基团的缩写在下面示出。
在本发明的背景下，术语“寡聚糖”指的是包含至少两个（优选至少三个）糖基基团（可以是不同或相同类型）的分子。优选地，至少两个糖基基团经由O-糖苷键结合。寡聚糖可以是直链的糖基基团或者它可以具有分支结构。例如，寡聚糖可以由化学计量式，例如(Gal)3Glc表示，或由通式，例如Gal-Gal-Gal-Glc、Gal-Gal-Glc-Gal、或Gal-(Gal-)Glc-Gal表示。化学计量式提供关于寡聚糖、或寡聚糖类所包含的糖基基团的信息，但不提供这些的相对位置，而通式还包含关于糖基基团相对位置的一般信息。
在本发明背景下，术语“同寡聚糖”（homo-oligosaccharide）指的是仅含有一种类型糖基基团的寡聚糖。同寡聚糖类的实例是Gal-Gal-Gal-Gal和Glc-Glc-Glc。
在本发明背景下，术语“异寡聚糖”（hetero-oligosaccharide）指的是含有不同糖基基团的寡聚糖，例如Gal-Gal-Glc、或Gal-Gal-Fuc。
在本发明的背景下，与术语“寡聚糖”一起使用的词头“半乳”（galacto-）表明该寡聚糖含有半乳糖基基团作为重复单元。词头“同”或“异”可以与词头“半乳”一起使用。Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Gal两者都是半乳寡聚糖。Gal-Gal-Glc是异半乳寡聚糖，Gal-Gal-Gal-Gal是同半乳寡聚糖。
在本发明的背景下，“X”代表如本文中定义的半乳糖基受体。“-X”代表相当于半乳糖基受体的糖基基团，尤其是结合至另一个基团的糖基基团。“-”代表键。糖基基团优选经由糖基基团的3、4、5、或6位结合，并且优选经由O-糖苷键。
在本发明背景下，“Gal-”代表结合至另一个基团上的半乳糖基基团，优选经由该半乳糖基基团的1位，以及优选经由O-糖苷键。在本发明的背景下，“-Gal-”代表结合至两个其他基团的半乳糖基。左侧的键优选经由半乳糖基基团的4或6位结合，并且优选经由O-糖苷键。右侧的键优选经由半乳糖基基团的1位结合，并且优选经由O-糖苷键。
两个半乳糖基基团之间的键是典型的1-4键或1-6键，并且通常为O-糖苷键。可替换地，半乳糖基基团和含氮受体之间的键可以是N-糖苷键。
在本发明的背景下，术语“方法”和“过程”可互换使用。
步骤a）包括提供将在其中生产寡聚糖的混合物。
混合物优选是液体混合物，例如，可以是含有半乳糖基受体和半乳糖基供体的含水溶液。
在本发明的一些实施方式中，步骤a）的混合物中半乳糖基受体和半乳糖基供体的摩尔比为至少1:5，优选至少1:1，更优选至少5:1。例如，步骤a）的混合物中半乳糖基受体和半乳糖基供体的摩尔比可以为至少10:1，如至少1:1。
步骤a）的混合物中半乳糖基受体和半乳糖基供体的摩尔比可以在，例如，1:10-100:1的范围之内。
在本发明的一些实施方式中，步骤a）的混合物中半乳糖基受体和半乳糖基供体的摩尔比在1:10-50:1的范围内，优选在1:5-30:1的范围内，甚至更优选在1:1-20:1的范围内。例如，步骤a）的混合物中半乳糖基受体和半乳糖基供体的摩尔比可以在，例如，2:1-40:1的范围内，优选在4:1-30:1的范围内，甚至更优选在10:1-25:1的范围内。
如上所述，半乳糖基供体含有共价结合至离去基团的半乳糖基基团。半乳糖基基团优选是β-D-吡喃半乳糖基（β-D-galactopyranosyl）基团。此外，半乳糖基基团优选经由O-糖苷键从半乳糖基基团的1位结合至离去基团。
例如，半乳糖基供体的离去基团可以是糖基基团和/或糖醇基团。如果离去基团是单糖或二糖的糖基基团或相应的糖醇，半乳糖基基团优选经由O-糖苷键从半乳糖基基团的1位结合至离去基团，该半乳糖基基团键合至单糖型离去基团的4位或键合至二糖型离去基团的4’位。
在本发明的背景下，词组“Y和/或X”的意思是“Y”或“X”或者“Y”和“X”。顺着相同的逻辑思路，词组“X1、X2、……、Xi-1、和/或Xi”的意思是“X1”或“X2”或……或“Xi-1”或“Xi”或者组成X1、X2、……Xi-1、和Xi的任意组合。
在本发明的一些实施方式中，半乳糖基供体的摩尔重量最多为1000g/mol。例如，半乳糖基供体的摩尔重量可以是最多500g/mol。甚至可以优选摩尔重量最多为350g/mol的半乳糖基供体。
二糖是目前优选的半乳糖基供体类型。可替换地，或另外地，三糖也可以用作半乳糖基供体。从而，预想混合物可以含有不同的半乳糖基供体的组合。
在本发明的一些优选实施方式中，半乳糖基供体是乳糖。另一个有用的半乳糖基供体的实例是乳果糖。又一个有用的半乳糖基供体的实例是乳糖醇。
在本发明的背景下，术语“乳糖”指的是二糖β-D-吡喃半乳糖基-（1→4）-D-葡萄糖，也称为乳糖（milk sugar），它是牛奶中最主要的糖。
可以经由任何有用的半乳糖基供体来源提供半乳糖基供体，可以是工业化提纯来源（如纯化乳糖），和/或天然来源（如乳清渗透物，即通过乳清超滤制备的脱蛋白乳清）两者。
半乳糖基受体可以是能够接受来自酶的半乳糖基基团的任何分子，典型地，含有羟基，优选醇式羟基。术语“接受”的意思是供体的半乳糖基基团应当共价结合至受体，例如经由O-糖苷键。
在本发明的一些实施方式中，半乳糖基受体包含一个或多个醇羟基。例如，半乳糖基受体可以是多元醇。
在本发明的背景下，术语“多元醇”指的是至少包含两个醇羟基的分子。
在本发明的一些优选实施方式中半乳糖基受体不是乳糖。此外，可以优选半乳糖基受体不是葡萄糖。
在本发明的一些优选实施方式中，半乳糖基受体不同于半乳糖基供体。特别优选地，使用相对低廉的半乳糖基供体（如乳糖）作为半乳糖基源，以及生物学相关的受体（如岩藻糖）作为半乳糖基受体。
在本发明的一些实施方式中，半乳糖基受体不是乳糖、半乳糖、或葡萄糖。
在本发明的一些实施方式中，半乳糖基受体不是葡萄糖或通式为Gal-(Gal)i-Glc的寡聚糖，其中i是非负整数，即例如0、1、2、3、或4。
在本发明的一些实施方式中，半乳糖基受体不是半乳糖或通式为Gal-(Gal)i-Glc的寡聚糖，其中i是非负整数。
可以使用具有不同摩尔重量的半乳糖基受体，但是目前优选半乳糖基受体的摩尔重量至少为100g/mol。
在本发明的一些实施方式中，半乳糖基受体的摩尔重量最多为1000g/mol。例如，半乳糖基受体的摩尔重量可以是最多500g/mol。甚至可以优选摩尔重量最多为350g/mol的半乳糖基受体。例如，半乳糖基受体的摩尔重量可以是最多200g/mol。
在本发明的一些优选实施方式中，半乳糖基受体是糖类。例如，半乳糖基受体可以是单糖。可替换地，半乳糖基受体可以是二糖。
例如，半乳糖基受体可以是戊糖。例如半乳糖基受体可以是树胶醛糖（阿拉伯糖，arabinose）。有用的戊糖的另一个实例是木糖。又一个有用的戊糖的实例是核糖。例如，半乳糖基受体可以是选自由阿拉伯糖、木糖、和核糖所组成的组中的戊糖。
己糖类是有用的半乳糖基受体的另一组。例如，半乳糖基受体可以是甘露糖。有用的己糖的另一个实例是半乳糖。又一个有用的己糖的实例是塔格糖。有用的己糖的另一个实例是果糖。例如，半乳糖基受体可以是选自由甘露糖、半乳糖、塔格糖、和果糖所组成的组中的己糖。
