CN103076418B - 原位聚合法制备鞣花酸分子印迹聚合物整体柱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种原位聚合法制备鞣花酸分子印迹聚合物整体柱的方法，该方法将预聚合混合溶液直接注入到不锈钢管柱内制备连续棒形聚合物，得到具有固定空穴大小和形状、有确定排列功能团、识别模板分子的交联高聚物材料，即分子印迹聚合物（MIP）。经该方法得到的分子印迹聚合物（MIP）整体柱不仅具有印迹效果，而且具有渗透性好的优点，印迹因子可达3.536，同时该方法制备过程简单，内部结构均匀，重现性好，避免了繁琐的装柱手续，可直接用于分析。

Description

原位聚合法制备鞣花酸分子印迹聚合物整体柱的方法

技术领域

本发明涉及一种原位聚合制备鞣花酸分子印迹聚合物整体柱的方法。

背景技术

分子印迹技术是指以特定的分子为模板，制备对该分子有特殊识别功能和高选择性材料的技术，通常被人们描述为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”技术。它将模板分子、单体、交联剂溶解在一定的溶液中形成预聚合溶液，经过聚合反应形成具有与模板分子在空间结构上完全匹配、并与模板分子特异性结合的功能基的三维空穴的聚合物。当前MIP的制备方法很多，主要有：（1）本体聚合法；（2）悬浮聚合法；（3）分散聚合法；（4）沉淀聚合法；（5）表面印迹聚合法等等。但这些方法存在一些缺陷，如本体聚合制备的MIP，必须经过研磨、筛分等处理。但在研磨过程中不可避免地破坏部分结合位点，得到粒子形状不均匀，最终MIP的产率只有50%左右；悬浮聚合法制备平均粒径小于10μm的MIP时，产物的单分散性和规整性都急剧下降，且亚微米级的微球难以得到；分散聚合法制备过程较为复杂，且所用到的分散剂和惰性分散体系昂贵；沉淀聚合法产率低；表面模板聚合法制备方法虽然较为简单，但只能进行少部分特定分子的印迹，应用范围较窄。此外，上述方法在实际应用前都需要经过繁琐的装柱操作。原位聚合是近期发展的制备MIP的新技术，可通过一步聚合完成反应，在空的色谱柱内用该法形成的整体柱通过洗脱除去模板分子后可直接应用。该技术的关键是针对不同的模板分子寻找具有合适的致孔剂体系和聚合体系，以获得具有良好的通透性、选择性及高柱效的MIP整体柱。

鞣花酸，是没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯。不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以缩合形式（如鞣花单宁、苷等）存在于自然界。是存在于众多水果和蔬菜中的天然酚类抗氧化剂，包括黑莓、覆盆子、草莓、蔓越莓、山核桃、石榴、枸杞等植物。鞣花酸的抗增生和抗氧化特性，刺激了对鞣花酸潜在价值的研究。由于鞣花酸极易氧化，聚(缩)合，因而很难得到高纯度的鞣花酸单体。因此对分离提纯鞣花酸单体的研究具有很重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种原位聚合制备鞣花酸分子印迹聚合物整体柱的方法，该方法将预聚合混合溶液直接注入到不锈钢管柱内制备连续棒形聚合物，得到具有固定空穴大小和形状、有确定排列功能团、识别模板分子的交联高聚物材料，即分子印迹聚合物（MIP）。经该方法得到的鞣花酸分子印迹聚合物聚合物（MIP）整体柱不仅具有印迹效果，而且具有渗透性好的优点，印迹因子可达3.54，同时该方法制备过程简单，内部结构均匀，避免了繁琐的装柱手续，可直接用于分析。

本发明所述的一种原位聚合制备鞣花酸分子印迹整体柱的方法，按下列步骤进行：

a、分别将质量百分数为模板分子鞣花酸0.49-0.51%、功能单体丙烯酰胺0.99-1.52%、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯6.15-9.44%、致孔剂聚苯乙烯83.07-79.65%溶于四氢呋喃的溶液混合，再加入甲苯8.46-8.83%、的引发剂为偶氮二异丁腈0.43-0.45%混合，超声20分钟，使其均匀，澄清，然后转移到干净的不锈钢管柱中，超声脱气15分钟，将不锈钢管柱两端封住，于温度55℃的恒温水浴锅内反应24小时；

b、将不锈钢管柱取出并连接到HPLC的高压泵上，先用四氢呋喃冲洗，以除去整体柱中残留的致孔剂和未完全反应的预聚合物，然后用体积比甲醇:乙酸=9:1混合液冲洗至除去模板分子，流速由0.1ml/mim逐渐增大，冲洗液总体积为150ml，即可得到鞣花酸分子印迹整体柱。

