CN103052716A - 包括氨基醇的酶氧化的生产聚胺的方法 - Google Patents

包括氨基醇的酶氧化的生产聚胺的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103052716A
CN103052716A CN2010800494726A CN201080049472A CN103052716A CN 103052716 A CN103052716 A CN 103052716A CN 2010800494726 A CN2010800494726 A CN 2010800494726A CN 201080049472 A CN201080049472 A CN 201080049472A CN 103052716 A CN103052716 A CN 103052716A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alcohol
enzyme
amino
polyamine
alcoholdehydrogenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800494726A
Other languages
English (en)
Inventor
B·豪尔
D·K·恩格马克卡西姆吉
P·贝里隆德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of CN103052716A publication Critical patent/CN103052716A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/84—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds obtained by reactions otherwise than those involving only carbon-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
    • C08G73/0213—Preparatory process
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D21H17/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its constitution; Paper-impregnating material characterised by its constitution
    • D21H17/20—Macromolecular organic compounds
    • D21H17/33—Synthetic macromolecular compounds
    • D21H17/46—Synthetic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • D21H17/54—Synthetic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds obtained by reactions forming in the main chain of the macromolecule a linkage containing nitrogen
    • D21H17/56—Polyamines; Polyimines; Polyester-imides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C9/00—After-treatment of cellulose pulp, e.g. of wood pulp, or cotton linters ; Treatment of dilute or dewatered pulp or process improvement taking place after obtaining the raw cellulosic material and not provided for elsewhere
    • D21C9/08—Removal of fats, resins, pitch or waxes; Chemical or physical purification, i.e. refining, of crude cellulose by removing non-cellulosic contaminants, optionally combined with bleaching
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D21H21/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its function, form or properties; Paper-impregnating or coating material, characterised by its function, form or properties
    • D21H21/02—Agents for preventing deposition on the paper mill equipment, e.g. pitch or slime control

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种使用酶来生产聚胺的方法；特别是涉及一种在水性环境中进行的方法；用所述方法生产的聚胺；以及所述聚胺用于造纸、固定酶或用于制备药物或化妆品组合物的用途。本发明还涉及一种原位再生辅因子NAD(P)+的新方法。

Description

包括氨基醇的酶氧化的生产聚胺的方法
本发明涉及一种使用酶来生产聚胺的方法；特别是涉及一种在水性环境中进行的方法；用所述方法生产的聚胺；以及所述聚胺用于造纸、固定酶或用于制备药物或化妆品组合物的用途。本发明还涉及一种用于原位再生辅因子NAD(P)+的新方法。 
发明背景 
聚胺，如PEI(聚乙烯亚胺)是具有十分广泛应用的阳离子聚合物。PEI及其衍生物被用于例如纸浆和纸的制造中以克服由树脂和机械木浆提取物造成的生产问题( D，Stange A，Linhart F，用于伴行消除和增加造纸功效的先进生产概念(Advanced Product Concepts for Concomitant Elimination and Increased Efficiency of Paper Manufacture)，Wochenblatt für Papierfabrikation 1996，124：889-892，894-895)。聚合物的荷电性也使其可用于例如酶的固定(Grunwald P，Freder R，Gunsser W，聚乙烯亚胺作为酶固定载体材料的应用(Application of polyethylene imine as carrier material for enzyme immobilization)Naturwissenschaften 1981，68：525-526)；(de Lathouder KM，van Benthem DTJ，Wallin SA，Mateo C.，Fernandez Lafuente R，Guisan JM，Kapteijn F，Moulijn JA，作为酶载体的聚乙烯亚胺(PEI)官能化的蜂窝状陶瓷载体：制备和性能(Polyethyleneimine(PEI)functionalized ceramic monoliths as enzyme carriers：Preparation and performance)Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 2008，50：20-27)。 
