CN103045649A - 一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法 - Google Patents
一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法，该方法包括以下步骤：⑴筛选出微生物絮凝剂菌株Candidaanglica；⑵制备Candidaanglica菌株一级种子液；⑶制备发酵培养基；⑷制备具有絮凝活性的发酵液；⑸纯化提取：将具有絮凝活性的发酵液经纯化提取、冷冻干燥后即得絮凝剂粗提物。本发明工艺简单，发酵周期短，易于实施，环境效益和经济效益显著，适合工业化生产和推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物絮凝剂的制备方法，尤其涉及一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法。
背景技术
我国是马铃薯产量大国，其种植面积世界第二，与小麦和玉米同为工业淀粉的主要加工原料。近年来，随着淀粉加工业的迅速发展，我国年加工马铃薯约300万吨，产生废水约800万吨。马铃薯淀粉废水属于高浓度有机废水，含有各种糖类、多种氨基酸、脂肪、有机酸、维生素以及酶类等，化学需氧量(COD)高，约为8000~40000 mg/L，可生化性良好，具有作为发酵培养基的潜质。若如果直接排放，会造成水体富营养化等环境危害。
目前，马铃薯淀粉废水处理方法包括物理化学方法和生物处理法，但在实际运用中都会遇到各种问题，如采用传统絮凝剂如聚丙烯酰胺、氯化铁、硫酸铝，不仅对环境造成二次污染，而且对人类健康造成威胁；生物处理法包括厌氧生物处理和好氧生物，但生物处理受温度影响大，而且我国马铃薯淀粉加工一般为9月至第二年3月，此时间段我国北方气温较低，因此生物处理效率低、耗时长且占用场地大。
微生物絮凝剂（MBF）是一类由微生物产生的可使液体中不易沉降的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子凝集、沉淀的高分子物质，包括糖蛋白、多聚糖、蛋白质、纤维素、脂类、糖脂和核酸。微生物絮凝剂具有生物可降解性和其降解产物对生态环境无害以及絮凝效果好、使用范围广等特点，所以MBF越来越得到各国研究者的关注。马铃薯淀粉废水营养丰富，因此可以作为絮凝微生物生长生产MBF的营养基质，这样不仅减轻了马铃薯淀粉废水的处理压力，而且实现了马铃薯淀粉废水的资源再利用，具有较好的环境效益和经济效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易于实施的以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法，包括以下步骤：
⑴筛选出微生物絮凝剂菌株，该菌株为Candida anglica，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No：7032（保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年12月24日）；
⑵Candida anglica菌株一级种子液的制备：将Candida anglica斜面菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基1~2环，在25~30℃、摇床转速为130~180 r/min的条件下培养24~48h，即得细胞浓度为1.2×106个/mL的一级种子液；
⑶发酵培养基的制备：选用化学需氧量COD为8200~8300 mg/L的马铃薯淀粉废水作为营养基质，按100 mL所述马铃薯淀粉废水添加1 mL甘油作为外加碳源，5 mg(NH4)2SO4作为氮源，10mg MgCl2和10 mg KH2PO4作为矿质营养，均质后即得发酵培养基；
⑷具有絮凝活性的发酵液的制备：将所述一级种子液以体积比8~12%的接种量接种于所述发酵培养基中，控制所述发酵培养基初始pH值为5~6，在25~30℃、摇床转速为130~180 r/min的条件下发酵时间45~55 h，即得具有絮凝活性的发酵液；
⑸纯化提取：将所述具有絮凝活性的发酵液以3500~4500r/min 速率离心20~40min，得到上清液A；在所述上清液A中加入其体积2~4倍的无水乙醇并在4~10℃条件下静置10~14 h后，以5000~7000 r/min速率离心10~30 min，得到沉淀物A；所述沉淀物充分溶解于去离子水中，再以3500~4500r/min速率离心20~40 min，去除不溶物，得到上清液B；所述上清液B中加入其体积2~4倍的无水乙醇并在4~10℃条件下静置10~14 h后，回收沉淀物B，对该沉淀物B进行冷冻干燥至恒重，即得絮凝剂粗提物。
