CN103079561A - 用于预防hsv-2传播的局部用抗病毒制剂 - Google Patents

用于预防hsv-2传播的局部用抗病毒制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及适合于局部施用的抗病毒化合物、特别是[2-(6-氨基-嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基甲基]-膦酸(替诺福韦，PMPA)的制剂及其在减少或预防单纯疱疹病毒获得和传播中的应用。

Description

用于预防HSV-2传播的局部用抗病毒制剂
本申请要求2010年6月11日提交的美国临时专利申请顺序号US61/354,050、2010年6月23日提交的美国临时专利申请顺序号US61/357,892和2010年12月22日提交的美国临时专利申请顺序号US61/426,373的优先权，将每篇文献的全部内容引入本文参考。
发明领域
本发明一般涉及具有抗病毒活性的化合物的制剂，其用于预防单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、特别是HSV-2的获得和传播。
发明背景
人免疫缺陷病毒(HIV)感染和相关疾病是世界范围内的主要公共卫生问题。尽管已经通过用抗病毒药治疗在延长AIDS患者生命方面进行了大量研究，但是无法完全治愈。
单纯疱疹病毒2型(HSV-2)是另一种世界范围内的主要公共卫生问题的疾病。据估计HSV-2存在于全世界20%的性活动成年人中，且在载有HIV的男性和女性中，HSV-2感染发生率可以上升至80%。它是生殖器溃疡病最常见的原因，但大部分几乎无症状。
已经证实在性传播HIV和HSV-2的疾病流行之间存在重要的关联，即HSV-2的存在有利于获得HIV。例如，参见Lawrence Corey等的“The Effects of Herpes Simplex Virus-2 on HIV acquisition andTransmission”,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.,2004；35(5)，其中该文献公开了，超过30种流行病学研究已经证实流行性HSV-2与2至4倍HIV传播和获得的增加风险相关。
因此，针对HIV/AIDS获得和相关疾病问题的一种手段可以在于减少HIV和HSV-2传播风险，以便减少成为新感染的个体数量。此外，得知在许多国家中，与男性相比，女性不均衡地受到HIV感染侵害(据估计HIV从男性传播给女性比女性传播给男性的效力高7-倍)，优选的方法可以是提供有效针对HIV和HSV-2的组合物并且可以由女性使用，其配偶许可或了解，也可以没有其配偶的许可或了解。
[2-(6-氨基-嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基甲基]-膦酸(替诺福韦,PMPA)是众所周知的具有有效抗逆转录病毒活性的化合物，其用于治疗具有AIDS的患者。例如，参见WO2006/017044，其中公开了替诺福韦凝胶制剂。近期在南非使用这种替诺福韦凝胶制剂的临床试验结果证实了该制剂有效地预防HIV传播的主张(Abdool Karim等,Science 2010；329:1168-1174)，并且还证实相同的替诺福韦凝胶制剂有效地阻断和/或预防HSV-2传播。这是令人意外的，得知尽管在先的公开文献已经显示已知替诺福韦是有效的抗逆转录病毒药，但是预先并不了解它有效地作为抗疱疹药(例如，参见“DifferentialAntiherpesvirus and Antiretrovirus effects of the (S)and(R)Enantiomers of Acyclic Nucleoside Phosphonates”,AntimicrobialAgents and Chemotherapy,1993年2月,p312-338,J.Balzarini等,Noesans等,Antiviral Chemistry and Chemotherapy 8(1),p1-23(1977)和De Clerq等,Clinical Microbial Reviews,Vol.16,No 4,p569-596(2003)。
发明概述
本发明涉及具有抗病毒活性的化合物、特别是[2-(6-氨基-嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基甲基]-膦酸(替诺福韦,PMPA)的适合于局部(例如阴道、直肠等)施用的制剂及其在阻断和/或预防HSV-1和HSV-2感染获得和传播中的应用。
在一个实施方案中，所述制剂是凝胶，其通过阴道施用于人类女性。在性活动前、或性活动后、或在性活动前后施用该凝胶，每日一次或两次。该凝胶制剂的一个实施方案包含替诺福韦、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、乙二胺四乙酸二钠、甘油、柠檬酸和净化水至100%的混合物，其中添加了少量10%w/w氢氧化钠和10%w/w稀盐酸以调整pH至约4.4。在一个实例中，该凝胶制剂包含：
Figure BDA00002560367800031
其中添加了少量10%w/w氢氧化钠和10%w/w稀盐酸以调整pH至约4.4。
该凝胶制剂的一个实施方案包含：
Figure BDA00002560367800032
其中添加了少量10%w/w氢氧化钠和10%w/w稀盐酸以调整pH至约4.4的目标。
该凝胶制剂的第二个实施方案包含：
Figure BDA00002560367800041
其中添加了少量10%w/w氢氧化钠和10%w/w稀盐酸以调整pH至约4.4的目标。
该凝胶制剂的第三个实施方案包含：
Figure BDA00002560367800042
其中添加了少量10%w/w氢氧化钠和10%w/w稀盐酸以调整pH至约4.4的目标。
该凝胶制剂的第四个实施方案包含：
其中添加了少量10%w/w氢氧化钠和10%w/w稀盐酸以调整pH至约4.4的目标。