最近已经在基因传递方面取得了一些进展，其中已经表明PEI(有时与PEG联合)增加了DNA/RNA的细胞渗透(Lungwitz U，Breunig M，Blunk T， 
Figure BDA0000159556120000012
A，以聚乙烯亚胺为基础的非病毒基因传递系统 (Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems)European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2005，60：247-266)；(Belenkov AI，Alakhov VY，Kabanov AV，Vinogradov SV，Panasci LC，Monia BP，Chow TY.用普朗尼克P85进行接枝的聚乙烯亚胺增强了Ku86反义传递和体内的电离辐射功效(Polyethyleneimine grafted with pluronic P85 enhances Ku86antisense delivery and the ionizing radiation treatment efficacy in vivo)，Gene Therapy 2004，11：1665-1672.)；(Jeong JH，Kim SW，Park TG.一种以自组装的ODN-PEG杂交共轭胶束为基础的新的反义寡核苷酸传递系统(A new antisense oligonucleotide delivery system based on self-assembled ODN-PEG hybrid conjugate micelles).Journal of Controled Release.2003，93：183-191)。因为引入了AND(反义寡核苷酸)的概念，并且在2006年获得了诺贝尔奖，因此，这是一种十分有前景的应用。反编码(anticoding)基因的成功传递将治愈多种疾病如HIV、癌症、自身免疫应答等。聚胺的另一些治疗应用包括缓解与皮肤疾病和化疗有关的症状。 
目前可获得的聚胺如PEI和树状聚合物是在有机溶剂中合成的。乙烯亚胺的常规聚合是以开环为基础的，因此，将重复单元的长度限制为氮原子之间两个碳。 
因此，本发明所要解决的问题是提供一种制备聚胺的方法，其可以在水性环境中进行，并且并不限于C2-构造块。 
发明概述： 
上述问题通过提供一种新的聚胺合成方法得到了解决，该方法可以在水性介质中进行并且如所附权利要求书中进一步定义的那样，该方法是以某些酶的应用为基础的。 
具体地讲，提供了如图1和2中概述的合成聚胺的新方法。通过醇脱氢酶如马肝醇脱氢酶(HLADH)的作用(用NAD+/NADH作为辅因子)(图1)或通过醇氧化酶的作用(用分子氧作为电子受体)(图2)，在水性环境中将氨基醇例如3-氨基-1-丙醇氧化成氨基醛。由此形成的氨基醛在中等酸性pH 下自发性与亚胺反应，从而形成聚亚胺。然后，通过还原，例如用氰基硼氢化钠还原来将所述聚亚胺转化成聚胺。聚合物中的重复单元可在氮原子之间具有两个或多个碳原子、可具有官能团，并且可以是手性化合物，其仅受酶接受作为底物的起始氨基醇的容量的限制。在自然界中发现了许多具有不同的底物特异性和/或活性的醇脱氢酶和醇氧化酶。 
为了支持底物的完全转化，应用一种用于辅因子再生的方法是有利的。迄今为止，NAD+的再生一直是个问题；一种方法利用酶NADH-氧化酶，其是一种十分昂贵的物质(Riebel BR，Gibbs PR，Wellborn WB，Bommarius AS，得自NADH的NAD+和得自NADPH的NADP+的辅因子再生：得自旧金山乳杆菌的NADH氧化酶(Cofactor Regeneration of both NAD+from NADH an d NADP+from NADPH：NADH Oxidase from Lactobacillus sanfranciscensis)Advanced Synthesis & Catalysis 2003，345：707-712)。 
本发明以乙酸乙烯酯的自发水解为基础，提出了一种简单的新方法，该方法可以与酶聚合反应相结合。 
在使用醇氧化酶的情况中，通过将该反应与氧化酶、特别是过氧化氢酶的催化活性结合，所形成的过氧化氢被迅速转化成水和氧，从而使反应平衡进一步向醛一侧移动，并因此支持了底物的完全转化。 
附图说明：
图1：用醇脱氢酶催化的聚胺合成的图示。将pH降至pH 4.5以使聚亚胺形成。然后，用氰基硼氢化物进行聚亚胺的还原。在原位用所形成的乙醛来进行辅因子的再循环，所述乙醛是在碱性pH下或者用酯酶进行乙酸乙烯酯的自发水解后形成的。 
图2：用醇氧化酶催化的聚胺合成的图示。将pH降至pH 4.5以使聚亚胺形成。然后，用氰基硼氢化物进行聚亚胺的还原。该酶利用氧并且在原位用过氧化氢酶进一步氧化所形成的过氧化氢。 
图3：排阻色谱。从顶端开始：由2-苯基甘氨醇制得的聚合物、对照(PEI1800)(未起作用(也许是上样过多))、由3-氨基丙醇制得的聚合物、由D-丙氨醇制得的聚合物、由L-丙氨醇制得的聚合物。各聚合物具有约1000Da的分子量(Mw标准品未示出)。 
图4：由2-苯基甘氨醇形成的低聚物的MALDI-TOF光谱。 
图5：PEI1800的MALDI-TOF光谱。 
本发明的特定实施方案 
1.在第一个实施方案中，本发明提供了一种生产通式(4)的聚胺的方法，特别是在含水反应介质中进行的方法， 
Figure BDA0000159556120000041
其中 
n是至少1的整数； 
残基X各自独立地表示任选地携带一个或多个相同或不同的选自N、O和S的杂原子的直链或支链的饱和或不饱和的亚烃基残基； 
残基R各自独立地表示氢原子或任选地携带一个或多个选自N、O和S的杂原子的直链或支链的饱和或不饱和的烃基残基；并且 
其中末端H2N-和HO-CH2-基团可以缩合形成一种分子内氨基键， 
其包括的步骤有 
a)将通式(1)的氨基醇酶氧化成相应的式(2)的氨基醛，通式(1)的氨基醇可以是手性或非手性的，并且可以以光学纯的形式或异构体混合物的形式应用， 
H2N-X-CRH-OH→H2N-X-CRO 
    (1)          (2) 
其中X和R如上面所定义； 
b)使式(2)的氨基醛聚合形成聚亚胺(3)， 
Figure BDA0000159556120000051
其中X、R和n如上面所定义；和 
c)将式(3)的聚亚胺还原，优选化学还原成相应的式(4)的聚胺。 
2.实施方案1的方法，其中步骤a)的氨基醇是其中X＝-CH2-CH2-的式(1)化合物。 
3.实施方案1或2的方法，其中步骤a)的酶是经选择的脱氢酶和氧化酶，特别是醇脱氢酶E.C.1.1.1.1、醇脱氢酶(NADP+)1.1.1.2、烯丙基-醇脱氢酶E.C.1.1.1.54、醇脱氢酶[NAD(P)+]E.C.1.1.1.71、芳基-醇脱氢酶E.C.1.1.1.90、芳基-醇脱氢酶(NADP+)E.C.1.1.1.91、3-羟基苄基-醇脱氢酶E.C.1.1.1.97、紫苏醇脱氢酶E.C.1.1.1.144、长链醇脱氢酶E.C.1.1.1.192、松柏醇脱氢酶E.C.1.1.1.194、肉桂醇脱氢酶E.C.1.1.1.195、环己醇脱氢酶E.C.1.1.1.245、4-(羟基甲基)苯磺酸酯脱氢酶E.C.1.1.1.257、3-甲基丁醛还原酶E.C.1.1.1.265、S-(羟基甲基)谷胱甘肽脱氢酶E.C.1.1.1.284、醇脱氢酶(受体)E.C.1.1.99.8、聚乙烯基-醇脱氢酶(受体)E.C.1.1.99.23、甲醛脱氢酶(谷胱甘肽)E.C.1.2.1.1和醇氧化酶，E.C.1.1.3.13、芳基-醇氧化酶E.C.1.1.3.7、仲-醇氧化酶E.C.1.1.3.18、长链醇氧化酶E.C.1.1.3.20、聚乙烯基-醇氧化酶E.C.1.1.3.30、香草醇氧化酶E.C.1.1.3.38。 