所述步骤⑴中的菌株是指以污水处理厂二沉池的活性污泥为菌株分离材料，以马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)作为分离培养基，采用常规平板分离方法获得多株纯菌株，该多株纯菌株分别以1~2环接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在温度为25~30℃、速率为130~180r/min的条件下经揺瓶液体培养48h，测定其对高岭土具有絮凝活性后即得。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、据文献报道，张迎明利用筛选出的127号球菌对啤酒废水所产絮凝剂的高岭土悬浊液絮凝率为88.2%；王有乐利用两株根霉M9和M17对淀粉废水发酵的复合型微生物絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝率为92.67%。Wang等利用Klebsiella mobilis对牛奶加工废水产生的絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝率为95.4%；Xia等利用proteus mirabilis TJ-1所产絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝剂为93.13%。而采用本发明方法生产的微生物絮凝剂絮凝活性高，当在1L高岭土悬浊液中添加13.6mg本絮凝剂，其发酵液对高岭土悬浊液的絮凝率可达94.6%。
2、采用本发明方法生产微生物絮凝剂具有很好的环境效益，经发酵提取絮凝剂后的废水COD、SS、TN、TP、pH均大幅度下降，见表1。
表1 发酵后废水水质特性
从表1中可以看出，马铃薯淀粉废水经发酵提取絮凝剂后，CODCr降至562 mg/L，与原废水相比下降了8300 mg/L，CODCr去除率达到93.7%。虽然发酵后CODCr尚未达到《淀粉工业水污染物排放标准》（GB 25461-2010）中规定的直接排放标准（＜150 mg/L），但已大大降低了废水后续处理难度和压力。发酵后SS、TN和TP残留量很低，均达到了《淀粉工业水污染物排放标准》（GB 25461-2010）中规定的排放要求，不会产生新污染。同时，马铃薯淀粉废水发酵后pH值升至6.9，不必进行中和即达标。
3、采用本发明方法生产微生物絮凝剂具有一定的经济效益。首先，Candida anglica菌株利用马铃薯淀粉废水发酵生产微生物絮凝剂，达到了资源再利用的目的，马铃薯淀粉废水作为发酵营养基质价格低廉；其次，根据大量试验表明，采用该菌株发酵马铃薯淀粉废水，絮凝剂提取物得率为1.36 g/L。若以生物絮凝剂（有效成分含量95%-98%）市场价格计算，除去所添加药品费用成本，1 t废水经发酵所产絮凝剂能带来约1300元的利润；再次，采用Candida anglica菌株能够在不灭菌条件下利用马铃薯淀粉废水产生絮凝剂，节约了能耗；最后，废水经发酵后CODCr去除率达到93.7%，大大减少了二次废水后续处理费用。
4、本发明工艺简单，发酵周期短，适合工业化生产和推广。
具体实施方式
实施例1 一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法，包括以下步骤：
⑴筛选出微生物絮凝剂菌株，该菌株为Candida anglica，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No：7032（保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年12月24日）。
其中：菌株是指以污水处理厂二沉池的活性污泥为菌株分离材料，以马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)作为分离培养基，采用常规平板分离方法获得多株纯菌株，该多株纯菌株分别以1~2环接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在温度为25~30℃、速率为130~180r/min的条件下经揺瓶液体培养48h，测定其对高岭土具有絮凝活性后即得。