本发明的另一个实施方案涉及(R)-(1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基氧基)甲基膦酸，其用于减少或预防HSV-2向哺乳动物传播和用于减少或预防哺乳动物获得HSV-2，特别是其中将(R)-(1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基氧基)甲基膦酸配制成凝胶，其中该制剂包含：
Figure BDA00002560367800052
本发明一般地涉及预防和/或减少通过性活动传播HSV-1和HSV-2危险的组合物和方法。虽然本发明组合物主要地涉及异性的性行为（即男性/女性阴道的性交），也可被从事其他类型的性行为的各方使用。例如，本发明组合物能被从事肛交的各方使用（男性/女性或男性/男性）；意图用于肛交的本发明组合物优选被修饰，以调整缓冲容量至直肠中正常存在的pH值以及改变制剂的润滑性。
对于阴道的异性间性交，可以在性交前将本组合物插入阴道。对于肛交(异性的或同性的)，可以在性交前将本组合物插入直肠。对于阴道的或肛门的性交，本组合物也可以用作润滑剂。为了增加防护，通常优选在性交前或其他性活动前应用本组合物和，如果适当，使用避孕套。为了更进一步的防护，在性活动完成后可以尽可能早地再使用本组合物。
如果想要，矫味剂、香味剂（scents）、芳香剂和着色剂可以掺入本组合物中，只要它们不干扰本组合物的安全性或有效性。的确，将这样的矫味剂、香味剂、香料和着色剂掺入本发明组合物中可以增加性活动期间将会使用本组合物的机率。
本方法的一个优点是它能够在广泛的多种由异性、两性和同性爱者进行的性活动(阴道的或肛门的)过程中用于防护。本方法减少HIV、HSV-1和HSV-2传播的另一个优点是这种方法可以由被插入的一方极其容易地实施和/或使用。因此，在伴侣有或没有认可所用本方法的情况下，妇女均可使用本方法保护她自己(以及其伴侣)。而且，伴侣将不被要求信赖于他或她的伴侣声称没有AIDS或同意使用避孕套防护。任一性方或性两方(尤其是女性参与者)能够开始并完成本方法的使用。优选本方法在性活动前使用，最优选在性活动前和性活动后都使用。
详细描述
近来，将广泛用于HIV疗法的高度选择性和有效性核苷酸HIV逆录酶(RT)抑制剂替诺福韦配制成1%凝胶并且在使用约900位非洲妇女的双盲安慰剂对照的研究中进行测试，而不是测试作为潜在的杀微生物剂的新化合物。这种试验结果显示HIV-1的性传播频率总体下降了39%。这种预防效应在高度坚持替诺福韦治疗的妇女中的传播下降进一步增加至54%。因此，这种试验成为有说服力地减少HIV-1传播的杀微生物剂的第一个实例。
令人意外地，在本试验中还观察到单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的获得风险显著地下降了51%。这一观察结果是重要的，因为HSV-2是有利于HIV传播（推定通过诱导生殖器溃疡和炎症进行）的HIV-1共病原体（copathogen）。这种替诺福韦凝胶对HSV的效应是不曾预料的，因为预先已经证实这种高度有效的逆转录病毒和抗疱疹病毒药物在体外对HSV和大部分其他DNA病毒显示的活性最低(如果有的话)。
本研究提供了证据，即在通过经阴道内局部施用1%替诺福韦凝胶达到的浓度与抑制多种细胞系和初级细胞类型中HSV-1和HSV-2复制的那些浓度等效。因此，在临床试验中观察到的替诺福韦的抗疱疹活性是其直接抗疱疹效应的结果。
现在详细描地涉及本发明的一些实施方案。尽管结合举出的实施方案描述了本发明，但是可以理解，它们不意欲将本发明限于那些实施方案。相反，本发明意欲覆盖所有可替代选择的方案、变型和等效方案，它们可以包括在如权利要求所定义的本发明范围内。
定义
除非另有说明，本文所使用的下列术语和短语打算具有以下的含义：
术语“治疗有效量”是指当对受试者给药以治疗疾病时足以有效治疗该病的化合物的用量。“治疗有效量”可以根据化合物、疾病及其严重性、所治疗受试者的年龄、体重等的不同而改变。
“生物利用度”是药物活性剂引入体内后，该活性剂可被靶组织利用的程度。提高药物活性剂的生物利用度能够为患者提供更有效率的和更有效的治疗，因为，对于给定的剂量，在靶组织位置将有更多的药物活性剂可利用。
本发明组合的化合物可以称作"活性成分"或“药物活性剂”。
PMPA或替诺福韦(美国专利第4,808,716、5,733,788、6,057,305号)具有如下结构：
Figure BDA00002560367800081
PMPA，替诺福韦的化学名称包括：(R)-9-(2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤；(R)-(1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基氧基)甲基膦酸；和膦酸，[[(1R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]。CAS登记号为147127-20-6。
二磷酸替诺福韦具有如下结构：
Figure BDA00002560367800082
且命名为(R)-(1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基氧基)甲基膦酸二磷酸酐。
在另一个实施方案中，本发明涉及对肛门局部施用制剂。在另一个实施方案中，本方法可以通过口服施用抗病毒化合物进行。口服施用适合于通过施用漱口水或含漱液形式的组合物进行。口服施用尤其优选用于预防牙科操作过程中的感染。适合地，恰在开始牙科操作前和在操作自始至终定时施用所述组合物。
本发明还包括为气雾剂、泡沫、凝胶剂、霜剂、栓剂、片剂、棉塞等的制剂和涂覆了该制剂的避孕套的应用。在一个优选的实施方案中，给避孕套涂覆润滑剂或渗透促进剂，其包含抗病毒化合物，优选替诺福韦。润滑剂和渗透促进剂描述在美国专利号US4,537,776、US4,552,872、US4,557,934、US4,130,667、US3,989,816、US4,017,641、US4,954,487、US5,208,031和US4,499,154中，将这些文献引入本文参考。
实施例
