CN103045675A - 一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，属于微生物发酵制药领域。本方法将制备得到的多孔陶瓷用发酵液进行处理后干燥待用；将纤维堆囊菌分别经M26固体、液体培养基培养后，得到菌悬液；将菌悬液稀释后接种于发酵液中，再向其中加入经处理过的多孔陶瓷，振荡培养。本发明提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生产菌株的方法，在埃博霉素B发酵生产时，通过对其生产菌株纤维堆囊菌进行固定，这样可以为在液体环境中生长的粘细菌细胞提供一个固体附着面，本方法能够提高发酵产量，降低抗肿瘤药物埃博霉素的生产成本，操作步骤简单易行，可以放大至工业化生产，为埃博霉素的工业化生产奠定了实验基础。

Description

一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法

技术领域

本发明属于纤维堆囊菌发酵技术领域，涉及一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法。

背景技术

埃博霉素B（Epothilone B，EPO-906）是由纤维堆囊菌产生的一种已进入临床抗肿瘤治疗研究的药物。目前埃博霉素的发酵产量很低，主要由两个原因。第一是埃博霉素对其生产菌株有毒性抑制作用，这在很大程度上限制了埃博霉素的发酵产量。虽然可以利用大孔吸附树脂XAD-16来解决这方面的困难，但树脂对发酵液中其他物质的非特异性吸附也为埃博霉素产量的提高带来新的困难。第二，纤维堆囊菌复杂的细胞行为。它们往往在固体培养基上能良好的生长、代谢并产生埃博霉素，但在液体培养基中生长时代谢行为往往会发生改变；如细胞成团生长，并且内外细胞的状态不一致；细胞存在自溶性现象；代谢状态不稳定等。因此开发一种能够作为埃博霉素生产菌株的固体化材料，并将其用于发酵液中将极大地增加埃博霉素的产量。

多孔陶瓷作为一种新型陶瓷材料，一直倍受生物、环保领域科研人员的青睐，这是因为它作为生物催化剂的载体具有气孔率高、化学稳定性好、比表面积大、体积密度小以及耐高温、耐腐蚀等特点，另外多孔陶瓷还具备无毒害作用、稳定性优异、传质性能好、机械强度高、生物亲合性好、操作简单、价廉易得等优点。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，为纤维堆囊菌生产埃博霉素B提供生长代谢的固体附着面，从而提高发酵产量，降低抗肿瘤药物埃博霉素的生产成本。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，包括以下步骤：

1）将纤维堆囊菌接种于M26固体培养基上培养，然后将培养得到的菌体接种于M26液体培养基中，振荡培养；

2）将经M26液体培养基培养后的液体，高速搅拌使菌体均匀打散后，离心收集沉淀，加入无菌水重悬得纤维堆囊菌到菌悬液；

3）按100mL发酵液接种5～10mg菌种的比例，将纤维堆囊菌菌悬液接种于发酵液中，然后加入菌种质量50～400倍经发酵液浸泡处理过的硅藻土基多孔陶瓷材料块，在25～35℃，180～220rpm摇床培养72～96h。

所述在温度28～30℃，转速180～200r/min下摇床培养72～96h。

所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌ATCC25532。

所述在M26固体培养基上培养时其培养条件为：30℃下，恒温培养箱中培养72～96h；

所述在M26液体培养基上培养时其培养条件为：30℃，200rpm摇床振荡培养72～96h。

步骤2）所述的高速搅拌时间为10～20min。

步骤2）和步骤3）所述的离心过程是在4℃下，8000rpm，离心10min。

所述的多孔陶瓷的孔径在5～10μm，比表面积为40～50m²/g，能够吸附固定粘细菌。

所述的多孔陶瓷抗折强度为15～20MPa，吸水率达到50%。

所述的多孔陶瓷的处理为：

多孔陶瓷块经150℃高温灭菌10～30min，自然冷却后，加入发酵液完全覆盖多孔陶瓷块并高出10～50mm，常温下摇晃0.5～1h，静置1～2h后倾去发酵液，100～105℃干燥后待用。