在本发明的一些优选实施方式中，半乳糖基受体是脱氧己糖。例如，半乳糖基受体可以是岩藻糖（如，例如，D-岩藻糖、L-岩藻糖、或它们的混合物）。
可替换地，半乳糖基受体可以是寡聚糖，如，例如，二糖或三糖。有用的二糖的实例是麦芽糖。另一个有用的二糖的实例是乳果糖。
半乳糖基受体的又一个有用的基团是糖类衍生物。
在本发明背景下，术语“糖类衍生物”属于含有一个或多个非羟基官能团的糖类。这些官能团的实例是羧基、氨基、N-乙酰氨基基团和/或硫醇基团。因此除非糖类包括上述一些非羟基官能团，否则在1位上含有醛基或在2位上含有酮基的糖类是不考虑的糖类衍生物。
有用的糖类衍生物的实例是N-乙酰基半乳糖胺。有用的糖类衍生物的另一个实例是唾液酸。有用的糖类衍生物的又一个实例是唾液酸化乳糖（多涎乳糖，sialyl lactose）。从而，半乳糖基受体可以是选自由N-乙酰基半乳糖胺、唾液酸、和唾液酸化乳糖所组成的组中的糖类衍生物。
有用的半乳糖基受体的另一个基团是糖醇。从而，在本发明的一些实施方式中，半乳糖基受体是糖醇。有用的糖醇的实例是山梨醇、木糖醇、乳糖醇、和/或麦芽糖醇。
与上述半乳糖基受体相反，发明人已经发现N-乙酰基葡糖胺和葡萄糖是低效的半乳糖基受体。从而，在本发明一些实施方式中，半乳糖基受体不是葡萄糖或N-乙酰基葡糖胺。
混合物可以进一步含有一种或多种不同于第一类型半乳糖基受体的半乳糖基受体。例如，混合物的不同类型的半乳糖基受体可以选自本文中提及的半乳糖基受体类型之中。
在本发明的一些优选实施方式中，产生的半乳糖基化的受体充当新型半乳糖基受体，并且也可以是半乳糖基化的。以这种方式，可以生产其化学计量式为Gali+1X的半乳寡聚糖，其中i是非负整数。通常，最主要的种类是GalX、Gal2X、和Gal3X。
在本发明的其他优选实施方式中，产生的半乳糖基化的受体充当新型半乳糖基受体，并且也可以是半乳糖基化的。以这种方式，可以生产其通式为Gal-(Gal)i-X的半乳寡聚糖，其中i是非负整数。通常，最主要的种类是Gal-X、Gal-Gal-X、和Gal-Gal-Gal-X。
在本发明的一些实施方式中，步骤a）的混合物包含浓度最多为0.7mol/L的半乳糖基供体，优选最多为0.4mol/L，甚至更优选最多为0.2mol/L。例如，混合物可以包含浓度在0.001-0.7mol/L的范围内的半乳糖基供体，优选在0.01-0.5mol/L的范围内，甚至更优选在0.02-0.2mol/L的范围内。
可替换地，步骤a）的混合物包含浓度最多为0.3mol/L的半乳糖基供体，优选最多为0.1mol/L，甚至更优选最多为0.05mol/L。例如，混合物可以包含浓度在0.001-0.2mol/L的范围内的半乳糖基供体，优选在0.005-0.1mol/L的范围内，甚至更优选在0.01-0.05mol/L的范围内。
应当注意的是，半乳糖基化的半乳糖基受体和半乳糖基化的半乳糖基供体可以在一定程度上充当半乳糖基供体，但是在本发明的背景下，不考虑半乳糖基化的半乳糖基受体和半乳糖基化的半乳糖基供体为半乳糖基供体，并且这两者并不计入本文中提及的半乳糖基供体的浓度或比例中。
半乳糖基受体可以以不同的浓度范围使用。然而，优选避免使含半乳糖基受体的混合物饱和，因为通常必须将过量的半乳糖基受体从本发明的含有半乳寡聚糖的组合物中除去。
在本发明的一些实施方式中，步骤a）的混合物包含至少0.05mol/L的量的半乳糖基受体，优选至少0.10mol/L，甚至更优选至少0.30mol/L。可以优选甚至更高浓度的半乳糖基受体，从而，步骤a）的混合物可以包含，例如，至少0.5mol/L的量的半乳糖基受体，优选至少0.7mol/L，甚至更优选至少1mol/L。
例如，混合物可以包含浓度在0.05mol/L-5mol/L的范围内的半乳糖基受体，优选在0.1mol/L-2mol/L的范围内，甚至更优选在0.3mol/L-1mol/L的范围内。
然而，在一些实施方式中，优选相对较低浓度的半乳糖基受体，在这种情况下，例如，混合物可以包含浓度最多为2mol/L的半乳糖基受体，优选最多为0.5mol/L，甚至更优选最多0.2mol/L。例如，混合物可以包含浓度在0.05mol/L-2mol/L的范围内的半乳糖基受体，优选在0.06mol/L-1mol/L的范围内，甚至更优选在0.08mol/L-0.8mol/L的范围内。
除半乳糖基受体和半乳糖基供体之外，混合物还可以含有各种添加剂用于使酶促反应的条件最优化。
例如，混合物可以含有一种或多种pH缓冲液，用于将混合物的pH调节为酶的最适宜pH。可替换地，或此外，混合物可以包含含有一种或多种金属离子的水溶性盐。取决于特定的酶，例如，可以使用金属离子（如Ca2+、Zn2+、或Mg2+）。然而，应注意一些酶类对混合物中存在的金属离子不敏感。
常规合成寡聚糖的方法通常是利用水分活度降低剂，如，例如，丙三醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇（PEG）。有利地，在没有使用这些水分活度降低剂的情况下，本发明使得进行有效合成半乳寡聚糖是可能的。从而，在本发明的一些优选实施方式中，相对于混合物的重量，混合物含有水分活度降低剂的量最多为按重量计5%，优选最多为按重量计1%，甚至更优选最多为按重量计0.1%。例如，相对于混合物的重量，混合物可以含有水分活度降低剂的量最多为按重量计0.05%。
在与酶反应之前，可以对步骤a）的混合物或形成混合物的组分进行热处理，以避免在反应期间微生物的增长。可以使用常用的热处理方法，如巴氏灭菌法（例如，在72℃下15秒）、高温巴氏灭菌法（例如，在90℃下15秒）、或UHT处理（例如，在140℃下4秒）。当对温度不稳定的酶类热处理时应当小心进行。
步骤b）包括提供酶，优选具有β-半乳糖苷酶活性，并且优选T值为最多0.9。应当注意的是，该方法还可以包括使用另外的酶类，例如具有与β-半乳糖苷酶活性或转半乳糖苷活性不同的酶活性的酶类。
在本发明的背景下，术语“β-半乳糖苷酶活性”指的是在β-D-半乳糖苷（如乳糖）中末端的非还原性β-D-半乳糖残基水解的酶促催化。用于本发明的酶优选属于EC 3.2.1.23类。
在本发明的一些实施方式中，酶的T值为最多0.8，优选最多0.7，甚至更优选最多0.6。例如，酶的T值可以为最多0.5。优选酶的T值可以为最多0.4。甚至可以更优选酶的T值为最多0.3。
可以优选甚至更低的T值，如最多0.2。
例如，有用的酶类可以是源自于由SEQ ID NO.1的DNA序列编码的肽。例如，有用的酶类可以源自于的这类肽的实例是具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的肽。
可以在PCT申请WO 01/90,317 A2中找到SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，其中它们称为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。另外，还可以在WO 01/90,317 A2中找到其他有用的酶类。