下面的实施例进一步描述和证实在本发明范围内的具体实施方案。给出这些实施例仅仅是用于举例说明而不应解释为限制，因为在没有偏离本发明的精神和范围的情况下，完全可能有许多的变型。下面的实施例仅打算用于举例说明，而不想以任何方式限制本发明的范围。“活性成分”表示一种或多种如上面所定义的NRTIs，优选替诺福韦或其生理学功能衍生物。
材料和方法
细胞.在补充了10%胎牛血清(FCS)、1%L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和1%丙酮酸钠的MEM Earle培养基(Gibco,InvitrogenCorporation,UK)中培养人胚肺(HEL)成纤维细胞(HEL-299；ATCCCCL-137)。初级人角化细胞(PHKs)分离自新生儿包皮。将组织片段与胰蛋白酶-EDTA一起在37°C温育1h。分离上皮细胞并且在包含如下补充剂的角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM)(Gibco,Invitrogen Corporation,UK)中培养：0.5μg氢化可的松/ml、10ng表皮生长因子/ml、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、1x 10-10M霍乱毒素、5μg胰岛素/ml、5μg人转铁蛋白/ml和15x 10-4mg 3,3’,5-三碘-2-甲状腺氨酶/ml。PHKs用于单层中的抗病毒测定并且用于制备器官特征性卵筏培养物。TZM-bl细胞由Dr.G.Van Ham(ITG,Antwerp,Belgium)友情提供。
病毒.HSV-1菌株KOS和F和HSV-2菌株G和MS用作参比疱疹病毒。使用几种HSV-1野生型(wt)[RV-6,RV-132,RV-134,C559143]、HSV-1胸苷激酶缺乏(TK-)[RV-36,RV-117,328058]、HSV-2wt[RV-24,RV-124,NA,PB,NS,HSV-47]和分离自比利时病毒感染个体的HSV-2TK-[RV-101,RV-129,19026589,LU,HSV-44]临床菌株。HIV-1菌株IIIB由R.C.Gallo提供(那时在National Institutesof Health,Bethesda,MD)。
化合物.化合物来源如下：阿昔洛韦[ACV,9-(2-羟基乙氧基甲基)鸟嘌呤],GlaxoSmithKline,Stevenage,UK；更昔洛韦[GCV,9-(1,3-二羟基-2-丙氧基甲基)鸟嘌呤,Roche,Basel,Switzerland；喷昔洛韦[PCV,9-(4-羟基-3-羟基甲基丁-1-基)鸟嘌呤],Aventis,Frankfurt,Germany；溴夫定[(E)-5-(2-溴乙烯基)-1(-D-2’-脱氧呋喃核糖-1-基-尿嘧啶,BVDU),Searle,UK；(S)-HPMPC[西多福韦,CDV,(S)-1-(3-羟基-2-膦酰基甲氧基丙基)胞嘧啶],PMEA,[阿德福韦,ADV,9-[2-(膦酰基甲氧基乙基)腺嘌呤]和(R)-PMPA[替诺福韦,TFV,(R)-9-[2-(膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤]]Gilead Sciences,Foster City,CA.二磷酸替诺福韦(TFV-DP)和三磷酸阿昔洛韦(ACV-TP)，它们获自MoravekBiochemicals,Brea,CA。
放射化学试剂.[3H]替诺福韦(放射特异性：15Ci/mmol),[8-3H]dGTP(放射特异性：17.9Ci/mmol)和[2,8-3H]dATP((放射特异性：153Ci/mmol)来自Moravek Biochemicals(Brea,CA)。
HSV致细胞病变效应(CPE)减少测定.HEL和PHK细胞用于进行CPE减少测定。将两种细胞类型在96-孔微量滴定板中其相应的生长培养基中培养。使汇合的单层感染每种病毒菌株100 CCID50(1CCID50相当于感染50%细胞培养物的病毒储备稀释)。该培养基用于HEL细胞中的病毒感染和生长，是包含2%FCS的MEM Earle培养基。2-h吸附期后，除去残留的病毒并且将感染细胞在包含测试化合物顺序稀释液的培养基中进一步温育(一式两份)。2－3天温育时间后，目视评价病毒的致细胞病变性(CPE)并且测定50%有效浓度[EC50，将病毒CPE降低50%所需的化合物浓度]。将对每种病毒菌株的测试的化合物的EC50计算为至少两次独立实验的平均值。按照类似方式在PHKs中进行测定，除了Dulbecco-F12培养基[1/3HAM F12和2/3Dulbecco改进的Eagle培养基的混合物，其补充了10%胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、1mM谷氨酰胺、5ml 100×抗生素-抗真菌药/升(Gibco,Invitrogen Corporation)]用于病毒感染和病毒吸附后加入角化细胞-SFM和Dulbecco-F12培养基的50/50(v/v)混合物。
初级单核细胞/巨噬细胞细胞培养物的疱疹病毒感染.人外周血单核细胞(PBMCs)获自通过Ficoll–Hypaque密度梯度离心的健康血清阴性供体血液。将PBMCs重新混悬于补充了20%热灭活的(56°C,30min)胎牛血清(FCS)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100mg/L)和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640培养基，然后接种入48-孔培养板(1.8x106细胞/孔)。通过在塑料上粘着分离单核细胞/巨噬细胞(M/M)的细胞。5天后，通过反复适度用温热培养基洗涤谨慎除去未粘着细胞，且将粘着(95%纯)M/M再培养3天至成熟并且形成单层。使对HSV-2的致细胞病变效应高度敏感的非洲绿猴纤维母细胞样肾(Vero)细胞生长在补充了10%热灭活的FCS的RPMI培养基中并且用于感染病毒滴度测定。为了评价替诺福韦在人巨噬细胞中的抗-HSV2活性，在感染前1小时将该化合物以递增浓度(0.04、0.2、1、5、20、100或500μg/ml)加入到巨噬细胞中。类似地，用不同浓度的阿德福韦(0.04、0.2、1、5、20或100μg/ml)或阿昔洛韦(0.008、0.04、0.2、1、5、20或100μg/ml)用作对照药物处理巨噬细胞培养物。