4.实施方案3的方法，其中所述酶是马肝醇脱氢酶(HLADH)并且具有SEQ ID NO：1的多肽序列，或者是具有SEQ ID NO：2的多肽序列的醇氧化酶；或者是它们的与SEQ ID NO：1或2的序列具有至少60％序列一致性的突变体或变型。 
5.实施方案3或4的方法，其中在步骤a)中，如果使用醇脱氢酶，则用NAD+作为氧化的辅因子；或者如果使用醇氧化酶，则该反应在需氧条件下进行。 
6.实施方案5的方法，其中通过用相同的脱氢酶将醛或酮还原成相应的醇来由酶再生NAD+辅因子。 
7.实施方案5的方法，其中所述醛或酮是通过活性酯的水解形成的。 
8.前面实施方案之一的方法，其中化学还原步骤c)是在存在NaBH3CN或Pd/H2的情况下进行的。 
9.前面实施方案之一的方法，其中得到分子量范围为Mn＝100至7,000,000、200至1,000,000、250至500,000、300至100,000、350至50,000、400至10,000或450至5,000的聚胺。特定的Mn范围为500至4,000或500至3,000或500至2,000。 
10.前面实施方案中任意一项的方法，其中步骤b)优选地是在具有使得可形成聚亚胺的pH，特别是范围为3.5至6或4至5的pH的水性介质中进行的。 
11.前面实施方案之一的方法，其中步骤a)是在pH范围为6至10，例如7至9或7.5至8的水性介质中进行的。 
12.前面实施方案之一的方法，其中所述酶是以溶解、分散或固定形式使用的。 
13.可用前面实施方案中任意一项的方法获得的聚胺。 
14.如实施方案3和4中任意一项所定义的酶用于生产聚胺的用途。 
15.可用实施方案1至12中任意一项的方法获得的聚胺用于造纸；固定酶或用于制备药物或化妆品组合物的用途。 
16.实施方案15的用途，其中所述药物组合物选自用于改善DNA和/或RNA的细胞渗透的组合物；用于治疗皮肤疾病的软膏；用于治疗化疗副作用的组合物；药物传递组合物，特别是定位缓慢释放活性剂的药物传递组合物。 
17.一种再生在脱氢酶催化的由所述酶的第一底物S1生成第一种氧化的产物P1的氧化反应过程中产生的NAD(P)+的方法，该方法包括通过使所述的脱氢酶催化的氧化反应与第二个同时进行的脱氢酶催化的由不同于S1和P1的所述酶的第二底物S2生成不同于P1和S1的第二个还原的产 物P2的还原反应相结合来再生NAD(P)+，其中所述底物S2是由前体分子PrS2原位产生的并且该前体分子PrS2自发分解或通过不同于所述脱氢酶的第二种酶的作用进行分解。 
18.实施方案17的方法，其中所述脱氢酶是醇脱氢酶(ADase)。 
19.实施方案17或18的方法，其中所述PrS2分子是羧酸的乙烯酯，其在酶化学水解时被分解成相应的羧酸和作为第二底物S2的乙醛。 
20.实施方案17至19中任意一项的方法，其中所述第一底物S1是一种可被所述ADase氧化的醇。 
21.实施方案20的方法，其中所述醇是上面式(1)的氨基醇。 
22.实施方案18至21中任意一项的方法，其中所述再生反应是在水性介质中进行的。 
本发明的另一些实施方案：
1.定义 
除非另有说明，否则将应用下面的定义： 
在上面式(1)至(4)的化合物中： 
参数n是至少1的整数，例如1至10,000、1至5,000、2至1,000、3至800、4至600、5至500、10至200、15至100、20至80或30至60，特别是2至100、3至50、4至30、5至20。 
残基X相同或不同并且表示任选地被取代的直链或支链的；饱和或不饱和的亚烃基残基，其在链中任选地携带一个或多个，如1、2或3个选自N、O和S的杂原子；特定的残基X是支链C1-C10或C1-C5，例如C1、C2、C3、C4或C5亚烃基残基或支链C3-C10或C3-C6，例如C3、C4、C5或C6亚烃基残基，其任选地携带一个或两个杂原子，特别是一个O或S原子，从而形成一种醚或硫醚基团。 
残基R相同或不同并且是任选地被取代的直链或支链的；饱和或不饱和的烃基残基，其任选地携带一个或多个选自N、O和S的杂原子；如直 链C1-C10或C1-C5，例如C1、C2、C3、C4或C5烃基残基或支链C3-C10或C3-C6，例如C3、C4、C5或C6烃基残基。 
X和R的任选取代基选自羟基、巯基、氨基和卤素，如F、Cl、Br。 
直链C1-C10烃基残基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。支链C3-C10烃基残基是例如异丙基、异丁基、异戊基、2，2-二甲基丙基、异己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基2，3-二甲基丁基、异庚基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2，3-三甲基丁基、异辛基、3-甲基庚基、4-甲基庚基、2，2-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2，3-三甲基戊基、2，2，4-三甲基戊基、2，2，5-三甲基戊基和异壬基。 
支链C1-C10亚烃基残基包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基和亚癸基。支链C3-C10亚烃残基是例如亚异丙基、亚异丁基、亚异戊基、2，2-二甲基亚丙基、亚异己基、3-甲基亚戊基、2，2-二甲基亚丁基、2，3-二甲基亚丁基、亚异庚基、3-甲基亚己基、2，2-二甲基亚戊基、2，3-二甲基亚戊基、2，4-二甲基亚戊基、2，2，3-三甲基亚丁基、异辛基、3-甲基亚庚基、4-甲基亚庚基、2，2-二甲基亚己基、2，4-二甲基亚己基、2，5-二甲基亚己基、2，2，3-三甲基亚戊基、2，2，4-三甲基亚戊基、2，2，5-三甲基亚戊基和亚异壬基。 
除非另有说明，否则如本文明所用的措辞“氨基醇”或“氨基醛”或“聚胺”或“聚亚胺”是指未荷电或荷电的形式如铵盐或荷电和未荷电形式的混合物形式的该类化合物。可以用常规反荷离子如氢氧根或卤化物阴离子如F-、Cl-、Br-来形成铵盐。 
“中间产物”被理解为一种在化学或生物化学过程中以不一定是可直接分析探测的浓度短暂或连续形成的产物。可由所述方法中取出或分离出所述“中间产物”，用第二种化学或生物化学反应进一步对其进行转化。 
本文所用的“基本纯的”蛋白或酶意指如用聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)处理后的单一谱带所证明的那样，所需的精制蛋白基本不含污染性细胞组分。术语“基本纯的”还意指描述一种通过本领域 技术人员所用的一种或多种纯度或均匀性特性鉴定表明同质的分子。例如，基本纯的蛋白或酶将在标准实验偏差内就例如如下参数而言表现出恒定和可再现的特性：分子量、色谱迁移、氨基酸组成、氨基酸序列、被封闭或未被封闭的N-末端、HPLC洗脱特性、生物学活性以及其它参数。然而，该术语并不意味着排除所述蛋白或酶与其它化合物的人工或合成的混合物。此外，该术语也不意味着排除任选地从重组宿主分离出来的包含所述蛋白或酶的融合蛋白。 
“缩合的”或“缩合”是指分子间或特别是分子内形成一种化学键并同时形成一种低分子量的化学副产物，特别是水。 
“酶催化的”反应是指在至少一种酶(其可以是粗品、即未纯化的形式或基本纯的形式)的催化作用下或在存在表达所述酶并且任选地将所述酶散布到细胞外间隙中的整个微生物的情况下进行的反应。 
“水性反应介质”是一种液体介质，该液体组分基本由水或水与至少一种有机液体的混合物组成，所述有机液体可至少部分或特别是完全与水混合，如低分子量的链烷醇如甲醇或乙醇、或醚类如THF或其它液体如DMSO、二恶烷、乙腈。该有机组分的比例特别是低于该混合物总体积的80体积-％，特别是低于50、40、30、20、10或5体积-％。有机组分的数量和类型特别是使得本发明的反应不会受到负面影响、特别是不会被抑制的数量和类型。 
水性反应介质还可包含其它组分例如缓冲组分以进一步有利于反应按照本发明的方式进行。 