在本发明的一些优选实施方式中，酶包含相对于SEQ ID NO.2的肽具有至少80%的序列同一性（一致性，identity）的氨基酸序列。例如，酶可以包含相对于SEQ ID NO.2的肽具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，优选至少95%，甚至更优选至少97.5%。在一些情况下，酶可以包含相对于SEQ ID NO.2的肽具有至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的背景下，术语“序列同一性”指的是两个等长的氨基酸序列之间或两个等长的核酸序列之间的同一性程度的定量测度。如果相比较的两个序列不是等长的，那么它们必须按最可能的匹配排列。序列同一性可以按下式计算：
(Nref-Ndif)*100)/(Nref)，
其中Ndif是排列时两个序列中不相同的残基的总数，其中Nref是序列之一的残基的数目。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC将具有75%的序列同一性（Ndif=2，Nref=8）。间隔计算为特定的一个或多个残基的非同一性，即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC将具有75%的序列一致性（Ndif=2，Nref=8）。例如，序列同一性可以利用适当的BLAST程序计算，如由美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的BLASTp算法。
在本发明的其他优选实施方式中，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的肽具有至少80%的序列同一性。例如，酶的氨基酸序列相对于SEQ IDNO.2的肽可以具有至少90%的序列同一性，优选至少95%，甚至更优选至少97.5%。在一些情况下，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的肽可以具有至少99%序列同一性。
在本发明的一些优选实施方式中，酶包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Gly（1752）具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列。例如，酶可以包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Gly（1752）具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，优选至少95%，甚至更优选至少97.5%。在一些情况下，酶可以包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Gly（1752）具有至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的其他优选实施方式中，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Gly（1752）具有至少80%的序列同一性。例如，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Gly（1752）可以具有至少90%的序列同一性，优选至少95%，甚至更优选至少97.5%。在一些情况下，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Gly（1752）可以具有至少99%的序列同一性。从而，例如，酶可以具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Gly（1752）。
在本发明的一些优选实施方式中，酶包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Ile（1174）具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列。例如，酶可以包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Ile（1174）具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，优选至少95%，甚至更优选至少97.5%。在一些情况下，酶可以包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Ile（1174）具有至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的其他优选实施方式中，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Ile（1174）具有至少80%的序列同一性。例如，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Ile（1174）可以具有至少90%的序列同一性，优选至少95%，甚至更优选至少97.5%。在一些情况下，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Ile（1174）可以具有至少99%的序列同一性。
在本发明的一些目前的优选实施方式中，酶具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Ile（1174）。
在本发明的一些优选实施方式中，酶包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列。例如，酶可以包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列，优选至少95%，甚至更优选至少97.5%。在一些情况下，酶可以包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）具有至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的其他优选实施方式中，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）可以具有至少80%的序列同一性。例如，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）可以具有至少90%的序列同一性，优选至少95%，甚至更优选至少97.5%。在一些情况下，酶的氨基酸序列相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）可以具有至少99%序列同一性。从而，例如，酶可以具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）。
在本发明的一些目前的优选实施方式中，酶具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）。