然后在测试化合物的存在下用HSV-2(100 CCID50)感染巨噬细胞培养物。2hrs病毒吸附后，充分洗涤该培养物以除去任何残留的病毒颗粒。然后向该培养物中加入新鲜培养基和指定浓度的化合物。在本实验自始至终维持替诺福韦、阿德福韦和阿昔洛韦。还对每次实验运行适合的阳性(感染、但未处理的M/M)和模拟感染的阴性(未感染的和未处理的M/M)对照组。全部测定一式三份进行。每日通过显微镜观察监测对巨噬细胞的致细胞病变效应并且在感染后5-6天时达到完成。因此，感染后6天评价化合物对HSV-2复制的潜在抑制作用。通过对Vero细胞培养物进行传统的有限稀释测定来测定上清液中感染病毒的量。根据Reed和Muench方法计算产生的病毒滴度并且表示为50%组织培养物感染剂量/ml(TCID50/ml)。
以%表示抑制能力并且相对值100进行计算，所述值100为病毒感染的未处理的培养物中的病毒产量。
TZM-bl细胞共同感染HIV-1和HSV-2。TZM-bl细胞系来源于HeLa细胞并且表达高水平的CD4、CCR5和CXCR4。此外，用LTR-驱动的荧火虫荧光素酶和大肠杆菌–半乳糖苷酶基因(15)稳定转导该细胞系。在96-孔托盘中，在第1天时接种10,000TZM-bl细胞。在第2天，抽吸上清液并且将100μl的替诺福韦顺序稀释液加入到细胞培养物中。接下来给予包含HIV-1(NL4.3)、HSV-2(G)或它们两者的100μl病毒混悬液。感染后2－3天，基于荧光素酶活性测定监测HIV-1感染。就这种方式而言，取出100μl培养物上清液并且加入100μlBright-Glo荧光素酶测定底物(Promega,Madison,USA)。使用Safire 2微量滴度板读出器(Tecan,
Figure BDA00002560367800121
Switzerland)测定发光信号。还包括仅包含模拟感染的细胞的对照条件以测定背景发光水平。感染后3天，基于巨大细胞形成用显微镜记录HSV-2-诱导的致细胞病变性。
器官特征性上皮卵筏培养物.为了制备表皮等效物，用在冰上混合了10-倍浓度的HAM’s F12培养基、10-倍再溶解缓冲液和Swiss 3T3J2成纤维细胞的胶原蛋白制备胶原蛋白基质溶液。将1毫升胶原蛋白基质溶液倾入24-孔微量滴定板的各孔。在37°C与1ml生长培养基凝胶平衡过夜后，将2.5x105 PHK细胞接种在凝胶上部并且维持浸没24-48小时。升起胶原蛋白卵筏并且置于空气与液体培养基之间的界面上的不锈钢格架上。生长培养基是1/3HAM F12和2/3Dulbecco改进的Eagle培养基的混合物，其中上清液与用于Keratinocyte-SFM的上清液相同。使上皮细胞分层，每2-3天替换一次培养基。为了评价化合物在卵筏系统中的抗病毒效应，平行运行两个系列的卵筏，一个用于组织学检查，另一个用于通过噬菌斑减少测定对病毒产生进行定量。在升起后10天使卵筏感染5,000 PFU HSV-1(KOS)或HIV-2(G)菌株，然后用包含不同化合物稀释液的培养基替代该培养基。2天后和3天后改变包含不同浓度化合物的培养基(分化15天后)，将一个系列的卵筏固定在10%缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，用苏木素和曙红染色，以便组织学检查。另一个系列的卵筏用于定量病毒产生。为了该目的，将每一卵筏冷冻在3ml磷酸缓冲盐水(PBS)中并且融化以从感染上皮细胞中释放病毒。通过以1,800rpm离心使上清液澄清，通过HEL细胞培养物中的噬菌斑测定滴定。然后计算每一卵筏中的病毒产量。两个卵筏用于每种药物浓度以测定化合物对病毒收率的作用。
人离体组织.人扁桃体组织获自在Children’s National MedicalCenter(Washington,DC)IRB-批准的方案下进行常规扁桃体切除术的患者。子宫颈组织通过National Disease Research Interchange(NDRI,Philadelphia,PA)得到。将组织切成约8-mm3块并且如上所述置于培养基中空气-液体界面上的胶原蛋白海绵凝胶上(16)。简言之，在包含15%热灭活胎牛血清(FCS；Gemini Bio-Products,Woodland,CA)的RPMI 1640(GIBCO BRL,Grand Island,NY)培养基中培养组织块。
扁桃体组织:对每种实验条件而言，给27个组织块(9块/孔/3ml完全培养基)接种置于每个组织块上部的5μL HSV-1(菌株F)或HSV-2(菌株G和MS)(ATCC)的病毒储备溶液。共同感染实验通过给组织块依次接种5μL HSV-2(菌株G)和5μL(0.5ng p24)X4LAI.04(获自Rush University Virology Quality Assurance Laboratory(Chicago,IL))来进行。在使用扁桃体组织的全部实验中，在病毒感染前12h向培养基中加入替诺福韦并且在每次培养基改变时补足。
子宫颈-阴道组织:就每一实验条件而言，在37°C将16个组织块浸入500μl HSV-2(菌株G)混悬液2小时，用PBS洗涤3次，然后置于明胶海绵卵筏上。在感染过程中加入替诺福韦并且在每次培养基改变时补足。正如通过定量实时PCR(17)所测定的，根据病毒DNA释放入培养基来评价单纯疱疹病毒复制。使用基于珠的测定(18)、根据p24病毒壳体抗原的释放评价HIV-1复制。
