CN103053476B - 专性孤雌繁殖的轮虫种群培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种采用化学药物诱导、微波辐射诱变、紫外照射突变及人工选育专性孤雌繁殖的轮虫种群培育方法，所培育的轮虫种群在繁殖和传代过程中，即使在密度为800~1000只/毫升的培养液中，仍旧进行孤雌繁殖而不发生有性繁殖行为，可显著提高轮虫培养密度、提高轮虫生产效率、缩小养殖水体积、降低生产成本，可应用于室内进行轮虫高密度培养，同时也适合在室外进行轮虫敞池培育增殖，可为水产经济养殖动物的苗种和幼体培育，提供充足的活体饵料生物。
Description
技术领域
本发明涉及一种轮虫种群的培育方法，尤其是一种可显著提高轮虫培养密度、提高轮虫生产效率、缩小养殖水体积、降低生产成本的专性孤雌繁殖的轮虫种群培育方法。
背景技术
不论是海水鱼还是淡水鱼，在育苗及幼体培育期间，其开口活饵料主要选用轮虫。按照每尾育苗每天摄食20~50只轮虫来计算，1个生产5000万尾鱼苗的中小型育苗企业，每天对轮虫的需求量就需要达到15~25亿只，按照1：1的比例采收轮虫来计算，育苗单位每天需要生产25~50亿只轮虫。轮虫包括海水的褶皱臂尾轮虫和淡水的萼花臂尾轮虫，是一种周期性孤雌繁殖动物，生活史由孤雌繁殖和有性繁殖两部分构成。通常情况下，轮虫通过高效的孤雌繁殖过程增加种群数量，但是在特定环境（如水体中轮虫密度超过10~20只/毫升等不利环境）条件下，则启动有性繁殖，产生休眠卵来抵御不良环境条件。有性繁殖的产生大大限制了种群繁殖的效率，甚至有崩溃的危险，从而限制了轮虫的产量，所带来的是活饵料供应不足的问题。而为了避免轮虫有性繁殖，就必需将轮虫培育水体的培养密度限制为20只/毫升以下，随之就需要增加培养轮虫的水体，占用了大量养殖空间，使得育苗成本加大。
发明内容
本发明是为了解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种可显著提高轮虫培养密度、提高轮虫生产效率、缩小养殖水体积、降低生产成本的专性孤雌繁殖的轮虫种群培育方法。
本发明的技术解决方案是：一种专性孤雌繁殖的轮虫种群培育方法，其特征在于按如下步骤进行：
a．取轮虫的休眠卵放置于500毫升的培养液中，置于温度24度，光照3000Lx，光周期16：8的环境条件下孵化3~5天；
b. 将孵化出来的轮虫进行单个体扩大培养，投喂微绿球藻密度为100万细胞~200万细胞/毫升培养液，温度24度，光照3000Lx，光周期16：8；
c. 挑取100只新孵化出的个体分别进行扩大培养，形成100个克隆种群，每个克隆种群培养液体积为2000毫升，每天更新一次培养液和饵料；
d．当克隆种群的轮虫密度达到1只/毫升时，向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液和饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到3~10只/毫升，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；
e. 从100个克隆种群中，筛选出25~35个有性生殖比率小于1%的克隆种群，用脉冲频率2450M的微波辐射10秒；12小时后再用强度为1480 μWcm-2s-1的紫外线，照射60秒；12小时后，将克隆种群的轮虫群密度调整到1只/毫升，培养7天，此期间不添加α-生育酚；
f．向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液及饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到3~10只/毫升，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；
g．从25~35个轮虫的克隆种群中，继续筛选出10~15个有性生殖比率小于0.1%的克隆种群，用脉冲频率2450M的微波辐射10秒；12小时后再用强度为1480 μWcm-2s-1的紫外线，照射60秒；12小时后，将克隆种群的轮虫群密度调整到1只/毫升，培养7天，此期间不添加α-生育酚；
h．向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液及饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到3~10只/毫升，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；；
i. 从10~15个轮虫的克隆种群中，可筛选出种群密度达到800~1000只/毫升仍进行孤雌繁殖的轮虫克隆种群。