在本发明的一些优选实施方式中，例如，酶可以包含相对于显示在表1中的氨基酸序列具有至少99%的序列同一性的氨基酸序列。例如，酶可以包含显示在表1中的氨基酸序列。可替换地，酶的氨基酸序列相对于显示在表1中的氨基酸序列可以具有至少99%序列同一性。例如，酶可以具有显示在表1中的氨基酸序列。
表1 有用的氨基酸序列（AAS）
在本发明的一些优选实施方式中，例如，酶可以包含相对于显示在表2中的氨基酸序列具有至少99%的序列同一性的氨基酸序列。例如，酶可以包含显示在表2中的氨基酸序列。可替换地，酶的氨基酸序列相对于显示在表2中的氨基酸序列可以具有至少99%的序列同一性。例如，酶可以具有显示在表2中的氨基酸序列。
表2 有用的氨基酸序列（AAS）
在本发明的一些优选实施方式中，例如，酶可以包含相对于显示在表3中的氨基酸序列具有至少99%的序列同一性的氨基酸序列。例如，酶可以包含显示在表3中的氨基酸序列。可替换地，酶的氨基酸序列相对于显示在表3中的氨基酸序列可以具有至少99%的序列同一性。例如，酶可以具有显示在表3中的氨基酸序列。
表3 有用的氨基酸序列（AAS）
在本发明的一些优选实施方式中，例如，酶可以包含相对于显示在表4中的氨基酸序列具有至少99%的序列同一性的氨基酸序列。例如，酶可以包含显示在表4中的氨基酸序列。可替换地，酶的氨基酸序列相对于显示在表4中的氨基酸序列可以具有至少99%的序列同一性。例如，酶可以具有显示在表4中的氨基酸序列。
表4 有用的氨基酸序列（AAS）
在本发明的一些实施方式中，酶可以含有一种或多种糖基化的氨基酸。可替换地，或此外，酶可以含有一种或多种磷酸化的氨基酸。可替换地，酶的氨基酸没有糖基化或磷酸化。
在本发明的一些优选实施方式中，酶包含至少两个亚基，每一个亚基由上文定义的酶组成。
优选地，酶接触混合物并由此使其与半乳糖基受体和半乳糖基供体两者接触。
在本发明的一些优选实施方式中，混合物包含酶。例如，酶可以以溶解的形式存在于混合物中，例如，作为单个的酶分子或作为可溶的酶分子的团聚体。
在本发明的其他实施方式中，将酶从混合物中分离，但是通过使酶与混合物接触使其与半乳糖基受体和半乳糖基供体接触。例如，可以使用固定在固定的固相上的酶。有用的固定的固相的实例是，例如，过滤器、含酶微粒的填充床、或类似的结构。
可替换地，例如，固相可以是自由流动的、微粒的固相，例如，形成混合物的部分的有机珠（微珠，bead）或无机珠。
包括固定技术和合适的固相类型的与酶类的工业用途相关的细节可以在Buchholz（2005）中找到，为了所有目的通过引用将其结合于此。
优选地，使用有足够活性的酶以得到可接受的半乳寡聚糖产率。最佳活性取决于本方法特定实施，本领域技术人员可以容易地决定。
如果需要较高的半乳糖基供体转化量（turn-over）和较高的半乳寡聚糖产率，可以优选使用相对较高活性的酶。例如，酶的活性可以使得半乳糖基供体的转化量至少为0.02mol/(L×h)，优选至少为0.2mol/(L×h)，甚至更优选至少为2mol/(L×h)。
酶促反应在步骤c）期间发生。一旦混合物暴露至合适的条件（其可以是在半乳糖基受体和半乳糖基供体与酶接触时几乎立即进行的）下，转半乳糖苷通常就会开始，并且在本发明的一些实施方式中，步骤b）和步骤c）同时发生。
酶能够释放半乳糖基供体的离去基团并将半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至半乳糖基受体。例如，如果半乳糖基供体是乳糖，那么将葡萄糖释放并将半乳糖基基团转移至受体。在酶促反应期间，酶充当催化剂。
在本发明的一些优选实施方式中，酶进一步将半乳糖基基团转移至已经半乳糖基化的半乳糖基受体，由此产生含有两个、三个乃至更多个半乳糖基基团的半乳糖基受体。
混合物的pH优选接近酶的最适pH。在本发明的一些实施方式中，在步骤c）期间，混合物的pH在pH 3-9的范围内。例如，在步骤c）期间，混合物的pH可以在pH 4-8的范围内，如在pH 5-7.5的范围内。
类似于pH，混合物的温度优选调节至所用酶的最适温度。在本发明的一些实施方式中，在步骤c）期间，温度在10-80℃的范围内。例如，在步骤c）期间，温度在20-70℃的范围内，优选在25-60℃的范围内，甚至更优选在30-50℃的范围内。
在本发明的背景下，术语“酶的最适pH”指的是其中酶具有最高的转半乳糖苷活性的pH。顺着相同的思路，术语“酶的最适温度”指的是其中酶具有最高的转半乳糖苷活性的温度。
本发明人已经发现，本方法出乎意料地提供了半乳寡聚糖的高产率，即使使用相对较低浓度的半乳糖基供体。另外，相对较低浓度的半乳糖基供体降低供体的自半乳糖苷化的程度，即第一半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至第二半乳糖基供体而不是转移至半乳糖基受体。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤c）包括向混合物中加入另外的半乳糖基供体。当使用相对较低浓度的半乳糖基供体时，这是特别优选的。通过加入更多的半乳糖基供体避免在混合物中将半乳糖基供体用尽，并且可以控制在酶促反应期间半乳糖基供体的浓度。
另外的半乳糖基供体的加入可以包括不连续（一次或多次）地加入半乳糖基供体，例如，在酶促反应期间至少一次。可替换地，或另外地，在酶促反应期间，另外的半乳糖基供体的加入可以是连续的加入。另外的半乳糖基供体优选与用于步骤a）的类型相同。
在本发明的一些优选实施方式中，在步骤c）期间，混合物的半乳糖基供体的浓度保持在浓度为0.01-1mol/L的范围内，优选在0.01-0.5mol/L的范围内，优选在0.03-0.3mol/L的范围内。
例如，在步骤c）期间，混合物的半乳糖基供体的浓度可以保持在浓度为0.02-0.1mol/L的范围内。
此外，步骤c）可以包括加入另外的半乳糖基受体。这使得在步骤c）期间控制混合物的半乳糖基受体的浓度是可能的，例如，如果希望，保持半乳糖基受体浓度基本不变。
为了生产大量的含有两个或三个经转移的半乳糖基基团的半乳寡聚糖，本方法应当消耗比半乳糖基受体更多的半乳糖基供体。从而，更多的半乳糖基受体将被半乳糖基化两次或三次。从而，在本发明的一些优选实施方式中，消耗的半乳糖基供体和消耗的半乳糖基受体的摩尔比至少是1:1，优选至少为5:1，甚至更优选至少为10:1。
通常需要富集和/或纯化组合物的半乳寡聚糖，并降低半乳糖基受体、半乳糖基供体和释放的离去基团的浓度。
从而，在本发明的一些优选实施方式中，本方法还包括以下步骤：
d）富集步骤c）的组合物中的半乳寡聚糖。
在本发明的背景下，术语“富集半乳寡聚糖”指的是基于干重，增加组合物中半乳寡聚糖的相对量。这典型地通过除去组合物中的一些其他固体而进行，例如低聚糖类（lower saccharides），以及如果需要，酶也是可选的。
例如，步骤d）的富集可以包括色谱分离和/或纳米过滤。在Walstra等（2006）中描述了关于这些方法的细节，为了所有的目的通过引用将其结合于此。