HSV-1和HSV-2-感染小鼠的体内抗病毒活性。在腰骶部区域约1cm2表面上划破成年NMRI无胸腺裸小鼠(体重~20g)，给小鼠接种50L中5x103PFU HSV-1(Kos菌株)或5x102HSV-2(G菌株)/小鼠。制备替诺福韦、阿德福韦和西多福韦在100%二甲亚砜中或与用于CAPRISA 004试验相同的凝胶中的典型1%制剂。在每次实验中，包括用与测试制剂相同、但不含药物的安慰剂制剂治疗的动物组作为阴性对照。在实验方案中，局部给予动物所示制剂和药物浓度的替诺福韦、阿德福韦或西多福韦，从感染后1-2h开始，每日2次，持续5天期限。将接种病毒的当天始终视为第0天。全部动物操作都经过K.U.Leuven Animal Care Committee批准。在1个月期限内记录损害的发生和死亡率。当30%以上体重缺失或麻痹发生时，对动物实施安乐死。根据Kaplan-Meir方法估计存活率并且使用时间等级检验(Mantel-Cox)测试(GraphPad Prism)比较。
替诺福韦在淋巴细胞CEM、成纤维细胞HEL和上皮细胞TZM-bl细胞培养物中的代谢.如下监测放射性标记的替诺福韦的代谢：分别以4x105、5.1x105和17x105细胞/ml将CEM、HEL或TZM-bl细胞接种在5-ml培养烧瓶(25cm2)中并且与2μM[2,8-3H]替诺福韦(10μCi/烧瓶)一起温育。在接种细胞后72hrs时向细胞培养物中加入放射性标记的药物，持续24hrs。在此时，在4°C离心细胞(预先从HEL和TZM-bl细胞培养物接收器中分离后)，用冰冷培养基(无血清)充分洗涤，用60%冷甲醇沉淀。以10,000rpm离心后，通过使用以前描述(19)的Partisil-SAX-10径向压缩柱的HPLC分析对上清液中的放射性标记的[3H]替诺福韦及其代谢物进行定量。[3H]替诺福韦、[3H]替诺福韦-MP和替诺福韦-DP的保留时间约为5、16和32min。
HSV-1DNA聚合酶和HIV-1逆录酶测定.用于HSV-1DNA聚合酶和HIV-1RT测定的反应混合物(40μl)包含不同浓度(即200、20、2、0.2μM)的4μl预混合物(200mM Tris.HCl、pH 7.5；2mM DTT；30mM MgCl2)、4μl BSA(5mg/ml)、1.6μl活化的小牛胸腺DNA(1.25mg/ml)、0.8μl dCTP(5mM)、0.8μl dTTP(5mM)、0.8μl dGTP(5mM)、2μl放射性标记的[3H]dATP(1mCi/ml)(3.3μM)、18μl H2O和4μl替诺福韦-DP。通过添加4μl重组HSV-1DNA聚合酶(M.W.Wathen友情提供(Pfizer,Kalamazoo,MI))或重组HIV-1RT(在20mM Tris.HCl、pH 8.0；1mM DTT；0.1mM EDTA；0.2M NaCl；40%甘油中)启动反应，在37°C将该反应混合物温育60min(HSV-1DNA聚合酶)或30min(HIV-1RT)。然后加入1ml冰冷5%TCA的0.02M Na4P2O7.10H2O溶液以终止聚合反应，此后将酸-不溶性沉淀(放射性标记的DNA)俘获在Whatman玻璃纤维滤器GF/C型(GEHealthcare UK Limited,Buckinghamshire,UK)上并且进一步用5%TCA和乙醇洗涤以除去游离的放射性标记的dATP。使用PerkinElmer Tri-Carb 2810 TR液体闪烁计数器测定放射性。
结果
替诺福韦在多种允许细胞类型中对HSV-1和HSV-2复制的抑制
首先在HEL细胞单层和初级人角化细胞(PHKs)中评价替诺福韦对实验室HSV菌株的活性并且与核苷(即阿昔洛韦、喷昔洛韦、更昔洛韦和溴夫定)和无环核苷酸膦酸酯(ANP)(即西多福韦和阿德福韦)类似物的抗-HSV活性比较。替诺福韦抑制病毒诱导的致细胞病变性，其中在PHKs中对HSV-1和HSV-2的EC50值为~100－200μg/ml。阿德福韦的EC50值为3.6－13μg/ml，西多福韦为0.63－4.4μg/ml。除溴夫定外，已知它对HSV-2具有的活性显著低于对HSV-1的活性，证实核苷类似物的活性大于测试的任意无环核苷酸膦酸酯类似物。
针对HSV-1和HSV-2的各种临床分离物，包括野生型和HEL成纤维细胞培养物中的阿昔洛韦-抗性菌株，还将替诺福韦与无环核苷酸膦酸酯(ANPs)阿德福韦和西多福韦和几种核苷类似物一起进行了评价。替诺福韦抑制所有临床分离物的致细胞病变效应，其中对HSV-1wt、缺乏胸苷激酶HSV-1TK-、HSV-2wt和缺乏胸苷激酶HSV-2TK的EC50平均值分别为130μg/ml(范围在114-160μg/ml)、≥166μg/ml(范围在117-≥200μg/ml)、≥157μg/ml(范围在125-≥200μg/ml)和152μg/ml(范围在131-179μg/ml)。当平行测试时，阿德福韦显示EC50平均值比对替诺福韦观察到的结果低20至32倍，而西多福韦是最具有活性的ANP，其具有的EC50平均值在0.35μg/ml－0.67μg/ml。因此，替诺福韦的抗疱疹EC50值比对西多福韦观察到的结果高181至474倍。与显示对野生型和突变型TK-HSV临床分离物具有类似的EC50值的测试的ANPs相反，阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦和溴夫定对缺乏胸苷激酶疱疹病毒菌株失去了其抗疱疹活性。
还在初级单核细胞/巨噬细胞(M/M)细胞培养物中评价了替诺福韦、阿德福韦和阿昔洛韦的抗-HSV-2活性。在对照病毒感染培养物的上清液中疱疹病毒产生总计达2.8±0.9x105TCID50/ml，导致用显微镜可见90-100%致细胞病变效应(CPE)(图1)。500和100μg/ml浓度的替诺福韦完全抑制了病毒复制，在病毒感染后第6天时没有任何显微镜可见CPE的征兆。在20和5μg/ml，培养物上清液中的病毒滴度低于未处理的对照组1个对数以上，分别产生~5%和30%可见CPE。在1μg/ml或0.2μg/ml药物浓度下，未观察到显著的替诺福韦保护效应(2.5x105 TCID50/ml；≥70-80%CPE)(图1)。正如预计的，阿德福韦在M/M中更具有抗病毒活性。在500－5μg/ml药物浓度下，在细胞培养物中发现，上清液中既无病毒颗粒，也无可见的CPE。甚至阿德福韦浓度低至1和0.4μg/ml也显著降低了HSV滴度(8.5x102和5.4x103 TCID50/ml)且可见的CPE分别为5%和45%。正如预计的，证实确定的抗疱疹药物阿昔洛韦在抑制M/M细胞培养物中的疱疹病毒复制方面极为有效(完全抑制上清液中释放的病毒且在等于或高于0.008g/ml浓度下未见致细胞病变性)。