菌种的鉴定：运用26SrDNA序列分析对该菌株进行分子学鉴定，利用UNIQ-10柱式真菌基因组抽提试剂盒提取模版。26SrDNAD1/D2区引物：NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-，NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR反应体系组成：基因组DNA10 pmol，正向引物(10 μmol) 1 μL，反向引物(10 μmol) 1 μL，dNTP 1 μL，10×反应缓冲2液5 μL，TaqDNA聚合酶(5 u/μL) 0.25 μL，加水至50 μL。PCR反应程序设定：预变性98℃，5 mim；循环95℃35 s，55℃35 s，72℃40 s，35个循环，延伸8 min。PCR产物纯化采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒。测序结果提交Gen-Bank进行Blast分析，确定该菌株为Candida anglica。
⑵Candida anglica菌株一级种子液的制备：将Candida anglica斜面菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基1~2环，在25℃、摇床转速为130 r/min的条件下培养48h，即得细胞浓度为1.2×106个/mL的一级种子液。
⑶发酵培养基的制备：选用化学需氧量COD为8200~8300 mg/L的马铃薯淀粉废水作为营养基质，按100 mL马铃薯淀粉废水添加1 mL甘油作为外加碳源，5 mg(NH4)2SO4作为氮源，10mg MgCl2和10 mg KH2PO4作为矿质营养，均质后即得发酵培养基。
⑷具有絮凝活性的发酵液的制备：将一级种子液以体积比（mL）8%的接种量接种于发酵培养基中，控制发酵培养基初始pH值为5~6，在25℃、摇床转速为130 r/min的条件下发酵时间55 h，即得具有絮凝活性的发酵液。
⑸纯化提取：将具有絮凝活性的发酵液以3500r/min 速率离心40min，得到上清液A；在上清液A中加入其体积（mL）2倍的无水乙醇并在4℃条件下静置14 h后，以5000 r/min速率离心30 min，得到沉淀物A；沉淀物充分溶解于去离子水中，再以3500r/min速率离心40 min，去除不溶物，得到上清液B；上清液B中加入其体积（mL）2倍的无水乙醇并在4℃条件下静置14 h后，回收沉淀物B，对该沉淀物B在-20~-40℃条件下进行冷冻干燥至恒重，即得絮凝剂粗提物。
实施例2 一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法，包括以下步骤：
⑴筛选出微生物絮凝剂菌株，该菌株为Candida anglica，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No：7032（保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年12月24日）。
其中：菌株及菌种的鉴定同实施例1。
⑵Candida anglica菌株一级种子液的制备：将Candida anglica斜面菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基1~2环，在30℃、摇床转速为180 r/min的条件下培养24h，即得细胞浓度为1.2×106个/mL的一级种子液。
⑶发酵培养基的制备：选用化学需氧量COD为8200~8300 mg/L的马铃薯淀粉废水作为营养基质，按100 mL马铃薯淀粉废水添加1 mL甘油作为外加碳源，5 mg(NH4)2SO4作为氮源，10mg MgCl2和10 mg KH2PO4作为矿质营养，均质后即得发酵培养基。
⑷具有絮凝活性的发酵液的制备：将一级种子液以体积比（mL）12%的接种量接种于发酵培养基中，控制发酵培养基初始pH值为5~6，在30℃、摇床转速为180 r/min的条件下发酵时间45 h，即得具有絮凝活性的发酵液。
⑸纯化提取：将具有絮凝活性的发酵液以4500r/min 速率离心20min，得到上清液A；在上清液A中加入其体积（mL）4倍的无水乙醇并在10℃条件下静置10 h后，以7000 r/min速率离心10 min，得到沉淀物A；沉淀物充分溶解于去离子水中，再以4500r/min速率离心20 min，去除不溶物，得到上清液B；上清液B中加入其体积（mL）4倍的无水乙醇并在10℃条件下静置10 h后，回收沉淀物B，对该沉淀物B在-20~-40℃条件下进行冷冻干燥至恒重，即得絮凝剂粗提物。
实施例3 一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法，包括以下步骤：
⑴筛选出微生物絮凝剂菌株，该菌株为Candida anglica，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No：7032（保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年12月24日）。