在本发明的一些实施方式中，富集包括从步骤c）的组合物中除去至少50%（w/w，基于干重）具有摩尔重量最多为200g/mol的分子。例如，富集可以包括从步骤c）的组合物中除去至少80%（w/w，基于干重）具有摩尔重量最多为200g/mol的分子。
在本发明的其他实施方式中，富集包括从步骤c）的组合物中除去至少50%（w/w，基于干重）具有摩尔重量最多为350g/mol的分子。例如，富集可以包括从步骤c）的组合物中除去至少80%（w/w，基于干重）具有摩尔重量最多为350g/mol的分子。
作为替代，或此外，对于富集，可以优选步骤d）包括一种或多种增加组合物中半乳寡聚糖的浓度的方法。例如，有用的富集步骤的实例是逆向渗透、蒸发、和/或喷雾干燥。
例如，通过本方法可以以干粉的形式或以糖浆的形式提供含有半乳寡聚糖的组合物。
典型地，干粉的生产需要一种或多种加工步骤，如浓缩、蒸发、和/或喷雾干燥。从而，在本发明的一些优选实施方式中，步骤d）还包括浓缩、蒸发、和/或喷雾干燥液态形式的组合物以获得粉末形式的组合物。特别优选的是喷雾干燥步骤d）的液态组合物以得到粉末组合物。例如，步骤d）可以包括富集步骤，随后是浓缩步骤，例如，纳米过滤、逆向渗透、或蒸发，随后是喷雾干燥步骤。可替换地，步骤d）可以包括浓缩步骤，随后是富集步骤，随后是喷雾干燥步骤。在富集之前，对组合物的半乳寡聚糖的浓缩可以使随后的富集过程更具有成本效益。
有效的喷雾干燥可以需要加入一种或多种助剂，如麦芽糖糊精、乳蛋白、酪蛋白酸盐、乳清蛋白浓缩物、和/或脱脂奶粉。
例如，本方法可以以分批法实施。可替换地，本方法可以作为分批进料法实施。可替换地，本方法可以作为连续法实施。
此外，本方法可以包括使酶和/或未使用的半乳糖基受体回流到混合物中。例如，回流可以形成步骤d）的部分。例如，步骤d）可以包括从含有半乳寡聚糖的组合物中分离半乳糖基受体和/或酶，以及使半乳糖基受体和/或酶回流至步骤a）、或步骤c）。在分批法或分批进料法的情况下，可以使半乳糖基受体和/或酶回流至下一批的混合物中。
在连续方法情况下，可以使半乳糖基受体回流到相当于步骤a）或步骤c）的生产线部分。酶可以回流到相当于步骤b）或步骤c）的生产线部分。
应当注意的是，与步骤a）和步骤b）相关的细节和特征不需要涉及生产过程的实际的开始，但是在该过程期间应当至少在某一时候发生。然而，在本发明的一些实施方式中，在步骤c）的整个持续时间期间，半乳糖基供体的浓度保持在步骤a）中描述的范围内。
如果作为分批法或分批进料法实施本方法，优选地，当合成开始时，步骤a）涉及混合物的组合物。如果本方法是连续法，优选地，在稳态操作下的合成期间，步骤a）涉及混合物的组合物。
由于可以认识到半乳糖基化的半乳糖基供体是难以从半乳糖基化的半乳糖基受体中分离出的不希望的杂质，半乳糖基化的半乳糖基供体的水平保持尽可能低可以认为是期望的。在本发明的一些优选实施方式中，步骤a）的混合物含有最多0.5mol/L的半乳糖基化的半乳糖基供体。例如，半乳糖基化的半乳糖基供体可以含有最多0.1mol/L的半乳糖基化的半乳糖基供体。甚至更优选半乳糖基化的半乳糖基供体含有最多0.01mol/L的半乳糖基化的半乳糖基供体，优选地，基本没有半乳糖基化的半乳糖基供体。
本发明的又一方面涉及包含半乳寡聚糖类的组合物，该组合物可通过如本文中定义的方法获得。
本发明的另一方面是含有半乳寡聚糖的组合物，例如，上述组合物，所述含有半乳寡聚糖的组合物包含：
-具有通式Gal-X的第一半乳寡聚糖，
-具有化学计量式(Gal)2X的第二半乳寡聚糖，如，例如通式Gal-Gal-X，
-具有化学计量式(Gal)3X的第三半乳寡聚糖，如，例如通式Gal-Gal-Gal-X，以及
其中X是糖基基团，其不是乳糖基或葡糖基。
例如，本文中描述的含有半乳寡聚糖的组合物可以是食品成分。
如上文描述的，优选地，“X”或“-X”是本文中提及的半乳糖基受体之一的糖基基团。
在本发明的一些实施方式中，“X”或“-X”是单糖（不是葡萄糖）的糖基基团。在本发明的其他实施方式中，“-X”是二糖（不是乳糖）的糖基基团。
在本发明的一些优选实施方式中，“X”或“-X”是岩藻糖基基团。在本发明的其他优选实施方式中，“X”或“-X”是半乳糖基基团。
在本发明的一些优选实施方式中，含有半乳寡聚糖的组合物中以下两者之间的摩尔比至少为5:95：
-半乳寡聚糖Gal-X、(Gal)2X、和(Gal)3X的总量，和
-半乳寡聚糖Gal-Glc、Gal2Glc、和Gal3Glc的总量，
例如，上述的摩尔比可以至少为1:4，优选至少为1:1，甚至更优选至少为2:1。甚至可以优选上述的摩尔比至少为5:1，优选至少为10:1，甚至更优选至少为20:1。
在本发明的其他优选实施方式中，含有半乳寡聚糖的组合物中以下两者之间的摩尔比至少为5:95：
-半乳寡聚糖Gal-X、Gal-Gal-X、和Gal-Gal-Gal-X的总量，和
-半乳寡聚糖Gal-Glc、Gal-Gal-Glc、Gal-Gal-Gal-Glc的总量，
例如，上述的摩尔比可以至少为1:4，优选至少为1:1，甚至更优选至少为2:1。甚至可以优选上述的摩尔比至少为5:1，优选至少为10:1，甚至更优选至少为20:1。
含有半乳寡聚糖的组合物根本不含有任何式Gal-Glc、Gal-Gal-Glc、和Gal-Gal-Gal-Glc的半乳寡聚糖甚至是可能的。
在本发明的一些实施方式中，含有半乳寡聚糖的组合物中第一半乳寡聚糖、第二半乳寡聚糖、和第三半乳寡聚糖之间的摩尔比在50-99:1-45:0.5-25的范围内。
在本发明的其他实施方式中，含有半乳寡聚糖的组合物中第一半乳寡聚糖、第二半乳寡聚糖、和第三半乳寡聚糖之间的摩尔比在20-45:20-45:20-45的范围内。
在本发明另外的实施方式中，含有半乳寡聚糖的组合物中第一半乳寡聚糖、第二半乳寡聚糖、和第三半乳寡聚糖之间的摩尔比在0.5-25:1-45:50-98的范围内。
在本发明的一些优选实施方式中，含有半乳寡聚糖的组合物，相对于含有半乳寡聚糖的组合物的总重量，包含总量为按重量计至少10%的第一半乳寡聚糖、第二半乳寡聚糖、和第三半乳寡聚糖。例如，相对于含有半乳寡聚糖组合物的总重量，含有半乳寡聚糖的组合物可以包含总量为按重量计至少10%的第一半乳寡聚糖、第二半乳寡聚糖、和第三半乳寡聚糖，优选为按重量计至少30%，甚至更优选为至少40%。
可以优选甚至更高水平的第一、第二、和第三半乳寡聚糖。从而，在本发明的一些优选实施方式中，相对于含有半乳寡聚糖的组合物的总重量，含有半乳寡聚糖的组合物包含总量为按重量计至少50%的第一半乳寡聚糖、第二半乳寡聚糖、和第三半乳寡聚糖。例如，相对于含有半乳寡聚糖的组合物的总重量，含有半乳寡聚糖的组合物可以包含总量为按重量计至少60%的第一半乳寡聚糖、第二半乳寡聚糖、和第三半乳寡聚糖，优选为按重量计至少70%，甚至更优选相对于含有半乳寡聚糖的组合物的总重量至少80%。
本发明的又一方面涉及包含本文中描述的含有半乳寡聚糖的组合物的食品。
在本发明的一些实施方式中，食品是功能性食品，如婴儿配方或临床营养产品。
在本发明的其他实施方式中，食品是烘焙产品，例如，包含烘焙的面团，如面包或类似的产品。
在本发明另外的实施方式中，食品是乳制品，例如新鲜的乳制品（如牛奶），或发酵乳制品（如酸奶）。