替诺福韦在HIV-感染的上皮TZM-bl细胞培养物中对HSV-2复 制的抑制
上皮TZM-Bl细胞来源于感染HIV(共同)-受体CD4、CXCR4和CCR5的HeLa细胞。使它们感染HIV和HSV。我们用HIV-1(NL4.3)和HSV-2(G)共同感染这些细胞并且根据LTR-驱动的荧光素酶表达(发光)监测HIV复制并且根据病毒诱导的致细胞病变性的显微镜读数监测HSV-2复制。替诺福韦以~60μg/ml的药物浓度预防了共同感染的培养物中的HSV-2感染，与抑制单一HSV-2-感染的TZM-bl细胞培养物所需的替诺福韦浓度类似。此外，HIV-1在进行性HSV-2感染的存在或不存在下同样受到替诺福抑制(数据未显示)。因此，在双重HIV-1和HSV-2感染的实验条件下，每种病毒不会影响替诺福韦对另一种病毒的抗病毒活性。
替诺福韦在器官特征性上皮卵筏培养物中对病毒复制的抑制
当分化的角化细胞是体内HSV产生感染的主要靶细胞时，评价替诺福韦在角化细胞的器官特征性卵筏培养物中的抗病毒活性。在这种三维培养物模型中，角化细胞完全分化，由此可以确切地模拟体内的组织状态。我们在该系统中比较了替诺福韦、阿德福韦和西多福韦在减少HSV复制中的能力。分化10天后感染器官特征性上皮卵筏培养物并且用测试化合物的顺序稀释液处理。升起后15天(即处理5天后)，处理卵筏以用于组织学检查和病毒定量。对培养物切片的组织学检查显示在对照卵筏中是具有特征层的完全分化的上皮，而HSV-感染的卵筏显示显著的病毒感染和病毒全部沿上皮播散(图2)。用HSV感染卵筏产生了致细胞病变效应，导致角化细胞膨胀和网状变性与核内嗜酸性包涵体出现，形成典型的上皮内囊泡和多核化。
器官特征性培养物的形态分析显示用200μg/ml和50μg/ml替诺福韦处理防止了完整上皮细胞发生HSV-2-诱导的致细胞病变性，而在20μg/ml和5μg/ml下，该化合物在正常上皮区域和具有受损卵筏的区域具有部分防护作用(图2)。在2μg/ml浓度下，替诺福韦对HSV-2无活性。给予≥2μg/ml的阿德福韦和0.2μg/ml的西多福韦导致上皮组织完全受到保护(数据未显示)。在所有测试化合物的最高浓度(替诺福韦200μg/ml、以及阿德福韦和西多福韦50μg/ml)下均未观察到毒性效应，正如死亡细胞数量增加或分化改变所确定的。当卵筏培养物感染参比HSV-1实验室菌株时，还证实了替诺福韦、阿德福韦和西多福韦的选择性抗-HSV效应。在这种情况下，在200μg/ml替诺福韦、2μg/ml阿德福韦和≥0.5μg/ml西多福韦浓度下，观察到了对病毒诱导的致细胞病变效应的完全防护作用。较低的化合物浓度导致对上皮细胞的部分防护(即50μg/ml替诺福韦)或完全破坏(即20μg/ml替诺福韦)。
为了对与阿德福韦和西多福韦比较的替诺福韦的抗病毒效应定量，通过定量PCR测定病毒收率（virus yield）/卵筏。正如图3中所示，在用顺序浓度的化合物处理卵筏后观察到病毒产生/卵筏的浓度依赖性抑制。替诺福韦在最高测试浓度下(即200μg/ml)在病毒产生中显示2.6-(HSV-1)和5.4-(HSV-2)log减少噬菌斑形成单位（PFU）。在50μg/ml替诺福韦浓度下，观察到病毒收率减少了0.81(HSV-1)和1.75(HSV-2)logs。甚至在20μg/ml下，在感染了HSV-2的卵筏中观察到病毒产生减少了0.9log。较低浓度的化合物不能减少卵筏中的病毒复制。正如预计的，证实阿德福韦和西多福韦对HSV复制比替诺福韦更具有活性(图3A和3B)。
替诺福韦在单一感染和HIV-1共同感染的人离体淋巴样组织中对单纯 疱疹病毒2型的抑制
在感染的人离体扁桃体组织中研究替诺福韦对HSV-1菌株F(HSV-1F)、HSV-2菌株G(HSV-1G)和HSV-2菌株MS(HSV-2MS)的作用(图4)。该系统在无外源性刺激或活化的情况下支持各种病毒复制(17)。在这种体内样组织系统中接种时，HSV-1F、HSV-2G或HSV-2MS如所示的因浸浴组织块的培养基中存在病毒DNA而有效地复制。来自全部测试供体的组织支持显著生产性的病毒感染，在9天培养自始至终培养基中就HSV-1F、HSV-2G和HSV-2MS而言病毒DNA基因组的平均蓄积分别达到7.8log10 DNA拷贝/ml[四分位距(IQR)7.1-8.1,n=5]、7.25log10拷贝/ml(IQR 7.2-7.9,n=6)和6.4log10拷贝/ml(IQR6.1-7.5,n=3)。
为了测试替诺福韦对HSV复制的作用，用3－240μg/ml的药物浓度范围将人扁桃体组织块处理过夜并且感染HSV-1F、HSV-2G或HSV-2MS。在整个培养期限自始至终维持替诺福韦并且用每次的培养基改变替代。替诺福韦以剂量依赖性方式抑制HSV-1F、HSV-2G和HSV-2MS复制，其中HSV-1F的EC50为7μg/ml[95%置信区间(CI):10-44]；HSV-2G 14μg/ml(CI:10-163)(图4A)和HSV-2MS 19μg/ml(CI:27-127)。因此，与感染供体匹配的未处理组织相比，替诺福韦在66μg/ml浓度下相应地将HSV-1F、HSV-2G和HSV-2MS复制减少了99±0.1%、94±7%(图4A)和89±2%(p<0.01)。在用66μg/ml替诺福韦处理的组织中感染后第9天时，与在未处理的匹配供体组织(n=3)中8log10 DNA拷贝/ml(IQR 7.87–8.04)相比，根据培养基中病毒DNA的释放测定的HSV-1F复制为4log10DNA拷贝/ml(IQR 3.9–4.3)。类似地，在感染后第9天时，HSV-2G和HSV-2MS复制在未处理的组织中分别产生7.6log10DNA拷贝/ml(IQR 7.4–7.8)和7.3log10DNA拷贝/ml(IQR 6.9–7.6)，而在匹配的用66μg/ml替诺福韦处理的供体组织中为5.2log10DNA拷贝/ml(IQR 3.6–6.1,n=14)和5.8log10DNA拷贝/ml(IQR 5.7–6.1,n=3)。