本发明所培育的轮虫种群在繁殖和传代过程中，即使在密度为800~1000只/毫升的培养液中，仍旧进行孤雌繁殖而不发生有性繁殖行为，可显著提高轮虫培养密度、提高轮虫生产效率、缩小养殖水体积、降低生产成本，可应用于室内进行轮虫高密度培养，同时也适合在室外进行轮虫敞池培育增殖，可为水产经济养殖动物的苗种和幼体培育，提供充足的活体饵料生物。
具体实施方式
实施例1：
a．取1~2公斤淡水养鱼池塘底泥，加入1000毫升高渗溶液（饱和食盐水和饱和蔗糖水混合液），搅拌均匀后静置10~15分钟，用塑料板轻轻蘸取表面上浮的萼花臂尾轮虫休眠卵若干，放置于500毫升经0.45微米滤膜过滤的盐度为0.1ppt湖水（培养液）中，置于温度24度，光照3000Lx，光周期16：8的环境条件下孵化3~5天；
b. 将孵化出来的轮虫进行单个体扩大培养，投喂微绿球藻密度为100万细胞/毫升培养液，温度24度，光照3000Lx，光周期16：8；
c. 挑取100只新孵化出的个体分别进行扩大培养，形成100个克隆种群，每个克隆种群培养液体积为2000毫升，每天更新一次培养液和饵料；
d．当克隆种群的轮虫密度达到1只/毫升时，向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液和饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到3~5只/毫升，用孔径为120微米的筛绢网，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天，即诱导轮虫进行大规模有性繁殖；
e. 从100个克隆种群中，筛选出25~35个有性生殖比率小于1%的克隆种群，用脉冲频率2450M的微波辐射10秒；12小时后再用强度为1480 μWcm-2s-1的紫外线，照射60秒；12小时后，加培养液将克隆种群的轮虫群密度调整到1只/毫升，培养7天，此期间不添加α-生育酚；
f．向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液及饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到3~10只/毫升，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；
g．从25~35个轮虫的克隆种群中，继续筛选出10~15个有性生殖比率小于0.1%的克隆种群，用脉冲频率2450M的微波辐射10秒；12小时后再用强度为1480 μWcm-2s-1的紫外线，照射60秒；12小时后，加培养液将克隆种群的轮虫群密度调整到1只/毫升，培养7天，此期间不添加α-生育酚；
h．向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液及饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到3~10只/毫升，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；
i. 从10~15个轮虫的克隆种群中，筛选出了3个种群密度达到800~1000只/毫升仍旧进行孤雌繁殖的轮虫克隆种群。
所述c~h步骤中的培养液均为经0.45微米滤膜过滤的盐度为0.1ppt湖水；所述培养条件均为温度24度，光照3000Lx，光周期16：8；所述饵料为微绿球藻，投喂密度为100万细胞/毫升。
本发明实施例1所筛选出的专性孤雌萼花臂尾轮虫克隆种群，在步骤b的条件下稳定培养、接种传代即可，可连续专性孤雌培养传代1.0~1.5年。
实施例2：
a．取1~2公斤海水河蟹育苗池塘底泥，加入1000毫升高渗溶液（饱和食盐水和饱和蔗糖水混合液），搅拌均匀后静置10~15分钟，用塑料板轻轻蘸取表面上浮的褶皱臂尾轮虫休眠卵若干，放置于500毫升经0.45微米滤膜过滤的盐度为15ppt的海水（培养液）中，置于温度24度，光照3000Lx，光周期16：8的环境条件下孵化3~5天；
b. 将孵化出来的轮虫进行单个体扩大培养，投喂微绿球藻密度为200万细胞/毫升培养液，温度24度，光照3000Lx，光周期16：8；
c. 挑取100只新孵化出的个体分别进行扩大培养，形成100个克隆种群，每个克隆种群培养液体积为2000毫升，每天更新一次培养液和饵料；
d．当克隆种群的轮虫密度达到1只/毫升时，向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液和饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到5~10只/毫升，用孔径为120微米的筛绢网，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天，即诱导轮虫进行大规模有性繁殖；
