CN102428896A - 一种淡水轮虫休眠卵的快速生产方法 - Google Patents

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杨家新
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Abstract

本发明涉及一种淡水轮虫休眠卵的快速生产方法。该方法是将经扩大培养的轮虫接种到微绿球藻中，添加甲基睾丸酮10-30μg/L；接种轮虫密度0.5ind/mL，微绿球藻2500-5000转/分钟离心10分钟浓缩收集或采用絮凝沉淀收集，用轮虫培养液调制藻密度至3×106ind/mL，培养光照20-40W日光灯管2只，持续光照；温度25-28℃，生产期间不另添加食物，5天后收获。本发明方法简方便，快速，经济，便于推广应用，能在短时间获得高密度轮虫休眠卵。

Description

一种淡水轮虫休眠卵的快速生产方法
技术领域
本发明属于水产学科生物技术和生态学环境检（监）测领域，具体是涉及一种淡水轮虫休眠卵的快速生产方法。
背景技术
轮虫（rotifer）是淡水生态系统主要功能群，90%以上鱼类早期开口生物饵料，也是环境污染和环境风险评价受试动物。轮虫休眠卵是饵料生物规模化生产种源来源和生态毒理学研究标准起始材料。在水产养殖业，轮虫对苗种成活率和育成率起到举足轻重作用。目前水产生产部门在鱼类繁殖期间基本靠大量劳动力在天然水体捞取。无法保证鱼类苗种期间饵料供应。以本生产方法，在不需要特殊仪器的、不消耗大量劳动力情况下，生产轮虫休眠卵，在生产季节直接萌发休眠卵，获得幼体投喂鱼苗，或以此为轮虫种源扩大培养饵料生物生产。本方法不受季节和场地限制，具有成本低、操作简便，生产快速特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种淡水轮虫休眠卵快速便捷生产方法。所提供方法包括轮虫休眠卵种源获取、轮虫通用培养液配制、饵料微藻培养液配制、外源性激素配制、休眠卵生产温度、光照和培养操作。
本发明所述的淡水轮虫休眠卵的快速生产方法，是将经扩大培养的轮虫接种到微绿球藻中，添加甲基睾丸酮浓度10-30μg/L，接种轮虫密度。0.5ind/mL，微绿球藻2500-5000转/分钟离心10分钟或采用絮凝沉淀收集，用轮虫培养液调制藻浓度至3×106ind/mL，培养光照20-40W日光灯管2只，持续光照；温度25-28℃，生产期间不再添加食物，5天后收获。
本发明中使用培养基均为常用培养基，其中轮虫通用培养基为人工配置培养基（EPA配方），每升含有NaHCO3 96mg 、CaSO4.2H2O  60mg、MgSO4.7H2O 123mg、KCl 4mg。根据需要利用HCl和NaOH调节pH值7.5左右。
微藻培养基为常用BBM培养基，每升含有KNO3 250mg，CaCl2.2H2O 25mg， MgSO4.7H2O 75mg， K2HPO4 175 mg, NaH2PO4 175mg，NaCl 25 mg 微量元素和维生素各2mL。
甲级睾丸酮10mg溶解在1000μL 4%的丙酮中低温保存。生产中适宜添加剂量为30μg/L。
光照采用20-40W日光灯，光照时间24小时，生产温度控制在25-30℃，每日摇动若干次或利用旋转培养装置，转速10-15转/分钟。
本发明的原理为：利用轮虫密度拥挤效应和激素调节轮虫生活史原理，将孵化的个体在短时间内迅速扩大种群密度，抑制食物供给，使轮虫在短时间内形成休眠卵。
该方法操作简便，快速，经济，便于推广应用，能在短期内获得大量轮虫休眠卵。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例中所说的轮虫是从养殖水体挑选的单个体，室内“克隆”培养分离培养获得。起始材料-轮虫休眠卵为间歇性收集4℃带水或干燥-18℃保藏。
实施例1 ：轮虫单克隆挑选
（1）种类筛选
利用13号浮游物网从养殖池塘表层捞取活体样本200mL。带回实验室，加入过滤池塘水稀释到5L。按10 ppm浓度加入95%敌百虫乳剂，10分钟后过滤，挑选1个携带非混交雌体，移入微孔细胞培养板中。微孔加入微绿球藻浓度3×106ind/mL的 EPA混合悬液。在20-40W日光灯下连续光照培养、温度25-28°C。2天后在体视显微镜下检查，分离、扩大培养。
（2）扩大培养
用16×150 mm 试管，加入10mL利用轮虫培养液EPA和离心微藻配制的悬液，在20-40W日光灯下连续光照培养、温度25-28°C。扩大培养2天后备用。
实施例2：轮虫休眠卵生产实例
甲基睾丸酮浓度10、15、30、50和1000μg/L，接种轮虫密度0.5ind/mL，微绿球藻2500-5000转/分钟离心10分钟或采用絮凝沉淀，用EPA调制藻浓度3×106ind/mL，培养光照20-40W日光灯管2只，持续光照。温度25-28℃，生产期间不再添加食物，5天后收获。休眠卵生产量为（见表1）：不添加激素平均产量166 ind/10mL，添加10μg/L甲级睾丸酮的平均产量为178.75ind /10mL，添加15μg/L时，平均产量为186.75 ind/10mL，添加30μg/L时平均产量202.25 ind/10mL。添加50和1000μg/L具有毒性和抑制作用（平均产量分别为40.25 ind/10mL和13.75ind/10mL）。统计分析显示：添加30μg/L时能显著增加休眠卵产量（ p=0.02）。
表1.5日轮虫休眠卵产量实验
组别 对照 10 15 30 50 1000
1 173 176 150 182 15 10
2 156 178 235 232 16 5
3 159 171 215 201 108 20
4 176 190 147 194 22 20
平均产量 166 178.75 186.75 202.25 40.25 13.75
注：激素浓度为μg/L     休眠卵数量单位个/10mL。

Claims (2)

1. 一种淡水轮虫休眠卵的快速生产方法，是将经扩大培养的轮虫接种到微绿球藻中，添加甲基睾丸酮10-30μg/L；接种轮虫密度0.5ind/mL，微绿球藻2500-5000转/分钟离心10分钟浓缩收集或采用絮凝沉淀收集，用轮虫培养液调制藻密度至3×106ind/mL，培养光照20-40W日光灯管2只，持续光照；温度25-28℃，生产期间不另添加食物，5天后收获。
2.根据权利要求1所说的快速生产方法，其特征在微绿球藻（Nanochloris oculata），微绿球藻采用BBM配方恒温连续关照培养沉淀收集休眠卵、低温无光保藏。
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