甚至在最高药物浓度下，对HSV-1F、HSV-2G和HSV-2MS复制的抑制与可测定的扁桃体组织淋巴细胞耗尽无关：在60μg/ml替诺福韦处理的组织与供体-匹配未处理的组织之间的总T细胞(CD3+)、总B细胞(CD19+)或未致敏和记忆T-细胞亚群的绝对数量方面没有统计学显著性差异(n=3,p>0.4)。
为了评价替诺福韦对HSV-2和HIV-1的双重抗病毒活性，如上所述我们使扁桃体组织共同感染了HSV-2G和HIV-1X4LAI(16)并且在整个培养期限自始至终用66μg/ml浓度的替诺福韦处理它们。在未处理的对照组织中，释放入培养基的HSV-2GDNA为7.3log10拷贝/ml(IQR6.8–7.4)，而在供体匹配的替诺福韦-处理的共同感染了HIV-1的组织中，释放入培养基的HSV-2G DNA为5log10拷贝/ml(IQR 4.3–5.7,n=6)。因此，在这些组织中，66μg/ml替诺福韦将HSV-2G复制抑制了96±1%(n=6；p<0.01)(图4B)。在感染后第9天时，根据释放入培养基的p24所测定的HIV-1X4LAI复制在所有测试组织中受到完全抑制(未处理的对照组中为2462±1117pg/ml，而供体匹配的替诺福韦-处理的组织中为0pg/ml(图4B)。
为了证实替诺福韦对HSV-2G的抗病毒活性特异性，我们用有效的HIV核苷逆录酶抑制剂(NRTI)拉米夫定在33μg/ml浓度下处理组织。在来自两个供体的组织中，我们发现，与未处理的供体匹配的HSV-2G-感染组织相比，拉米夫定对HSV-2G复制没有影响(数据未显示)。正如预计的，拉米夫定已经显示对HIV-1复制的有效作用。因此，替诺福韦的抗疱疹作用不是NRTIs的一般属性。
此外，为了评价替诺福韦处理离体扁桃体组织的可能的免疫调节作用，我们测定了来自用66μg/ml浓度的替诺福韦将供体匹配的组织处理9天的培养基中20种细胞因子的浓度(IL-1、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IFN、CCL3/MIP-1、CCL4/MIP-1、CCL20/MIP-3、CCL5/RANTES、CXCL12/SDF-1、TGF、TNF、CCL2/MCP-1、CCL11/嗜酸细胞活化趋化因子、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10`)。在感染后第9天时，在未处理的组织与用替诺福韦处理的组织中的任意评价的细胞因子浓度之间没有显著性差异(p>0.15)。
替诺福韦在人离体子宫颈-阴道组织中对HSV-2的抑制
为了研究替诺福韦在子宫颈-阴道组织中的抗-HSV活性，如上所述培养这种组织块，接种HSV-2G，用药物治疗。在HSV-2G感染时加入166μg/ml浓度的替诺福韦，在本实验期间自始至终通过每次培养基改变补充来维持。根据病毒DNA释放入浸浴子宫颈-阴道组织块的培养基来评价HSV-2G复制(16个块/条件)。在未用替诺福韦处理的对照组织中，在来自全部5个测试供体的组织中都检测到了病毒复制，其中在培养12天的自始至终平均累积产生6.6log10拷贝/ml(IQR 5.3–8.2)。在用替诺福韦处理的子宫颈-阴道组织中，病毒产生减少至5.5log10拷贝/mL(IQR 4.8–5.7,n=5)(图4C和图4D)，反映出当求每次实验中病毒复制减少的平均值时，减少78±9%(p<0.01)。
替诺福韦在HSV-感染小鼠中的活性
使用两种不同媒介物-DMSO(图5)和用于CAPRISA 004研究的凝胶(数据未显示)将替诺福韦、阿德福韦和西多福韦在HSV-1-和HSV-2-感染小鼠中评价为抗疱疹药。将全部化合物以1%的浓度从感染的当天开始给予HSV-1-和HSV-2-感染小鼠5天。与安慰剂治疗组相比，感染HSV-1和用1%替诺福韦治疗的小鼠的发病率和存活曲线显著延迟。正如预计的，证实阿德福韦在DMSO(图A)和凝胶制剂(数据未显示)中比替诺福韦更有效，因为当动物分别接受1%阿德福韦的DMSO制剂或凝胶时，观察到80%和100%的存活率。应指出，用1%阿德福韦的DMSO制剂治疗的小鼠死亡，未发生皮肤损害(图5A)。用西多福韦的DMSO制剂或凝胶制剂治疗完全防止了小鼠发生病毒诱导的发病率和死亡率。
当评价替诺福韦的DMSO制剂抗HSV-2时，在感染当天开始接受替诺福韦的组与安慰剂组之间在存活曲线和发病率曲线方面再一次存在统计学显著性差异。用1%阿德福韦或1%西多福韦治疗HSV-2-感染小鼠导致对病毒诱导的发病率和死亡率的防护分别为80%和100%(图5B)。类似地，当配制成1%凝胶时，替诺福韦延迟了疱疹病毒相关损害发生和随后的动物死亡(数据未显示)。配制成凝胶的西多福韦导致对HSV-2诱导的发病率和死亡率的防护为80%，而在相同实验条件下，阿德福韦提供了损害发生和随后死亡的显著延迟。
替诺福韦在淋巴细胞、上皮细胞和成纤维细胞培养物中有效地转 化成其抗病毒活性代谢物
根据预先建立的方法(19)在人淋巴细胞CEM(用于HIV感染实验)和人上皮TZM-bl和成纤维细胞HEL(用于HSV感染实验)细胞培养物中研究替诺福韦代谢性转化成其抗病毒活性(二磷酸化)代谢物。在启动培养后72hrs时使用2μM[2,8-3H]替诺福韦将细胞处理24小时导致形成替诺福韦-二磷酸盐，在T-淋巴样细胞、上皮细胞和成纤维细胞中分别达到13、6和15皮摩尔/109细胞的水平。因此，替诺福韦在多种不同的细胞类型中有效地转化成其抗病毒活性代谢物，这些细胞类型代表了体内HIV或HSV感染的相关靶细胞。
替诺福韦的活性代谢物有效地抑制HSV DNA聚合酶和HIV逆录 酶
为了转化成作为病毒编码的疱疹病毒DNA聚合酶或HIV-1逆录酶的抑制剂的活性成分，替诺福韦需要由细胞酶转化成其二磷酸化衍生物(替诺福韦-DP)。已经使用活化小牛胸腺DNA作为引物/模板和[2,8-3H]dATP作为竞争性底物评价了该活性代谢物对靶酶的抑制活性。替诺福韦-DP有效地抑制HIV-1RT(IC50:4.3μM)和HSV-1DNA聚合酶(IC50:1.3μM)。因此，替诺福韦在细胞培养物、器官特征性上皮卵筏培养物、人淋巴样和子宫颈离体组织和病毒感染的小鼠中的抗疱疹活性可以根据病毒DNA聚合酶被其活性代谢物替诺福韦-DP抑制来解释。