步骤a中的致孔剂聚苯乙烯溶于的四氢呋喃溶液的浓度为40mg/ml。

步骤a中的不锈钢管柱为100×4.6mm I.D.。

本发明首次采用原位聚合合成鞣花酸分子印迹聚合物整体柱，该方法通过将预聚合溶液注入到空的色谱柱中，在柱管内一步完成聚合。该合成方法制备过程简单，简化实验过程，容易操作。由于聚合过程一步完成，避免了复杂的装柱程序，大大减少操作时间。

本发明采用通过实验设计，找到合成鞣花酸分子印迹整体柱的最适宜反应物配比；即印迹分子、功能单体和交联剂的及致孔剂的比例，制备得到对鞣花酸具有较好选择性的分子印迹整体柱。在同组分配比下，合成不加模板分子的空白柱，相同条件下进行色谱分析，可获得高的印迹因子，且印迹柱可以用来进行鞣花酸与类似物的分离。附图说明

图1为本发明印迹整体柱上鞣花酸与其结构类似物没食子酸、没食子酸甲酯、对羟基苯甲酸、邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸在柱温为20℃时的色谱保留图，其模板:功能单体:交联剂=1:6:18，其中1为鞣花酸，2为丙酮及鞣花酸结构类食物没食子酸甲酯、没食子酸、邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸的色谱保留图，其中丙酮峰表示色谱柱死时间；

图2为本发明无鞣花酸印迹的空白整体柱上鞣花酸与其类似物食子酸、没食子酸甲酯、对羟基苯甲酸、邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸在柱温为20℃时的色谱保留图，其中1为丙酮，2没食子酸甲酯，3没食子酸，4邻羟基苯甲酸，5间羟基苯甲酸，6对羟基苯甲酸，7为3,4-二羟基苯甲酸，8鞣花酸，其中丙酮峰表示色谱柱死时间；

图3为本发明鞣花酸与其类似物没食子酸、没食子酸甲酯、对羟基苯甲酸、邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸在柱温为温度20℃时的色谱保留图，其模板:功能单体:交联剂=1:8:24，其中1鞣花酸，2为丙酮及鞣花酸结构类食物没食子酸甲酯、没食子酸、邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸的色谱保留图，其中丙酮峰表示色谱柱死时间；

图4为本发明鞣花酸与其类似物没食子酸、没食子酸甲酯、对羟基苯甲酸、邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸在柱温为温度20℃时的色谱保留图，其模板:功能单体:交联剂=1:5:15，其中1为鞣花酸，2为丙酮及鞣花酸结构类食物没食子酸甲酯、没食子酸、邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸的色谱保留图，其中丙酮峰表示色谱柱死时间；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明；

鞣花酸分子印迹整体柱制备及与其结构类似物的分离,利用原位聚合法合成鞣花酸为模板的分子印迹整体柱，在合适的色谱条件下，连于高效液相色谱仪评价其保留性能：

实施例1

原位聚合法制备鞣花酸分子印迹整体柱：

a、据一根不锈钢管柱内合成鞣花酸印迹整体柱所需的量，按质量百分数准确称取模板分子鞣花酸0.50%、功能单体丙烯酰胺1.18%、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯7.28%、与81.89%致孔剂(聚苯乙烯溶于四氢呋喃的溶液，浓度为40mg/ml)混合，再加入甲苯8.71%、和0.44%的引发剂偶氮二异丁腈混合，超声20分钟，使其均匀，澄清，然后转移到干净的不锈钢管柱100×4.6mm I.D.中，超声脱气15分钟，将不锈钢管柱两端封住，于温度55℃的恒温水浴锅内反应24小时；

b、模板分子的去除：将合成好的不锈钢管柱取出并连接到HPLC的高压泵上，先用四氢呋喃冲洗，以除去整体柱中残留的致孔剂，然后用体积比甲醇:乙酸=9:1混合液冲洗至完全除去模板分子，流速由0.1ml/mim逐渐增大，冲洗液总体积为150ml，即可得到鞣花酸分子印迹整体柱；

用高效液相色谱法对其进行色谱分析，检测波长设置为254nm，先用缓冲溶液冲鞣花酸分子印迹高效液相整体柱，使系统稳定至基线水平，进样，测定鞣花酸的保留时间t_R和丙酮的保留时间t₀，鞣花酸的保留因子用公式k’=(t_R-t₀)/t₀计算；

结果表明，在流动相条件为甲醇/乙酸盐缓冲液（70/30,v/v）（其中盐浓度为50mmol/L，pH3.0），流速0.5ml/min时，柱温为25℃，模板鞣花酸可与类似物得到分离（图1为鞣花酸及其结构类似物在鞣花酸印迹整体柱上的色谱分离图）。