辅因子的“再生”是指部分或完全重建进行特定的酶反应所需的辅因子活性形式，所述酶反应否则将消耗所述活性辅因子。所述再生可与所述酶反应同时进行，即，可以与所述酶反应结合，或者可以分步进行。 
酯的“水解”可以被酶例如酯酶催化，或者可以通过应用适宜的pH值，例如通过将pH值调节至高于pH 7的碱性pH范围内来进行催化。 
2.本发明所用的蛋白 
本发明并不限于明确提及的蛋白，而是还延伸至其功能等同物。 
在本发明的范围内，具体公开的酶的“功能等同物”或“类似物”或“功能突变”是其也具有所需生物学功能或活性，例如酶活性的各种多肽。 
例如，如本文所定义的那样，“功能等同物”是指在用于酶活性的试验中表现出至少1至10％，或至少20％，或至少50％，或至少75％，或至少90％更高或更低的酶活性。 
本发明的“功能等同物”还特别意指在上述氨基酸序列的至少一个序列位置中具有不同于具体说明的氨基酸的氨基酸，但具有一种上述生物学活性的突变体。因此，“功能等同物”包括可通过一个或多个氨基酸添加、取代、缺失和/或反转获得的突变体，其中所述改变可发生在任何序列位置，只要它们产生具有本发明性质的突变体即可。如果突变体和未改变的多肽之间的反应方式在质上是一致的，即，例如如果以不同的速率转化相同的底物，则也提供了功能等同物。在下表中显示了适宜的氨基酸取代的实例： 
Figure BDA0000159556120000111
上面意义上的“功能等同物”也是所述多肽的“前体”以及该多肽的“功能衍生物”和“盐”。 
“前体”是具有或不具有所需生物学活性的天然或合成的多肽前体。 
“盐”的表述意指本发明蛋白分子的羧基的盐以及氨基的酸加成盐。羧基的盐可以以已知的方式制备并且包括无机盐，例如钠、钙、铵、铁和锌盐，以及与有机碱，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等形成 的盐。本发明也包括酸加成盐，例如与无机酸，如盐酸或硫酸形成的盐和与有机酸，如乙酸和草酸形成的盐。 
本发明多肽的“功能衍生物”也可以用已知技术在功能性氨基酸侧基上或在N-末端或C-末端上制备。该类衍生物包括例如羧酸基团的脂族酯、可通过与氨或伯或仲胺反应获得的羧酸基团的酰胺；通过与酰基反应生成的游离氨基的N-酰基衍生物；或通过与酰基反应生成的游离羟基的O-酰基衍生物。 
“功能等同物”当然还包括可以由其它生物体获得的多肽以及天然存在的变型。例如，可以通过序列比较来确定同源序列区域，并可以根据本发明的具体参数确定等同的酶。 
“功能等同物”还包括本发明多肽的片段，优选本发明多肽的独立结构域或基序，其例如表现出所需的生物学功能。 
此外，“功能等同物”还包括融合蛋白，该融合蛋白具有上述多肽序列之一或由其衍生的功能等同物和至少一种另外的在功能性N-末端或C-末端缔合中的功能不同的异源序列(即不存在融合蛋白部分的明显的相互功能损失)。这些异源序列的非限制性实例有例如单肽、组氨酸锚或酶。 
本发明中的“功能等同物”还包括具体公开的蛋白的同系物。它们具有上述的百分比同一性值。所述值是指与具体公开的氨基酸序列的同一性，并且可根据Pearson和Lipman的算法(Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448)来进行计算。该同一性％值也可以由BLAST比对、Blastp算法(蛋白-蛋白BLAST)来计算或可以通过应用如下给出的Clustal设置来计算。 
例如，该同一性可利用Informax(USA)公司的Vector NTI Suite 7.1程序，用具有如下设置的Clustal法(Higgins DG，Sharp PM.在微型计算机上进行的快速灵敏的多序列比对(Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer).Comput Appl.Biosci.1989 Apr；5(2)：151-1)来计算： 
多重比对参数： 
Figure BDA0000159556120000131
成对比对参数： 
或者，同一性可以根据Chenna，Ramu，Sugawara，Hideaki，Koike，Tadashi，Lopez，Rodrigo，Gibson，Toby J，Higgins，Desmond G，Thompson，Julie D.使用Clustal程序系列的多序列比对(Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs).(2003)Nucleic Acids Res 31(13)：3497-500，网址：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#和如下设定来确定 
Figure BDA0000159556120000133
Figure BDA0000159556120000141
本发明同源多肽的同一性百分比特别是指相对于本文具体描述的氨基酸序列之一的全长而言的氨基酸残基的同一性百分比。 
在一种可能的蛋白糖基化的情况中，本发明的“功能等同物”包括去糖基化或糖基化形式的上面所指定类型的蛋白以及可通过改变糖基化方式获得的改性形式。 
本发明的蛋白或多肽的该类功能等同物或同系物可以通过诱变，例如点突变、蛋白的延长或缩短来产生。 
可以通过对突变体例如缩短突变体的组合数据库进行筛选来确定本发明蛋白的该类功能等同物或同系物。例如，可以通过核酸水平的组合突变，例如通过合成寡核苷酸混合物的酶催化连接来产生蛋白变型的丰富多彩的数据库。可以用多种方法来产生得自简并寡核苷酸序列的潜在同系物的数据库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后可将该合成基因连接在适宜的表达载体中。应用简并基因组使得以在混合物中提供全部序列，其编码潜在蛋白序列的所需集合。简并寡核苷酸的合成方法是本领域技术人员已知的(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。 
在现有技术中，已知有许多技术可用于筛选由点突变或缩短产生的组合数据库的基因产物和用于筛选具有所选择性质的基因产物的cDNA文库。为了迅速筛选由本发明同系物的组合突变产生的基因文库，可对这些技术进行调整。所述技术最常用于筛选大的基因文库，该方法以高通量分析为基础，包括在可被复制的表达载体中克隆该基因文库，用所得载体数据库对适宜的细胞进行转化和使该组合基因在其中所需活性的检测有助于 载体分离的条件下进行表达，其中所述载体编码其产物被检测的基因。可以将Recursive Ensemble Mutagenesis(REM)(一种增加数据库中功能突变频率的技术)与所述筛选试验组合，以鉴定同系物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89：7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。 
3.所要保护方法的另一些实施方案 
3.1.概要 
本发明的方法可以分批、半分批(semibatchwise)或连续进行。 
可在本发明方法期间存在的酶或酶混合物可以以产生该酶或酶混合物的活细胞、所收获的细胞、死细胞、渗透化的细胞、粗细胞提取物、部分纯化的提取物或基本纯(约90-99.5重量％)或完全纯(约99.5-99.9重量％或100重量％)(各自按照酶制剂的总干重计)的形式存在。 
所述酶可以以游离或固定形式应用。固定的酶被固定到适宜的惰性载体中。在例如EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-OS 100193773以及其中所参考的其它文献中对适宜的载体进行了描述。适宜的载体有例如粘土，如高岭土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交换剂、合成聚合物，如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨酯和聚烯烃，如聚乙烯和聚丙烯。载体通常是以颗粒形式，优选多孔形式使用的。粒度通常在不高于5mm，或不高于2mm的范围内。酶或细胞也可以与戊二醛交联。在例如J.Lalonde和A.Margolin，“酶的固定(Immobilization of Enzymes)”，K.Drauz和H.Waldmann，“有机合成中的酶催化(Enzyme Catalysis in Organic Synthesis)”2002，第III卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中对适宜的固定技术进行了描述。 