在本发明还另外的实施方式中，食品是宠物食品。
应当注意的是在本发明的一方面的背景下，描述的实施方式和特征也适用于本发明的另一方面。
现在将在下面非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1：制备酶
将含有100mg/L的OD600为3.0的氨比西林（ampicillin）的溶源性肉汤（溶菌肉汤，Lysogeny broth）（LB）培养基中的2mL起子培养物（发酵剂，starter-culture）接种在750mL工作体积的发酵培养基上，培养12小时。在含有2%（w/v）的酵母抽提物、2%（w/v）的大豆蛋白胨、1%（w/v）的葡萄糖、和100mg/L的氨比西林的EC（大肠杆菌）培养基中进行发酵。如较早的（
等，美国专利号6,555,348 B2，实施例1和实施例2）所描述的，制备表达OLGA347 β-半乳糖苷酶的大肠杆菌菌株。发酵罐是来自Applikon的具有2L总体积且安装有两个Rushton桨叶的玻璃圆盘形底容器。在发酵期间，通过加入适当的2M的NaOH和2M的H3PO4将pH保持在pH6.5，并将温度控制在37℃。通过以1-2L/min的速度鼓入空气气泡补充氧，并通过增加搅拌速率使pO2保持在30%。增长后进行离线OD600读数。在29.7的OD600值下增长约10h之后通过离心收获培养物。将650mL培养物的上层清液在-20℃下保存。通过渗透冲击，通过将细胞颗粒再悬浮于200mL的蔗糖缓冲液（30mM的Tris-HCl、40%的蔗糖、2mM的EDTA，pH值为7.5）中，并在室温下温育10min，将胞质的蛋白质从细胞颗粒中分离。在离心之后，弃去上层清液，将颗粒再悬浮于200mL的冷水中。加入83μL饱和的MgCl2溶液，通过离心步骤收集含有胞质蛋白质的上层清液。通过0.2μm的Millipak 40过滤器过滤消毒胞质部分，在-20℃下保存。
根据方案（J.Sambrook and D.W.Russell,Molecular Cloning-Alaboratory manual,3rd edition(2001),pp.17.48-17.51），利用邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（OPNG）作为底物测定200mL的胞质部分和650mL的培养物上层清液的β-半乳糖苷酶活性。大部分活性在胞质部分中发现（525单位，相当于98%）。
实施例2：测定β-半乳糖苷酶的T值
根据下面给出的试验以及公式测定β-半乳糖苷酶的T值。
试验：
制备3.3mL由待测β-半乳糖苷酶、10mM的柠檬酸钠、1mM的柠檬酸镁、1mM的柠檬酸钙、Milli-Q水（Millipore，美国）组成的pH为6.5的酶溶液。酶溶液应当含有的β-半乳糖苷酶的量，足够所加入的33%（w/w）的乳糖在本试验条件下使用1小时。酶溶液的温度应当是37℃。
在时间为T0时，加入82.5mg的一水合乳糖（用于生物化学，Merck，德国）并与酶溶液混合，随后将混合物在37℃温育4小时。在T0之后正好1小时，收集100μL的样品并用Milli-Q水稀释至1:5，通过加热至85℃持续10分钟使样品失活。将失活的混合物保持在-20℃下直至表征。
表征：
产生的半乳糖的量（mol）和使用的乳糖的量（mol）的测定可以利用任何合适的分析技术进行。例如，可以根据Richmond等（1982）和Simms等（1994）描述的方法，通过HPLC分析稀释的混合物。在El Razzi（2002）中描述了其他有用的分析技术。
合适的分析技术的另一个实例是ISO 5765-2:2002(IDF 79-2:2002)“Dried milk，dried ice-mixes and processed cheese-Determination of lactosecontent-Part 2:Enzymatic method utilizing the galactose moiety of thelactose”。
T值的计算：
利用从试验中稀释的混合物的表征获得的数据，根据以下公式计算T值：
实施例-OLGA347酶的T值
利用实施例1的OLGA347酶进行上述的试验。
相对于转化的（即，使用的）乳糖和产生的半乳糖经由分析性HPLC来分析由试验获得的稀释混合物。HPLC装置来自Waters，安装有差示折光计（RI检测器）和BioRad Aminex HPX-87C柱（300x7.8mm，125-0055）。用0.05g/L的醋酸钙，20L的注射体积，以0.3mL/min的流速等度地（匀速，isocratically）进行糖类的洗脱。
将得到的数据通过自动化软件适当地校正基线，逐一地确定并积分各个峰。通过利用一水合乳糖（用于生物化学，Merck，德国）、D-(+)-一水合葡萄糖（用于生物化学，Merck Eurolab，法国）和D-(+)-半乳糖（≥99%，Sigma-Aldrich，意大利）的外标准进行定量。
对于每一个时间T，由量化的数据计算乳糖的转化率和半乳糖的生成率。在时间T=1h，在收集的100μL样品中，已经转化29%的乳糖，这相当于2.3μmol的乳糖。在时间T=1，在收集的100μL样品中，已经形成0.5μmol的半乳糖。因此可以计算T值为0.5μmol/2.3μmol=0.2。
相对于转化的（即，使用的）乳糖和产生的半乳糖也可经由酶法ISO5765-2来分析由试验得到的稀释混合物。使用来自R-Biopharm（目录号10 176 303 035）的Boehringer Mannheim乳糖/D-半乳糖测试试剂盒，并根据方案进行测试。酶法确定了OLGA347酶的T值为0.2。
实施例-常规乳糖酶的T值
利用商购的常规乳糖酶Lactozym Pure 2600L（Novozymes，丹麦）进行上述试验。如对于OLGA347酶所描述的，分析由试验获得的稀释混合物。不存在三糖和四糖的可检测量，可以检测出等量的葡萄糖和半乳糖。相应的T值是1。
也已测定来自大肠杆菌（产品号：G6008，Sigma-Aldrich，德国）和米曲霉菌（产品号：G5160，Sigma-Aldrich，德国）的商购β-半乳糖苷酶的T值，两种酶类的T值约为1。
实施例3：通过连续加入供体分子合成含有L-岩藻糖基的异半乳寡聚
糖（hetero-galacto-oligosaccharides）
将700mg的L-(-)-岩藻糖（99%，Sigma-Aldrich，斯洛伐克）和20mg的一水合乳糖（用于生物化学，Merck，德国）溶解在5mL的缓冲液（10mM的柠檬酸钠，20mM的Na2HPO4，pH 6.5）中，并保持在37℃的温度下。加入2mL如实施例1制备的OLGA347酶。该时间定义为T=0。在6h的时间段期间，每隔30min加入20mg的一水合乳糖。在时间T=0、1、2、3、4、5、和7h，各得到100μL的样品。如实施例2，进行样品的获取和表征。用Agilent 1100 API-ES LC/MSD四极杆扫描在100至1000amu之间的质量（气体温度：350℃，干燥气流：13.0L/min，雾化器压力：60psig）来进行质谱分析。由溶液中的分析物和钠阳离子之间的复合（络合，complexation）产生检测离子，得到检测质量为M(Na+)=M+23Da。