所述的多孔陶瓷块在发酵时悬浮在发酵液中。

所述的100mL发酵液中多孔陶瓷块的加入量为1～2g。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，在埃博霉素B发酵生产时，通过添加硅藻土基多孔陶瓷对生产菌株纤维堆囊菌提供附着物，帮助其在培养液中固定，这样可以为在液体环境中生长的粘细菌细胞提供一个固体附着面，从一定程度上满足粘细菌生长代谢产生埃博霉素的固体培养微环境，克服游离发酵培养时成团成片生长所带来的传质不均匀、代谢不稳定等难题。

进一步，本发明的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，埃博霉素生产菌株被硅藻土基多孔陶瓷固定，也有利于缓解埃博霉素对其生产菌株的反馈抑制作用，从而提高发酵产量，降低抗肿瘤药物埃博霉素的生产成本，

本发明的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，从所要固定的微生物菌体粘细菌聚集扩展的生长特点出发，所采用的硅藻土基多孔陶瓷的孔径在5～10μm，抗折强度为15～20MPa，比表面积为40～50m²/g，吸水率达到50%，能够良好的吸附固定粘细菌，吸附量达到了10～15mg/g，并且在吸附固定粘细菌过程中磨损较少。

本发明的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，简单易行，可以进行工业化操作，为埃博霉素的工业化生产奠定了现实性基础。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生产菌株的方法，从所要固定的微生物菌体粘细菌聚集扩展的生长特点出发，选择合适的硅藻土基多孔陶瓷，孔径在5～10μm，抗折强度为15～20MPa，比表面积为40～50m²/g，吸水率达到50%。

进一步，给出以下制备方法：

1）称取过60目筛的生硅藻土40g，煅烧硅藻土35g，粘土15g，混合后加入20g水，在球磨机中球磨30min，将得到的浆液倒入搪瓷盘中，于105℃下干燥过夜。

2）将干燥后的料浆研磨后过40目筛，再加入过80目筛的木屑1g，石蜡1g进行混合后过40目筛3次，使其混合均匀；

缓慢喷洒2g水后过3次40目筛，进行整粒，装入密封袋密封静置3h。

3）将经整粒的混合粉料用粉末压片机在5MPa下压制尺寸为Ф10×20mm样品；

4）将成型后的样品在300℃干燥3h后，放入电阻炉中1000℃保温30min使造孔剂（木屑和石蜡）挥发，得到硅藻土基多孔陶瓷。

基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌的埃博霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：

1.多孔陶瓷的前处理

将尺寸为Ф20×10mm的硅藻土基多孔陶瓷块于150℃高温灭菌30min，自然冷却。将维堆囊菌发酵用发酵液加到多孔陶瓷样品中，完全覆盖样品后高出约50mm，常温下缓慢摇晃1h，静置2h后倾去发酵液，多孔陶瓷干燥待用。

2.菌悬液制备

将一环新鲜的纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）接种于M26固体培养基上，30℃恒温培养箱中培养72～96h；将培养后的菌体接入100mL的M26液体培养基中，30℃，200rpm摇床培养72～96h；培养结束后倒弃一部分液体，将剩余的液体转移至含有搅拌子和玻璃珠的三角瓶中，磁力搅拌器上高速搅拌10～20min，使菌团打散打匀为止，离心收集打匀的菌体，重悬于30～50mL的无菌水中，形成菌悬液。

用无菌水将菌悬液稀释10～20倍后，离心收集沉淀，沉淀烘干后称干重，可得菌悬液稀释后的浓度，再换算成原来菌悬液的浓度，单位为mg/mL。在进行下一步发酵培养时可以按照一定的接种量来量取菌悬液，防止接种量过大而引起的传质不良或溶氧不足等现象的发生。

3.发酵培养

按100mL接种5～10mg菌种的比例，将纤维堆囊菌（Sorangiumcellulosum）菌悬液接种于发酵液中，然后加入菌种质量50～400倍预处理过的多孔陶瓷，在25～35℃，180～220rpm摇床培养72～96h。

以上所用到的菌种、培养基具体为：

所述的菌种为纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）即可，具体的可选用纤维堆囊菌ATCC25532。

M26固体培养基成分为琼脂20g/L，土豆淀粉8.0g/L，大豆蛋白胨2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母粉2.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，CaCl₂1.0g/L，EDTA-Fe³⁺1mL/L，微量元素1mL/L，调节pH为7.2；