本发明的方法可以在本领域技术人员已知的普通反应器中和以不同的规模范围、例如从实验室规模(反应体积从数毫升至数十升)到工业规模(反应体积从数升至数千立方米)进行。 
如果酶以固定形式应用，则可以使用反应器。该反应器通常能够对至少一种酶的量、至少一种底物的量、pH、反应介质的温度和循环进行控制。当至少一种酶存在于活细胞中时，该方法将是一种发酵作用。在这种情况下，将在生物反应器(发酵器)中发生生物催化的生产，在所述生物反应器中，可以控制活细胞适宜生存条件所需的参数(例如具有营养物的培养基、温度、通气、存在或不存在氧或其他气体、抗生素等)。本领域技术人员熟悉化学反应器或生物反应器，例如熟悉用于从实验室规模至工业规模放大化学或生物技术方法的操作，或熟悉用于优化过程参数的操作，并且在文献中也对这些操作进行了广泛描述(对于生物技术方法而言，见例如Crueger和Crueger，Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie，2.Aufl.，R.Oldenbourg Verlag，München，Wien，1984；或Biotechnology，第3卷，第2版，Rehm等人编辑，(1993)，特别是第II章)。 
可以用物理或机械手段，如超声或射频脉冲、弗氏细胞压碎器(French presses)或化学手段，如低渗介质、存在于介质中的分解酶和去污剂或该类方法的组合来对包含至少一种本发明酶的细胞进行渗透化。去污剂的实例有洋地黄皂苷、正-十二烷基麦芽苷、辛基糖苷、 
Figure BDA0000159556120000161
X-100、 
Figure BDA0000159556120000162
20、脱氧胆酸、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐)、 
Figure BDA0000159556120000163
P40(乙基苯酚聚(乙二醇醚)等。 
本领域技术人员可通过进行有限次优化实验容易地确定适宜的酶含量。 
3.2pH值和缓冲剂 
3.2.1氧化步骤a) 
在本发明的方法中，可以以纯的形式应用对映体纯的或手性底物或显示一种立体异构体富集的立体异构体的混合物。 
根据酶(脱氢酶或氧化酶)或酶系统(与辅因子再生酶组合)的最佳条件，通式(1)的底物向通式(2)的氨基醛的转化通常是在约6.0至约10.0，例如约7至9.5的pH下进行的。可预先通过有限次常规实验容易地确定最佳pH。 例如，如果使用毕赤酵母(Pichia pastoris)的醇氧化酶，则pH范围为6.5至7.5，更特定地为约7.0至7.5。或者，得自蒙古野马(Equus caballus)的醇脱氢酶需要更碱性的pH并且反应可以在约8.5至9.5，更特别是约9.0至9.5的pH范围内进行。 
可以使用任何适用于上述pH值或pH值范围的缓冲液，例如MOPS、HEPES、PIPES、磷酸盐、硼酸盐和Tris缓冲液。在7.5至9.0的pH范围内，可以使用Tris缓冲液，而在6.0至8.0的pH范围内，可以使用磷酸盐或MOPS缓冲液。缓冲液的浓度可以根据处理条件进行变化并且可位于1mM至200mM，例如1mM至100mM、1mM至50mM的范围内。缓冲液的浓度特别是可以为2mM至25mM或3mM至10mM，如5mM。 
3.2.2聚亚胺形成步骤b) 
为了诱发聚合，通过加入适宜的无机或有机酸来降低反应介质的pH。例如，可以加入无机酸如H2SO4或HCl。pH将被降低至支持氨基醛单体聚合的范围。所述pH的范围通常为约3.5至5.5，特别是4至5。可将酸加入到步骤a)获得的反应混合物中，或者也可以在除去其一种或多种组分例如由酶灭活产生的蛋白质物质后用步骤a)的反应混合物来进行，所述酶灭活可逐渐发生或者通过加入适宜的灭活剂如EDTA或过氧化氢发生，或者通过除去未转化的反应试剂或辅因子再生所需的共反应剂而发生。然而，对于步骤b)的进行而言，通常不需要进行预处理。 
3.2.3还原步骤c) 
还原可以在步骤b)之后进行或者与步骤b)同时进行。以足以提供所需的亚胺基团氢化度(优选完全氢化)的量加入适于将水溶液中的所述聚亚胺还原成相应聚胺的还原剂，例如氰基硼氢化钠或硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、H2/Pd。例如，还原剂可以以2至10倍摩尔过量的量加入。 
3.2.4 NAD(P)+辅因子再生 
在将辅因子再生与氨基醛形成步骤a)相结合的情况下，适于辅因子再生的pH和缓冲液条件基本与上面步骤a)的相同。在与其他辅因子消耗性氧化还原酶和不同底物相结合的情况下，本领域技术人员将意识到可以根据新系统调整具体的处理条件，其可通过有限次常规实验来完成。 
3.3.反应温度和持续时间 
本发明的方法步骤可以在所应用的酶可耐受或有助于所用的所需化学或酶转化反应的任何温度下进行。 
酶转化的温度可能与包含所述酶或用作它们的提取来源的生物体或微生物的最佳生长温度相关，但可由本领域技术人员容易地确定。 
一般而言，所述方法步骤可以在20℃至70℃，特别是40℃至50℃的温度下进行。反应温度的实例是约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃和约60℃。 
各步骤可进行至底物和相应产物之间达到平衡，但也可以较早停止。反应时间通常为约1分钟至25小时，特别是约10分钟至6小时或约1小时至4小时。 
3.4共溶剂 
如果需要，为了增加底物的溶解度，可在反应介质中包括一种或多种有机共溶剂。适宜有机共溶剂的实例有丁-2-醇、甲基-叔-丁基醚(MTBE)和二甲基亚砜(DMSO)。对于所述共溶剂而言，可应用低于水溶液中饱和度的浓度，例如约6％或更低、约5％或更低、约4％或更低、约3％或更低、约2％或更低、或约1％或更低的浓度。 
3.5其它反应物 
可以根据需要以适宜的量向反应系统中加入进行本发明反应(底物转化、辅因子再生)所需的另外一些反应物或共反应剂。 
例如，可以以非化学计量量例如0.001至10、0.01至5或0.1至1mM的量加入辅因子(NAD(P)+)。 
例如，可以以适宜数量，例如与氨基醇相比1至10或2至5倍摩尔量过量的数量加入用于辅因子再生的活性酯，如乙酸乙烯酯。 
例如，可以以适宜数量，例如0.0001至10、0.001至10、0.01至5或0.1至1mM的数量加入过氧化氢。 
3.6聚合物分离 
本发明的方法可进一步包括聚合物回收步骤。术语“回收”包括从反应介质中萃取、收获、分离或纯化所述化合物。可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法来回收化合物，所述方法非限制性地包括用常规树脂(例如，阴离子或阳离子交换树脂、非离子吸附树脂等)进行处理、用常规吸附剂(例如，活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、氧化铝等)进行处理、改变pH、溶剂萃取(例如，用常规溶剂如醇、乙酸乙酯、己烷等)进行处理、蒸馏、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、冷冻干燥等及其组合。 
例如，可以通过首先除去残余的微生物或蛋白，或者如果基本不再存在该类杂质的话，通过降低聚合物在水性环境中的溶解度并(任选地重复)用适宜的有机溶剂、优选基本上水不溶性的有机溶剂萃取来从反应中回收聚合物。适宜的溶剂有例如二氯甲烷、甲苯、二氯甲烷、乙酸丁酯、二异丙基醚、苯、MTBE或乙酸乙酯，但并不限于此。 