e. 从100个克隆种群中，筛选出25~35个有性生殖比率小于1%的克隆种群，用脉冲频率2450M的微波辐射10秒；12小时后再用强度为1480 μWcm-2s-1的紫外线，照射60秒；12小时后，加培养液将克隆种群的轮虫群密度调整到1只/毫升，培养7天，此期间不添加α-生育酚；
f．向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液和饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到5~10只/毫升，用孔径为120微米的筛绢网，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；
g．从25~35个轮虫的克隆种群中，继续筛选出10~15个有性生殖比率小于0.1%的克隆种群，用脉冲频率2450M的微波辐射10秒；12小时后再用强度为1480 μWcm-2s-1的紫外线，照射60秒；12小时后，加培养液将克隆种群的轮虫群密度调整到1只/毫升，培养7天，此期间不添加α-生育酚；
h. 向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液和饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到5~10只/毫升，用孔径为120微米的筛绢网，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；
i. 从10~15个轮虫的克隆种群中，筛选出了5个种群密度达到800~1000只/毫升仍旧进行孤雌繁殖的轮虫克隆种群。
所述c~h步骤中的培养液均为经0.45微米滤膜过滤的盐度为15ppt的海水；所述培养条件均为温度24度，光照3000Lx，光周期16：8；所述饵料为微绿球藻，投喂密度为200万细胞/毫升。
本发明实施例1所筛选出的专性孤雌褶皱臂尾轮虫克隆种群，在步骤b的条件下稳定培养、接种传代即可，可连续专性孤雌培养传代4年。
Claims (1)
1.一种专性孤雌繁殖的轮虫种群培育方法，其特征在于按如下步骤进行：
a．取轮虫的休眠卵放置于500毫升的培养液中，置于温度24度，光照3000Lx，光周期16：8的环境条件下孵化3~5天；所述培养液为经0.45微米滤膜过滤的盐度为0.1ppt湖水或经0.45微米滤膜过滤的盐度为15ppt的海水；
b. 将孵化出来的轮虫进行单个体扩大培养，投喂微绿球藻，投喂密度为100万细胞~200万细胞/毫升培养液，温度24度，光照3000Lx，光周期16：8；
c. 挑取100只新孵化出的个体分别进行扩大培养，形成100个克隆种群，每个克隆种群培养液体积为2000毫升，每天更新一次培养液及饵料；
d．当克隆种群的轮虫密度达到1只/毫升时，向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液及饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到3~10只/毫升，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；
e. 从100个克隆种群中，筛选出25~35个有性生殖比率小于1%的克隆种群，用脉冲频率2450M的微波辐射10秒；12小时后再用强度为1480 μWcm-2s-1的紫外线照射60秒；12小时后，将克隆种群的轮虫群密度调整到1只/毫升，培养7天，此期间不添加α-生育酚；
f．向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液及饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到3~10只/毫升，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；
g．从25~35个轮虫的克隆种群中，继续筛选出10~15个有性生殖比率小于0.1%的克隆种群，用脉冲频率2450M的微波辐射10秒；12小时后再用强度为1480 μWcm-2s-1的紫外线照射60秒；12小时后，将克隆种群的轮虫群密度调整到1只/毫升，培养7天，此期间不添加α-生育酚；
h. 向各克隆种群培养液中加入α-生育酚，加入量为20微克/毫升培养液，继续进行扩大培养，同时每天更新一次培养液及饵料，并维持培养液中α-生育酚的浓度；当克隆种群的轮虫密度达到3~10只/毫升，将每个克隆种群的轮虫密度浓缩至100只/毫升，同时调整α-生育酚的浓度为100微克/毫升培养液，培养10~15天；
i. 从10~15个轮虫的克隆种群中，筛选出种群密度达到800~1000只/毫升仍旧进行孤雌繁殖的轮虫克隆种群。
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