制剂(阴道凝胶剂)
Figure BDA00002560367800221
Figure BDA00002560367800231
使用10%w/w溶液形式的氢氧化钠和盐酸将pH调节至4.4的目标值。将对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯溶解在加热的甘油中。加入羟乙基纤维素并使其分散以形成有机相。将乙二胺四乙酸二钠和柠檬酸溶解在纯净水中，加入替诺福韦并使其分散，调节pH至4.4，并通过0.22μm过滤器使溶液澄清。将水相和有机相混合、充分搅拌，然后填充到管或涂药器中。
安全性和耐受性
在有禁欲的和有性活动的HIV(-)和HIV(+)妇女中，每日两次使用1%的替诺福韦阴道凝胶是耐受很好的，具有有限的全身吸收并且对阴道微生物区系具有可能的有益影响。
研究方法
本研究的目的在于评价经阴道施用以预防单纯疱疹病毒、特别是HSV-2传播时替诺福韦凝胶的有效性。
本研究是IIb期试验–两分支、双盲、随机化、受控试验，其比较了1%替诺福韦凝胶与安慰剂凝胶在889位年龄在18-40岁、处于性传播HIV感染高风险中的有性活动的妇女中的作用。
配制安慰剂凝胶(称作‘通用’安慰剂凝胶)以便将任何对研究终点可能的效应—负面的或正面的—减少到最低限度。它是等渗的以便避免上皮细胞溶胀或脱水。在pH 4-5配制，但具有最小的缓冲容量。当与等体积的精液混合时，安慰剂凝胶仅诱导精液pH轻度下降(7.8－7.7)。安慰剂凝胶包含羟乙基纤维素(HEC)作为胶凝剂且其粘度与替诺福韦凝胶相差无几。该凝胶不具有抗-HIV或抗-HSV-2特性。该凝胶包含山梨酸作为防腐剂。山梨酸不具有抗-HIV活性并且易于被人细胞代谢。如下配制该安慰剂凝胶：
化学名 %w/w 量
净化水 96.34 674.4升
氯化钠 0.85 6.545Kg
羟基纤维素NF 2.7 20.79Kg
山梨酸EP/NF 0.10 770.0g
氢氧化钠NF(适量至pH 4.4) 0.0020 15.4g
氢氧化钠NF 0.0080 61.6g
用适当的贮存和施用指定研究产品的方法训练参与者。指示参与者在每次阴道性交行为前将1个剂量(1个涂药器的全部内含物)的产品插入阴道至多12小时(性交可以在插入产品后即刻进行)并且在12小时内性交后尽可能迅速地插入第二个剂量。
建议本研究的参与者：
●仅施用指定的阴道产品。
●凝胶插入后持续2小时内，不冲洗或以其他方式清洁阴道，或插入其他的物品或阴道产品，。如果妇女计划在性交后冲洗，则建议她冲洗后插入凝胶。
●适当贮存其研究产品(在冷却干燥位置，避免直接日光)。
●为了使用研究产品，无论是否使用避孕套。
本研究的参与者完成每月进行的随访调查，持续其参与期限，并且在登记时抽血，然后在随访期间预先指定的时间点和研究结束时采血，以便测试HIV和HSV-2。
结果
使用Kalon HSV-2型特异性EIA(Kolon Biological Ltd.,UnitedKingdom)测定抽取的血样中存在的HSV-2。在登记时，888位妇女中的454位(1位妇女未存档测试血液)具有预先存在的HSV-2感染，导致发生率为51.1%。其余434位妇女被视为在进入本试验时是HSV-2易感性的并且经测定这些妇女中的426位脱离HSV-2状态。应注意，这些妇女中的4位没有存档研究结束样本且4位在研究结束时不确定HSV-2结果。
在使用替诺福韦制剂持续本研究期限的205位妇女中，29位感染HSV-2。在提供安慰剂持续本研究期限的224位妇女中，58位感染HSV-2。因此，替诺福韦凝胶提供了对HSV-2的51%的防护。
Figure BDA00002560367800251
将本文引述的全部公开文献和专利申请引入参考，其引用程度与显示将每篇公开文献或专利申请各自特别和分别引入参考相同。
尽管上文详细描述了一些实施方案，但是本领域技术人员会清楚地理解，能够在不脱离本发明教导的情况下进行许多变型。所有这种变型预以包括在本发明的权利要求范围内。

Claims (16)

1.抗病毒化合物在制备用于减少或预防HSV-2向哺乳动物传播的药物中的应用。
2.抗病毒化合物在制备用于减少或预防哺乳动物获得HSV-2的药物中的应用。
3.权利要求1和2的应用，其中所述抗病毒化合物包含(R)-(1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基氧基)甲基膦酸(替诺福韦)或其生理学功能衍生物。
4.权利要求3的应用，其中将所述制剂作为凝胶通过阴道施用于人类女性。
5.权利要求4的应用，其中在性活动前施用所述制剂。
6.权利要求4的应用，其中在性活动后施用所述制剂。
7.权利要求4的应用，其中在性活动前后均施用所述制剂。
8.权利要求4的应用，其中将所述制剂每日施用一次或两次。
9.权利要求4的应用，其中所述制剂包含：
Figure FDA00002560367700021
10.权利要求9的应用，其中加入氢氧化钠和盐酸以便将pH调整至4.4。
11.权利要求4的应用，其中所述制剂包含：
Figure FDA00002560367700022
12.权利要求11的应用，其中加入氢氧化钠和盐酸以便将pH调整至4.4。
13.权利要求12的应用，其中将所述制剂涂覆在避孕套上。
14.用于减少或预防HSV-2向哺乳动物传播的(R)-(1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基氧基)甲基膦酸。
15.用于减少或预防哺乳动物获得HSV-2的(R)-(1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基氧基)甲基膦酸。
16.权利要求14和15的应用，其中将(R)-(1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基氧基)甲基膦酸配制成凝胶，其中该制剂包含：
Figure FDA00002560367700031
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