可在通过加入适宜的碱如NaOH将该混合物的pH增加至约pH 12至14并例如通过加入盐的水溶液如盐水调节离子强度后进行萃取。 
下面的实施例仅仅是为了对本发明进行说明。对本领域技术人员显而易见的大量可能的变型也落在本发明的范围内。 
实验部分：
实施例1：用马肝醇脱氢酶(HLADH)或醇氧化酶(AOX)在水性介质中进行的聚胺制备 
在图1和图2中概述了所述用于在水性介质中进行聚胺合成的两种不同方法。 
在HLADH方法中，通过使用乙酸乙烯酯来完成辅因子再生。乙酸乙烯酯在pH 9.1下迅速水解，分解成乙酸和乙醛。HLADH将乙醛还原成乙醇，从而由NADH形成NAD+。在用EDAT或H2O2将酶灭活后，通过用N2鼓泡来除去未反应的乙醛。对于醇脱氢酶HLADH而言，通过在340nm下测定NADH的形成来对该反应进行分光光度监测。用不同浓度的各种氨基醇来获得Michaelis-Menten动力学常数。 
在AOX方法中，不需要进行辅因子再生。该反应进一步通过过氧化氢酶催化的过氧化氢分解来驱动。通过加入过氧化物酶和2，2′-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)在420nm下测定过氧化氢的形成来对该AOX反应进行分光光度监测。 
a)材料 
本实验所用化学品的纯度等级＞98％并购自SigmaAldrich。 
所用的AOX(毕赤酵母(Pichia pastoris))在碱性pH下对氨基醇没有活性，因此，该合成是在pH 7.0下进行的。该酶可商业得自SigmaAldrich。 
醇脱氢酶(蒙古野马(Equus caballus))在中性pH下没有任何活性，但是在碱性pH下具有良好的反应速率。这一反应是在pH 9.1下进行的。该酶可商业得自SigmaAldrich。 
b)聚胺合成 
b1)使用AOX的聚胺合成 
将选自3-氨基丙醇、D-丙氨醇、L-丙氨醇或2-苯基甘氨醇的氨基醇溶解于100mM MOPS-缓冲液中至5mM至3M的浓度，体积为1mL至300mL，用HCl将其pH设置至7.0。加入AOX和过氧化氢酶并将该溶液在25℃下培养48小时。将AOX的量调至在24小时内完全转化所需的量， 使用至少10倍酶单位过量的过氧化氢酶。加入乙酸将其pH降低至4.5，并加入3当量NaCNBH3。 
b2)使用HLADH的聚胺合成 
与两倍摩尔过量的乙酸乙烯酯一起将所述氨基醇溶解于水中(1mL至300mL)至5mM至3M的浓度，用NaOH/HCl将其pH设置至9.1，在这一pH下，底物本身具有缓冲容量。加入ADH(醇脱氢酶)和NAD+(0.5mM)并将该溶液在25℃下培养48小时。调整酶的量以在24小时内获得完全转化。 
其后，加入30％H2O2至过氧化物浓度为酶的10当量并将该反应培养4小时。通过用浸入到该混合物中的注射器用N2鼓泡4小时来除去乙醛。然后，通过加入HCl将其pH降低至4.5并加入3当量NaCNBH3。 
c)产物的萃取 
将反应混合物与一当量的盐水混合并通过加入NaOH将其pH设置至14。其后，通过与二氯甲烷一起反复振摇来从水溶液中分离聚合物/低聚物。其后，将二氯甲烷相冷冻干燥得到粘性物质，其为低聚胺/聚胺。 
d)定性 
将该物质(制备的聚合物/低聚物)溶解于二甲基亚砜中并用分子排阻色谱(SEC)对其进行处理。 
或者，将范围为1μL至200μL的不同数量的物质(制备的聚合物/低聚物)溶解于含有3％三氟乙酸和10g/L 2，5-二羟基苯甲酸的0.5mL乙腈/水(1∶1)溶液中并用使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)的质谱对其进行处理，在这种情况中，用飞行时间(TOF)来测量离子质量。 
e)结果和讨论 
聚胺化合物的分子量取决于氨基醛的形成程度。对于使用HLADH的反应而言，加入过量的乙酸乙烯酯以获得底物的完全转化，通过用N2向该混合物中鼓泡来除去所形成的乙醛。使用AOX时，从环境空气中溶解的氧和过氧化氢酶的作用确保了完全转化。 
为了形成亚胺，通过加入乙酸和/或HCl将其pH降至4.5。当使用醇脱氢酶时，由活性酯的水解形成的乙酸在这一pH下发挥缓冲剂的作用，因此，在这种情况中可以使用HCl。 
在表1中概括了AOX催化的不同氨基醇转化的结果，在表1中也显示了动力学常数。 
表1：AOX的动力学常数，pH 7.0，100mM MOPS-缓冲液 
Figure BDA0000159556120000221
通过加入过氧化物酶和ABTS形成过氧化氢，在420nm下用分光光度测量对反应进行监测。 
E-值＝一种对映体相对于另一种对映体而言作为底物的比例优先选择性(proportional preference)，通过除以特异性常数来定义。特异性常数被定义为kcat/KM。 
对于2-氨基-1-苯基乙醇(2-苯基甘氨醇)而言，因为底物在加入ABTS时沉淀，因此不能使用该测定方法。其中用连苯三酚或4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑(Purpald)代替ABTS来测量形成的醛的其它实验没有给出结论。然而，这些实验确实表明酶正在催化所述反应并出现了醛。这些实验中，速率的再现性并不令人满意；因此，没能获取动力学数据。 
在表2中概括了由HLADH催化的不同氨基醇的转化结果，表2中也显示了动力学常数。 
表2：HLADH的动力学常数，pH 9.1，100mM CHES-缓冲液 
通过形成NADH，在340nm下，用分光光度测量对HLADH催化的反应进行监测。 
在用二氯甲烷萃取(将该水溶液与1当量盐水混合并将其pH设置至14)后，在蒸发掉溶剂后，在溶解于DMSO后，用分子排阻色谱(SEC)对该物质进行处理。图3显示了该色谱图。 
估计其多分散性在1.04至1.07之间变化(用软件Millenium完成)。 
也可以用质谱对萃取的物质进行处理。在不同的浓度下，将该物质溶解于含有3％TFA和10g/L 2，5-二羟基苯甲酸的水/乙腈1∶1中。图4显示了由2-苯基甘氨醇形成的聚合物的光谱。 
设想存在不含苯基的亚基，并设想该亚基来自于起始材料中的污染物。如果存在丙氨醇作为污染物，由于其是比2-苯基甘氨醇更好的底物，其将在剩余分子被转化成醛之前被混入。该亚基对应57.06的质量差，而具有苯基的亚基对应119.07的质量差。可以用这些质量差来解释图4光谱中一些峰的质量差异。 
也在MALDI-TOF上对商品化的PEI1800进行了测试，图5给出了其光谱。在图5中存在很多系列的聚合物，产生了十分不清楚的光谱。预计峰之间的质量差为大约43。 
Figure IDA0000159556170000011
Figure IDA0000159556170000021

Claims (22)

1.一种生产通式(4)的聚胺的方法
Figure FDA0000159556110000011
其中
n是至少1的整数；
残基X各自独立地表示任选地携带一个或多个相同或不同的选自N、O和S的杂原子的直链或支链的饱和或不饱和的亚烃基残基；
残基R各自独立地表示氢原子或任选地携带一个或多个选自N、O和S的杂原子的直链或支链的饱和或不饱和的烃基残基；并且
其中末端H2N-和HO-CH2-基团可以缩合形成一种分子内氨基键；
其包括的步骤有：
a)将通式(1)的氨基醇酶氧化成相应的式(2)的氨基醛，通式(1)的氨基醇可以是手性或非手性的，并且可以以光学纯的形式或异构体混合物的形式应用，
H2N-X-CRH-OH→H2N-X-CRO
    (1)          (2)
其中X和R如上面所定义；
b)使式(2)的氨基醛聚合形成聚亚胺(3)，
Figure FDA0000159556110000012
其中X、R和n如上面所定义；和
c)将式(3)的聚亚胺还原成相应的式(4)的聚胺。