T=0h和T=7h的HPLC色谱分别在图1a和图1b中给出。已经通过MS（未显示数据）确定了峰并在图中标注。图标：1=乳糖、2=葡萄糖、3=半乳糖、4=L-岩藻糖、5=蔗糖、6=Gal-Fuc二糖、7=Gal-Gal-Fuc和Gal-Gal-Glc三糖、8=Gal-Gal-Gal-Fuc和Gal-Gal-Gal-Glc四糖。在图中可以看出葡萄糖和半乳糖的浓度增加，并且葡萄糖的量约为半乳糖的4倍。这符合半乳糖用作形成半乳寡聚糖的供体分子以及剩余的葡萄糖释放至溶液中的假设。由于持续加入乳糖，乳糖浓度的增加。该峰也包含在酶促反应中形成的异乳糖和Gal-Gal二糖。此外，形成了Gal-Fuc二糖、Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Fuc三糖、以及Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Fuc四糖。
对于乳糖、葡萄糖、和半乳糖，计算的峰面积作为时间的函数的图在图2中给出。图标：菱形=乳糖、十字形=葡萄糖、三角形=半乳糖。可以看出，乳糖、异乳糖、和Gal-Gal二糖的浓度增加，而且由于在酶促反应期间葡萄糖被释放至溶液中，葡萄糖的浓度线性增加。相对于葡萄糖，半乳糖的浓度较低，浓度仅缓慢增加。这表明由乳糖分解而提供的几乎所有的半乳糖已经用于形成半乳寡聚糖。此外，在实验过程期间，L-岩藻糖的浓度降低，这是由于在酶促反应中将L-岩藻糖用作受体分子以形成半乳寡聚糖（未显示数据）。
图3显示了对于酶促反应的产物，所计算的峰面积作为时间的函数的图。图标：星号=Gal-Fuc二糖、圆点=Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Fuc三糖、空心正方形=Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Fuc四糖。形成了Gal-Fuc二糖、三糖、和四糖。三糖的形式是Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Fuc，四糖的形式是Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Fuc。
Gal-Fuc二糖的浓度线性增加，并从T=6h至T=7h显示出达到平稳的趋势。Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Fuc三糖的浓度线性增加，并从T=4h显示出指数增加的趋势。Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Fuc四糖的浓度线性增加。
基于在T=7h下的HPLC和MS数据推算含有L-岩藻糖的半乳寡聚糖的量（总糖类的w/w）：Gal-Fuc=8%，Gal-Gal-Fuc=3%，Gal-Gal-Gal-Fuc=1%。总计，在T=7h的反应时间之后含有L-岩藻糖的半乳寡聚糖为12%。在通过色谱法除去游离的L-岩藻糖后，含有L-岩藻糖的半乳寡聚糖的计算量是28%。
实施例4：含有D-岩藻糖的异半乳寡聚糖的合成
将110mg的D-(+)-岩藻糖（≥98%，Sigma-Aldrich，斯洛伐克）和55mg的一水合乳糖（用于生物化学，Merck，德国）溶解在1mL缓冲液（10mM的柠檬酸钠，20mM的Na2HPO4，pH6.5）中。加入100μL如实施例1制备的OLGA347酶。该时间定义为T=0。在时间T=0、2、4、6、和22h下，各得到100μL的样品。如实施例2进行样品的获取和HPLC表征。如实施例3，进行MS表征。
图4显示了对于酶促反应的产物，所计算的峰面积作为时间的函数的图。图标：星号=Gal-Fuc二糖、圆点=Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Fuc三糖、空心正方形=Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Fuc四糖。形成了Gal-Fuc二糖、三糖、和四糖。三糖的形式是Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Fuc，四糖的形式是Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Fuc。
从T=0至T=6h，Gal-Fuc二糖的浓度显示出最大的增加。从T=6至T=22h，增长率较低。从T=0至T=6h，Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Fuc三糖的浓度显示出第二大的增加。从T=6至T=22h，浓度下降至T=4h的水平。从T=0至T=6h，Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Fuc四糖的浓度增加。从T=6至T=22h，浓度下降至T=4h的水平。
基于来自T=22h的HPLC和MS数据推算含有D-岩藻糖的半乳寡聚糖的量（总糖类的w/w）。Gal-Fuc=20%。Gal-Gal-Fuc=6%，以及Gal-Gal-Gal-Fuc=1%。总计，在T=22h的反应时间之后含有D-岩藻糖的半乳寡聚糖为27%。在通过色谱法除去游离的D-岩藻糖后，含有D-岩藻糖的半乳寡聚糖的计算量是55%。
实施例5：含有N-乙酰基半乳糖胺的异半乳寡聚糖的合成
如在实施例4中，仅用110mg的N-乙酰基半乳糖胺（GalNAc）（98%，Sigma-Aldrich，德国）作为受体分子进行实验。在时间T=0、4、6、和23h，各得到100μL的样品。如在实施例2中，进行样品获取和HPLC表征。如在实施例3中，进行MS表征。
图5显示了对于酶促反应的产物，所计算的峰面积作为时间的函数的图。图标：星号=Gal-GalNAc二糖、圆点=Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-GalNAc三糖、空心正方形=Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-GalNAc四糖。形成了Gal-GalNAc二糖、三糖、和四糖。三糖的形式是Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-GalNAc，四糖的形式是Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-GalNAc。
从T=0至T=23h，Gal-GalNAc二糖的浓度线性增加，并且半乳寡聚糖在T=23h为最大量。Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-GalNAc三糖的浓度从T=0至T=4h显示了最大的增加。从T=4至T=23h，浓度的增长率较低，并几乎达到Gal-GalNAc在T=23h下的水平。从T=0至T=23h，Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Fuc四糖的浓度增加，并且从T=0至T=4h增加最大。