其中：菌株及菌种的鉴定同实施例1。
⑵Candida anglica菌株一级种子液的制备：将Candida anglica斜面菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基1~2环，在28℃、摇床转速为150 r/min的条件下培养36h，即得细胞浓度为1.2×106个/mL的一级种子液。
⑶发酵培养基的制备：选用化学需氧量COD为8200~8300 mg/L的马铃薯淀粉废水作为营养基质，按100 mL马铃薯淀粉废水添加1 mL甘油作为外加碳源，5 mg(NH4)2SO4作为氮源，10mg MgCl2和10 mg KH2PO4作为矿质营养，均质后即得发酵培养基。
⑷具有絮凝活性的发酵液的制备：将一级种子液以体积比（mL）10%的接种量接种于发酵培养基中，控制发酵培养基初始pH值为5~6，在28℃、摇床转速为150 r/min的条件下发酵时间50 h，即得具有絮凝活性的发酵液。
⑸纯化提取：将具有絮凝活性的发酵液以4000r/min 速率离心30min，得到上清液A；在上清液A中加入其体积（mL）3倍的无水乙醇并在7℃条件下静置12 h后，以6000 r/min速率离心20 min，得到沉淀物A；沉淀物充分溶解于去离子水中，再以4000r/min速率离心30 min，去除不溶物，得到上清液B；上清液B中加入其体积（mL）3倍的无水乙醇并在7℃条件下静置12 h后，回收沉淀物B，对该沉淀物B在-20~-40℃条件下进行冷冻干燥至恒重，即得絮凝剂粗提物。
上述实施例1~3中的马铃薯葡萄糖液体培养基是指将200 g去皮马铃薯切成1cm3见方后加1000 mL水，加热至水沸，7~10min后经双层纱布过滤得到马铃薯汁；然后将马铃薯汁与17g葡萄糖、2g蛋白胨混合均匀即得。
Claims (2)
1.一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法，包括以下步骤：
⑴筛选出微生物絮凝剂菌株，该菌株为Candida anglica，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No：7032；
⑵Candida anglica菌株一级种子液的制备：将Candida anglica斜面菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基1~2环，在25~30℃、摇床转速为130~180 r/min的条件下培养24~48h，即得细胞浓度为1.2×106个/mL的一级种子液；
⑶发酵培养基的制备：选用化学需氧量COD为8200~8300 mg/L的马铃薯淀粉废水作为营养基质，按100 mL所述马铃薯淀粉废水添加1 mL甘油作为外加碳源，5 mg(NH4)2SO4作为氮源，10mg MgCl2和10 mg KH2PO4作为矿质营养，均质后即得发酵培养基；
⑷具有絮凝活性的发酵液的制备：将所述一级种子液以体积比8~12%的接种量接种于所述发酵培养基中，控制所述发酵培养基初始pH值为5~6，在25~30℃、摇床转速为130~180 r/min的条件下发酵时间45~55 h，即得具有絮凝活性的发酵液；
⑸纯化提取：将所述具有絮凝活性的发酵液以3500~4500r/min 速率离心20~40min，得到上清液A；在所述上清液A中加入其体积2~4倍的无水乙醇并在4~10℃条件下静置10~14 h后，以5000~7000 r/min速率离心10~30 min，得到沉淀物A；所述沉淀物充分溶解于去离子水中，再以3500~4500r/min速率离心20~40 min，去除不溶物，得到上清液B；所述上清液B中加入其体积2~4倍的无水乙醇并在4~10℃条件下静置10~14 h后，回收沉淀物B，对该沉淀物B进行冷冻干燥至恒重，即得絮凝剂粗提物。
2.如权利要求1所述的一种以马铃薯淀粉废水为原料制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于：所述步骤⑴中的菌株是指以污水处理厂二沉池的活性污泥为菌株分离材料，以马铃薯葡萄糖琼脂培养基作为分离培养基，采用常规平板分离方法获得多株纯菌株，该多株纯菌株分别以1~2环接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在温度为25~30℃、速率为130~180r/min的条件下经揺瓶液体培养48h，测定其对高岭土具有絮凝活性后即得。
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Granted publication date: 20140521 Termination date: 20160111 |