M26液体培养基成分为土豆淀粉8.0g/L，大豆蛋白胨2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母粉2.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，CaCl₂1.0g/L，EDTA-Fe³⁺1mL/L，微量元素1mL/L，调节pH为7.2。

发酵培养时发酵液成分为：酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、MgSO₄·7H₂O5g/L、FeSO₄·7H₂O0.1g/L、CaCl₂5g/L、MnCl₂0.1g/L和葡萄糖10g/L，调节pH为7.2。

发酵培养结束后，按照埃博霉素B常规提取纯化方法分离得到。

而在发酵培养结束后，测定多孔陶瓷吸附固定粘细菌量，由于多孔陶瓷在吸附固定粘细菌过程中受到发酵液长时间的冲刷，会使其边缘受到一定的磨损，所以要用灼烧干重法；即称取一定量的固定化载体95℃干燥至恒重，质量为m₀，再在电阻炉中500℃灼烧1h，自然冷却后称重m₁，则菌体干重为m₀－m₁。检测结果表明对粘细菌的吸附固定量能够达到20mg/g。

综上所述，本方法通过向埃博霉素B的生产菌株纤维堆囊菌培养液中，加入经处理过的多孔陶瓷，为在液体环境中生长的纤维堆囊菌提供一个固体附着面，满足粘细菌生长代谢产生埃博霉素的固体培养微环境，从而提高发酵产量，降低抗肿瘤药物埃博霉素的生产成本。

多孔陶瓷载体与菌体的结合量受温度、转速、载体量等因素的影响，升高一定的温度可以提高菌体向多孔陶瓷表面积空隙内扩散迁移的速率，若温度太高，又容易解吸；

较高的转速可以达到较好的传质效果，有利于菌体的生长于固定，但也不能超过菌体的最高培养转速；多孔陶瓷载体的载体量同样也会影响载体与菌体的结合，当载体量过多时，随着菌体的生长，总菌体量过大，妨碍了培养基的传质扩散，导致发酵液中溶氧不足，难以维持菌体的呼吸生长需要。

本发明所提供的方法选择的条件适宜（100mL发酵液中接种5～10mg，多孔陶瓷载体量1～2g，温度28～30℃，摇床转速180～200r/min，时间72～96h），操作步骤简单易行，可以放大至工业化生产，为埃博霉素的工业化生产奠定了实验基础。

下面给出具体的发酵实施例。

实施例1

一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

1）将尺寸为Ф20×10mm的硅藻土基多孔陶瓷在150℃下，高温灭菌30min，自然冷却后，装入三角瓶中，加入发酵液，液面完全覆盖多孔陶瓷样品后高出约50mm，常温下缓慢摇晃1h，静置2h后倾去发酵液，多孔陶瓷105℃干燥后待用。

2）将一环新鲜的纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）接种于M26固体培养基上，30℃恒温培养箱中培养72h；

将培养后的菌体接入100ml的M26液体培养基中，30℃，200rpm摇床培养72h；

培养结束后倒弃一部分液体，将剩余的液体转移至含有搅拌子和玻璃珠的三角瓶中，磁力搅拌器上高速搅拌10min，使菌团打散打匀为止，离心收集打匀的菌体，将其悬浮在30mL的无菌水中；

用无菌水把1mL的菌悬液稀释至10mL，放入提前称重好的刻度离心管（质量为a mg）中，4℃8000rpm离心10min后，弃去上清液，在105℃的恒温干燥箱中烘干至恒重，称重（质量为b mg），则菌体的干重为（b－a）mg；换算至菌悬液的浓度为（b－a）mg/mL。

3）取10mL稀释过的菌悬液，接入含有100mL发酵液和2g多孔陶瓷的500mL培养瓶中，30℃200rpm摇床培养96h。

实施例2

一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

1）将尺寸为Ф20×10mm的硅藻土基多孔陶瓷在150℃下，高温灭菌30min，自然冷却后，装入三角瓶中，加入发酵液，液面完全覆盖多孔陶瓷样品后高出约50mm，常温下缓慢摇晃1h，静置2h后倾去发酵液，多孔陶瓷105℃干燥后待用。