实施例2（对照）

空白整体柱分离鞣花酸及其结构类似物

为考察鞣花酸及其结构类似物在非印迹柱上的保留情况，合成不加模板鞣花酸的空白柱作为对照，具体操作步骤如下：

除不加模板分子鞣花酸外，用实施例1相同的方法和实验条件合成非印迹空白柱，聚合完成后，用四氢呋喃冲洗，以除去整体柱中残留的致孔剂和未反应的试剂；

色谱评价同实施例1中对印迹柱的考察，即在相同流动相条件下，通过测定鞣花酸及其类似物的保留时间t_R和丙酮的保留时间t₀，计算保留因子k’；

结果表明，在空白柱上模板与类似物出峰时间相近，没有达到基线分离（图2鞣花酸及其结构类似物在空白柱上的色谱分离图）；

通过比较模板分子在印迹整体柱和空白整体柱上的保留因子k’，计算印迹因子IF，（IF=k’_MIPs/k’_NIPs）来评价印迹柱的保留性能，结果显示，k’_MIPs=6.803，k’_NIPs=1.924，IF=3.536，表明印迹柱对鞣花酸分子具有很强的特异识别能力，保留因子远远大于其他类似物，对分离鞣花酸和其类似物可达到基线分离，因此可以用来作为从混合物中提取分离鞣花酸的方法。

实施例3

原位聚合法制备鞣花酸分子印迹整体柱：

a、据一根不锈钢管柱内合成鞣花酸印迹整体柱所需的量，按质量百分数准确称取模板分子鞣花酸0.49%、功能单体丙烯酰胺1.52%、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯9.44%、与79.65%的致孔剂（聚苯乙烯溶于四氢呋喃的溶液，浓度为40mg/ml）混合，再加入甲苯8.47%、和0.43%的引发剂偶氮二异丁腈混合，超声20分钟，使其均匀，澄清，然后转移到干净的不锈钢管柱100×4.6mm I.D.中，超声脱气15分钟，将不锈钢管柱两端封住，于温度55℃的恒温水浴锅内反应24小时；

b、模板分子的去除：将合成好的不锈钢管柱取出并连接到HPLC的高压泵上，先用四氢呋喃冲洗，以除去整体柱中残留的致孔剂，然后用体积比甲醇:乙酸=9:1混合液冲洗至完全除去模板分子，流速由0.1ml/mim逐渐增大，冲洗液总体积为150ml，即可得到鞣花酸分子印迹整体柱；

色谱评价同实施例1：在流动相条件为甲醇/乙酸盐缓冲液（70/30,v/v）（其中盐浓度为50mmol/L，pH3.0），流速0.5ml/min时，柱温为25℃，模板鞣花酸可与类似物得到分离（图3）；

实验结果表明，模板鞣花酸可与类似物得到分离。

实施例4

原位聚合法制备鞣花酸分子印迹整体柱：

a、据一根不锈钢管柱内合成鞣花酸印迹整体柱所需的量，按质量百分数准确称取模板分子鞣花酸0.51%、功能单体丙烯酰胺0.99%、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯6.15%、与83.07%的致孔剂（聚苯乙烯溶于四氢呋喃的溶液浓度为40mg/ml）混合，再加入甲苯8.83%、和0.45%的引发剂偶氮二异丁腈混合，超声20分钟，使其均匀，澄清，然后转移到干净的不锈钢管柱100×4.6mm I.D.中，超声脱气15分钟，将不锈钢管柱两端封住，于温度55℃的恒温水浴锅内反应24小时；

b、模板分子的去除：将合成好的不锈钢管柱取出并连接到HPLC的高压泵上，先用四氢呋喃冲洗，以除去整体柱中残留的致孔剂，然后用体积比甲醇:乙酸=9:1混合液冲洗至完全除去模板分子，流速由0.1ml/mim逐渐增大，冲洗液总体积为150ml，即可得到鞣花酸分子印迹整体柱；

色谱评价同实施例1：在流动相条件为甲醇/乙酸盐缓冲液（70/30,v/v）（其中盐浓度为50mmol/L，pH3.0），流速0.5ml/min时，柱温为25℃，模板鞣花酸可与类似物得到分离（图3）；

实验结果表明，模板鞣花酸可与类似物得到分离。

Claims (1)

1.一种原位聚合制备鞣花酸分子印迹整体柱的方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、分别将质量百分数为模板分子鞣花酸0.49-0.51%、功能单体丙烯酰胺0.99-1.52%、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯6.15-9.44%、致孔剂聚苯乙烯83.07-79.65%溶于四氢呋喃的溶液混合，再加入甲苯8.46-8.83%、的引发剂为偶氮二异丁腈0.43-0.45%混合，超声20分钟，使其均匀，澄清，然后转移到干净的不锈钢管柱中，超声脱气15分钟，将不锈钢管柱两端封住，于温度55℃的恒温水浴锅内反应24小时，其中致孔剂聚苯乙烯溶于的四氢呋喃溶液的浓度为40mg/ml，不锈钢管柱为100×4.6mm I.D.；

b、将不锈钢管柱取出并连接到HPLC的高压泵上，先用四氢呋喃冲洗，以除去整体柱中残留的致孔剂和未完全反应的预聚合物，然后用体积比甲醇:乙酸=9:1混合液冲洗至除去模板分子，流速由0.1ml/mim逐渐增大，冲洗液总体积为150ml，即可得到鞣花酸分子印迹整体柱。