基于来自T=23h的HPLC和MS数据推算含有N-乙酰基半乳糖胺的半乳寡聚糖的量（总糖类的w/w）。Gal-GalNAc=8%，Gal-Gal-GalNAc=5%，Gal-Gal-Gal-GalNAc=2%。总计，在T=23h的反应时间之后含有GalNAC的半乳寡聚糖为15%。在通过色谱法除去游离的GalNAc后，含有N-乙酰基半乳糖胺的半乳寡聚糖的计算量是40%。
实施例6：含有木糖基的异半乳寡聚糖的合成
如在实施例4中，仅用110mg的D-(+)-木糖（99%，Sigma-Aldrich，美国）作为受体分子进行实验。在时间T=0、5、和23h，各得到100μL的样品。如在实施例2中，进行样品的获取和HPLC表征。如在实施例3中，进行MS表征。
图6显示了对于酶促反应的产物，所计算的峰面积作为时间的函数的图。图标：星号=Gal-Xyl二糖、圆点=Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Xyl三糖、空心正方形=Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Xyl四糖。形成了Gal-Xyl二糖、三糖、和四糖。三糖的形式是Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Xyl，四糖的形式是Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Xyl。
Gal-Xyl二糖的浓度从T=0至T=5h显示了最大的增加。从T=5至T=23h，浓度下降至T=4h的水平。从T=0至T=5h，Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Xyl三糖的浓度显示了第二大的增加。从T=5至T=23h，浓度下降至T=4h的水平。从T=0至T=5h，Gal-Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Fuc四糖的浓度增加。从T=5至T=23h，在可观察到的水平下浓度没有变化。
基于来自T=23h的HPLC和MS数据推算含有木糖基的半乳寡聚糖的量（总糖类的w/w）。Gal-Xyl=15%。Gal-Gal-Xyl=3%。Gal-Gal-Gal-Xyl=0.5%。总计，在T=23h的反应时间之后含有木糖基的半乳寡聚糖为18.5%。在通过色谱法除去游离的木糖后，含有木糖基的半乳寡聚糖的计算量是41%。
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Claims (15)
1.一种包含一种或多种半乳寡聚糖的组合物的生产方法，所述方法包括以下步骤：
a）提供包含以下的混合物
-包含结合至离去基团的半乳糖基基团的半乳糖基供体，所述半乳糖基供体的摩尔重量最多为350g/mol，
-不同于所述半乳糖基供体的半乳糖基受体，
所述半乳糖基受体是糖类或糖醇，以及
其中所述半乳糖基受体和所述半乳糖基供体之间的摩尔比至少为1:10，并且其中所述混合物包含至少0.05mol/L的所述半乳糖基受体，
b）提供具有β-半乳糖苷酶活性和具有最多为0.9的T值的酶，所述酶与所述混合物接触，以及
c）使所述酶释放所述半乳糖基供体的所述离去基团，并将所述半乳糖基供体的所述半乳糖基基团转移至所述半乳糖基受体，从而形成所述半乳寡聚糖，由此获得包含所述半乳寡聚糖的所述组合物。
2.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述半乳糖基供体的所述离去基团是糖基基团。
3.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述酶包含：
-相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列，或
-相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Ile（1174）具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列，或
-相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met（1）至Gly（1752）具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列，或
-相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述酶包含相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述酶具有相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述酶具有SEQID NO.2的氨基酸序列Val（33）至Ile（1174）。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，步骤c）包括加入另外的半乳糖基供体。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，在步骤c）期间，所述混合物的半乳糖基供体的浓度保持在浓度为0.01-1mol/L的范围内。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，还包括以下步骤：
d）富集步骤c）的所述组合物中的所述半乳寡聚糖。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述富集包括色谱分离和/或纳米过滤。
11.一种可通过根据权利要求1-10中的任一项所述的方法获得的含有半乳寡聚糖的组合物。
12.一种含有半乳寡聚糖的组合物，包含：
-具有通式Gal-X的第一半乳寡聚糖，
-具有通式Gal2X的第二半乳寡聚糖，以及
-具有通式Gal3X的第三半乳寡聚糖；
其中X是糖基基团，其不是乳糖基或葡糖基，
并且其中，以下两者之间的摩尔比至少为5:95：
-所述半乳寡聚糖Gal-X、Gal2X、和Gal3X的总量，和
-所述半乳寡聚糖Gal-Glc、Gal2Glc、Gal3Glc的总量。
13.根据权利要求11或12所述的含有半乳寡聚糖的组合物，其中，所述第一半乳寡聚糖、所述第二半乳寡聚糖、和所述第三半乳寡聚糖之间的摩尔比是50-99:1-45:0.5-25。
14.根据权利要求11-13中的任一项所述的含有半乳寡聚糖的组合物，相对于所述含有半乳寡聚糖的组合物的总重量，包含所述第一半乳寡聚糖、第二半乳寡聚糖、和第三半乳寡聚糖的总量为按重量计至少10%。
15.一种包含根据权利要求11-14中的任一项所述的含有半乳寡聚糖的组合物的食品。
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