2.权利要求1的方法，其中步骤a)的氨基醇是其中X＝-CH2-CH2-的式(1)化合物。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤a)的酶选自脱氢酶和氧化酶，特别是醇脱氢酶E.C.1.1.1.1、醇脱氢酶(NADP+)1.1.1.2、烯丙基-醇脱氢酶E.C.1.1.1.54、醇脱氢酶[NAD(P)+]E.C.1.1.1.71、芳基-醇脱氢酶E.C.1.1.1.90、芳基-醇脱氢酶(NADP+)E.C.1.1.1.91、3-羟基苄基-醇脱氢酶E.C.1.1.1.97、紫苏醇脱氢酶E.C.1.1.1.144、长链醇脱氢酶E.C.1.1.1.192、松柏醇脱氢酶E.C.1.1.1.194、肉桂醇脱氢酶E.C.1.1.1.195、环己醇脱氢酶E.C.1.1.1.245、4-(羟基甲基)苯磺酸酯脱氢酶E.C.1.1.1.257、3-甲基丁醛还原酶E.C.1.1.1.265、S-(羟基甲基)谷胱甘肽脱氢酶E.C.1.1.1.284、醇脱氢酶(受体)E.C.1.1.99.8、聚乙烯基-醇脱氢酶(受体)E.C.1.1.99.23、甲醛脱氢酶(谷胱甘肽)E.C.1.2.1.1和醇氧化酶，E.C.1.1.3.13、芳基-醇氧化酶E.C.1.1.3.7、仲-醇氧化酶E.C.1.1.3.18、长链醇氧化酶E.C.1.1.3.20、聚乙烯基-醇氧化酶E.C.1.1.3.30、香草醇氧化酶E.C.1.1.3.38。
4.权利要求3的方法，其中所述酶是马肝醇脱氢酶(HLADH)并且具有SEQ ID NO：1的多肽序列，或者是具有SEQ ID NO：2的多肽序列的醇氧化酶；或者是它们的与SEQ ID NO：1或2的序列具有至少60％序列一致性的突变体或变型。
5.权利要求3或4的方法，其中在步骤a)中，如果使用醇脱氢酶，则用NAD+作为氧化的辅因子；或者如果使用醇氧化酶，则该反应在需氧条件下进行。
6.权利要求5的方法，其中通过用相同的脱氢酶将醛或酮还原成相应的醇来通过酶再生NAD+辅因子。
7.权利要求5的方法，其中所述醛或酮是通过活性酯的水解形成的。
8.前面权利要求中任意一项的方法，其中化学还原步骤c)是在存在NaBH3CN或Pd/H2的情况下进行的。
9.前面权利要求中任意一项的方法，其中获得分子范围为Mn＝100至7,000,000的聚胺。
10.前面权利要求中任意一项的方法，其中步骤b)是在具有支持形成聚亚胺的pH、优选3.5至6的pH的水性介质中进行的。
11.前面权利要求中任意一项的方法，其中步骤a)是在pH范围为6至10的水性介质中进行的。
12.前面权利要求中任意一项的方法，其中所述酶是以溶解、分散或固定的形式使用的。
13.可用前面权利要求中任意一项的方法获得的聚胺。
14.如权利要求3和4中任意一项所定义的酶用于生产聚胺的用途。
15.可用权利要求1至12中任意一项的方法获得的聚胺用于造纸；固定酶；或制备药物或化妆品组合物的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述药物组合物选自用于改善DNA和/或RNA的细胞渗透的组合物；用于治疗皮肤疾病的软膏；用于治疗化疗副作用的组合物；药物传递组合物。
17.一种再生在脱氢酶催化的由所述酶的第一底物S1生成第一种氧化的产物P1的氧化反应过程中产生的NAD(P)+的方法，该方法包括通过使所述的脱氢酶催化的氧化反应与第二个同时进行的脱氢酶催化的由不同于S1和P1的所述酶的第二底物S2生成不同于P1和S1的第二个还原的产物P2的还原反应相结合来再生NAD(P)+，其中所述底物S2是由前体分子PrS2产生的。
18.权利要求17的方法，其中所述脱氢酶是醇脱氢酶(ADase)。
19.权利要求17或18的方法，其中所述PrS2分子是羧酸的乙烯酯，其在水解时被分解成相应的羧酸和作为第二底物S2的乙醛。
20.权利要求17至19中任意一项的方法，其中所述第一底物S1是一种可被所述ADase氧化的醇。
21.权利要求20的方法，其中所述的醇是上面式(1)的氨基醇。
22.权利要求18至21中任意一项的方法，其中所述再生反应是在水性介质中进行的。
CN2010800494726A 2009-11-02 2010-10-29 包括氨基醇的酶氧化的生产聚胺的方法 Pending CN103052716A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09174796 2009-11-02
EP09174796.4 2009-11-02
PCT/EP2010/066449 WO2011051433A2 (en) 2009-11-02 2010-10-29 Process for the production of polyamines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103052716A true CN103052716A (zh) 2013-04-17

Family

ID=43922676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800494726A Pending CN103052716A (zh) 2009-11-02 2010-10-29 包括氨基醇的酶氧化的生产聚胺的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9085786B2 (zh)
EP (1) EP2510104A2 (zh)
JP (1) JP2013509166A (zh)
CN (1) CN103052716A (zh)
WO (1) WO2011051433A2 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010139651A2 (en) 2009-06-04 2010-12-09 Basf Se A process for the enzymatic reduction of enoates
JP7408569B2 (ja) 2018-12-12 2024-01-05 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
EP3895707B1 (en) 2018-12-12 2023-10-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4048148A (en) * 1975-05-09 1977-09-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polyazomethine fibers and films
US20030224028A1 (en) * 2002-05-13 2003-12-04 Societe L'oreal S.A. Metal complexes for promoting skin desquamation and/or stimulating epidermal renewal
CN101027293A (zh) * 2004-08-17 2007-08-29 国立大学法人富山大学 光反应性化合物、光反应性聚胺和产生聚胺片的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19931847A1 (de) 1999-07-09 2001-01-11 Basf Ag Immobilisierte Lipase
DE10019380A1 (de) 2000-04-19 2001-10-25 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von kovalent gebundenen biologisch aktiven Stoffen an Polyurethanschaumstoffen sowie Verwendung der geträgerten Polyurethanschaumstoffe für chirale Synthesen