2）同例1中的方法一定浓度的制备菌悬液。

3）取5ml稀释过的菌悬液，接入装有100mL发酵液和1g多孔陶瓷的500mL培养瓶中，28℃180rpm摇床培养96h。

实施例3

一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

1）将尺寸为Ф20×10mm的硅藻土基多孔陶瓷在150℃下，高温灭菌30min，自然冷却后，装入三角瓶中，加入发酵液，液面完全覆盖多孔陶瓷样品后高出约50mm，常温下缓慢摇晃1h，静置2h后倾去发酵液，多孔陶瓷105℃干燥后待用。

2）同例1中的方法制备一定浓度的菌悬液。

3）取10ml稀释过的菌悬液，接入装有100mL发酵液和1.5g多孔陶瓷的500mL培养瓶中，30℃220rpm摇床培养96h。

实施例4

一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

1）将尺寸为Ф20×10mm的硅藻土基多孔陶瓷在150℃下，高温灭菌30min，自然冷却后，装入三角瓶中，加入发酵液，液面完全覆盖多孔陶瓷样品后高出约50mm，常温下缓慢摇晃1h，静置2h后倾去发酵液，多孔陶瓷105℃干燥后待用。

2）同例1中的方法制备一定浓度的菌悬液。

3）取8ml稀释过的菌悬液，接入装有100mL发酵液和2g多孔陶瓷的500mL培养瓶中，30℃220rpm摇床培养72h。

用500mL的培养瓶要比平时所用的250mL或300mL的培养瓶的传质效果好，由于所用的菌体纤维堆囊菌是严格好氧的，因此必须保证良好的溶氧环境。

实施例5

一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

1）将尺寸为Ф20×10mm的硅藻土基多孔陶瓷在150℃下，高温灭菌30min，自然冷却后，装入三角瓶中，加入发酵液，液面完全覆盖多孔陶瓷样品后高出约50mm，常温下缓慢摇晃1h，静置2h后倾去发酵液，多孔陶瓷105℃干燥后待用。

2）同例1中的方法制备一定浓度的菌悬液。

3）取8ml稀释过的菌悬液，接入装有100mL发酵液和1.5g多孔陶瓷的500mL培养瓶中，30℃200rpm摇床培养72h。

Claims (10)

1.一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将纤维堆囊菌接种于M26固体培养基上培养，然后将培养得到的菌体接种于M26液体培养基中，振荡培养；

2）将经M26液体培养基培养后的液体，高速搅拌使菌体均匀打散后，离心收集沉淀，加入无菌水重悬得纤维堆囊菌到菌悬液；

3）按100mL发酵液接种5～10mg菌种的比例，将纤维堆囊菌菌悬液接种于发酵液中，然后加入菌种质量50～400倍经发酵液浸泡处理过的硅藻土基多孔陶瓷材料块，在温度25～35℃，180～250r/min摇床培养72～96h。

2.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，所述在温度28～30℃，转速180～200r/min下摇床培养72～96h。

3.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌ATCC25532。

4.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，所述在M26固体培养基上培养时其培养条件为：30℃下，恒温培养箱中培养72～96h；

所述在M26液体培养基上培养时其培养条件为：30℃，200rpm摇床振荡培养72～96h。

5.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，步骤2）所述的高速搅拌时间为10～20min；

步骤2）和步骤3）所述的离心过程是在4℃下，8000rpm，离心10min。

6.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵生的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷为硅藻土基多孔陶，其孔径在5～10μm，比表面积为40～50m²/g，能够吸附固定粘细菌。

7.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵生的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷为硅藻土基多孔陶，其抗折强度为15～20MPa，吸水率达到50%。

8.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵生的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷的处理为：

多孔陶瓷块经150℃高温灭菌10～30min，自然冷却后，加入发酵液完全覆盖多孔陶瓷块并高出10～50mm，常温下摇晃0.5～1h，静置1～2h后倾去发酵液，100～105℃干燥后待用。

9.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，所述的多孔陶瓷块在发酵时悬浮在发酵液中。

10.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，所述的100mL发酵液中多孔陶瓷块的加入量为1～2g。