DE10019377A1 (de) 2000-04-19 2001-10-25 Basf Ag Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf Trägermaterialien und Verwendung der mit biologisch aktiven Stoffen geträgerten Materialien für chirale Synthesen
FR2839449B1 (fr) 2002-05-13 2006-12-08 Oreal Utilisation d'au moins un complexe de metal comme desquamant
JPWO2006080519A1 (ja) * 2005-01-31 2008-06-19 協和醗酵工業株式会社 ジアミン誘導体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4048148A (en) * 1975-05-09 1977-09-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polyazomethine fibers and films
US20030224028A1 (en) * 2002-05-13 2003-12-04 Societe L'oreal S.A. Metal complexes for promoting skin desquamation and/or stimulating epidermal renewal
CN101027293A (zh) * 2004-08-17 2007-08-29 国立大学法人富山大学 光反应性化合物、光反应性聚胺和产生聚胺片的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAVNEET KAUR等: "Designing the Polyamine Pharmacophore: Influence of N-Substituents on the Transport Behavior of Polyamine Conjugates", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2510104A2 (en) 2012-10-17
WO2011051433A2 (en) 2011-05-05
JP2013509166A (ja) 2013-03-14
US9085786B2 (en) 2015-07-21
US20120225932A1 (en) 2012-09-06
WO2011051433A3 (en) 2012-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Laue et al. Continuous application of chemzymes in a membrane reactor: asymmetric transfer hydrogenation of acetophenone
CA2408922C (en) Enzyme-catalyzed polyamides and compositions and processes of preparing and using the same
CN103052716A (zh) 包括氨基醇的酶氧化的生产聚胺的方法
ES2391552T3 (es) Composiciones de poliamina-epiclorohidrina con alto contenido en sólidos y subproductos reducidos
Martins de Oliveira et al. Functionalization of porous cellulose with glyoxyl groups as a carrier for enzyme immobilization and stabilization
JPH025885A (ja) 光学活性なシアンヒドリンの酵素的製造方法
Wang et al. Expanding application of immobilized Candida antarctica lipase B: A green enzyme catalyst for Knoevenagel condensation reaction
Ohkubo et al. Shape-and stereo-selective esterase activities of cross-linked polymers imprinted with a transition-state analogue for the hydrolysis of amino acid esters
Salvi et al. Organic-inorganic epoxide hydrolase hybrid nanoflowers with enhanced catalytic activity: Hydrolysis of styrene oxide to 1-phenyl-1, 2-ethanediol
CN100519756C (zh) 新的醛缩酶及光学活性ihog及莫那亭的制备方法
CN117070576A (zh) 制备肼类化合物的方法
CN117143934A (zh) 一种酶化学法制备(r)-戊唑醇的方法
CA1277267C (en) Immobilization of enzymes
CN116024282A (zh) 一种高纯度(s)-降烟碱的合成方法
CN115786418A (zh) 一种固定化酶催化的高纯度(s)-降烟碱的合成方法
TW589301B (en) Process for preparing enantiomerically enriched N-derivatized lactams
US20030070783A1 (en) Reduced byproduct high solids polyamine-epihalohydrin compositions
CN111607631B (zh) 一种(s)-邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法
EP4272556A1 (en) Covalently bound diamines and their use
Yuan et al. Preparation of oligochitosan via In situ enzymatic hydrolysis of chitosan by amylase in [Gly] BF4 ionic liquid/water homogeneous system
KR100657204B1 (ko) 효소적 방법에 의한 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤의 제조 방법
Talukdar et al. Low-Valent Titanium Mediated Deprotection of N-Allyl/Benzyl Amines: A New Approach
Zhang et al. Biocatalytic asymmetric ring-opening of meso-epoxides to enantiopure cyclic trans-β-amino alcohols involving a key amine transaminase
CN116024295A (zh) 一种由麦斯明生成高纯度(s)-降烟碱的酶催化方法
KR20030029501A (ko) 실리카겔 또는 복합실리카겔 담체를 이용한 효소의 고정화방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130417