CN103033621A - 一种抗cd20单克隆抗体结合活性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种抗CD20单克隆抗体结合活性的检测方法。本发明公开了一种抗CD20单克隆抗体结合活性的检测方法,包括下列步骤:a取对数生长期高表达CD20的细胞,进行细胞计数,调整至合适活细胞密度进行铺板;b将参考品及待测样品进行系列梯度稀释后,依次加入铺好细胞的培养板中培养一段时间;c收集细胞,加入FITC标记的二抗孵育一段时间;d用流式细胞仪检测,根据检测结果得出待测样品结合活性。本发明所述检测方法满足专属性、精密度、线性和范围、准确性以及耐用性等验证方面的要求,能够有效地应用于抗CD20单克隆抗体结合活性的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种抗CD20单克隆抗体结合活性的检测方法。
背景技术
近年来,单克隆抗体及其导向治疗非霍奇金氏淋巴瘤的临床试验研究取得了重大进展,其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单克隆抗体制剂。美国Genentech和IDEC公司开发的抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗(Rituximab,商品名Rituxan)于1997年获得FDA批准上市,是第一个用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体药物。Rituxan为IgG1(kappa)嵌合性单抗,含有鼠抗人CD20单抗重链和轻链的可变区,人IgG1(Kappa)重链、轻链的恒定区及人IgG1的Fc部分,能与细胞表面CD20分子高亲和力结合,从而导致被结合的淋巴细胞的清除。由于其在非霍奇金淋巴瘤治疗中表现出较好的疗效和较低的毒副作用,已经成为美国销售额最大的抗肿瘤药物之一。
研究发现,当抗CD20单克隆抗体与抗原的亲和力提高时,抗体的特异性增强,对肿瘤细胞的杀伤效果也会显著提高。因此在抗CD20单克隆抗体的研制过程中,如何建立评价亲和力强弱的结合活性检测方法用于筛选出高亲和力的抗CD20单抗显得非常重要,这在抗CD20单克隆抗体的研究开发,质量控制乃至临床应用中都具有重要的意义。
从目前文献报道看,检测抗CD20单克隆抗体结合活性的方法主要有两种:1、酶联免疫吸附测定法(ELISA),主要将高表达CD20的细胞直接包被,经固定后,进行ELISA检测。这种方法缺点是操作过程复杂、费时、费力,而且CD20膜蛋白比较容易受到细胞固定液的破坏,导致抗原与抗体的结合力降低,不能真实反映抗原抗体的结合活性,只能简单地鉴别阴、阳性结果。2、流式细胞术检测方法:一种是竞争结合检测法,采用荧光标记的抗CD20单抗与待测样品竞争性结合细胞表面的CD20,由标记抗体的荧光强度来判断待测样品与抗原的亲和力。这种方法缺点是:①、荧光标记效率难以标准化,如果标记不完全,易导致未标记上的抗CD20单抗与待测样品一起与标记上荧光的抗CD20单抗竞争结合细胞表面抗原,不能真实反应抗原抗体结合效率;②、该方法是一种竞争结合实验,只能反映待测样品与参考品的竞争结合细胞表面CD20能力的强弱,而且该方法在稳定性,重复性,可靠性方面也缺乏系统性的研究,不能真实地对待测样品的结合活性进行评价。另一种是间接检测法,虽然也采用商品化荧光标记的FITC anti-Human IgG进行检测,但是方法尚未标准化,多用于研发阶段的单抗筛选,即鉴别阴、阳性结果,缺乏对方法进行专属性,准确性,重复性等方面的相关评价,对实验结果的评价也存在不同,难以保证检测结果的准确性与可靠性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有文献报道的方法中存在的上述不足,提供了一种能够快速、简便、准确、高效地进行抗CD20单克隆抗体药物筛选和结合活性分析的检测方法,该方法能够满足方法验证过程中对专属性,精密度包括重复性,日间差,人员操作误差,线性和范围,准确性以及耐用性等方面的要求,对于抗CD20单克隆抗体的研究开发,质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。
为实现上述目的,本发明的技术方案如下:
一种抗CD20单克隆抗体结合活性的检测方法,包括下列步骤:
a细胞培养:取对数生长期高表达CD20的细胞,用完全培养基制成细胞悬液,计数并计算细胞密度及活率,调整至0.5-2.0×106个/ml活细胞密度,加入细胞培养板中,阴性对照孔以加入完全培养基;
b参考品及待测样品稀释:取参考品及待测样品,根据标示浓度,用完全培养基先稀释至预稀释浓度,再进行系列梯度稀释,得到11个稀释度;
c加样:将稀释好的系列梯度浓度的参考品及待测样品以500μl/孔依次加入已铺好细胞的细胞培养板中,阴性对照孔加入完全培养基。完成后将细胞培养板放置于37℃,5%二氧化碳培养箱中孵育0.5-1h;
d收获细胞:收获细胞至离心管内,用1ml预冷的洗液洗涤细胞1次,2000r/min离心5分钟,弃上清液,收集细胞,将细胞重悬于100μl预冷的洗液中;
e染色:加入FITC标记的Mouse anti-Human IgG,10μl/孔,4℃避光冰浴孵育0.5-1h;
f洗涤:用1ml预冷的洗液洗涤细胞2次,2000r/min离心5分钟,弃上清液,收集细胞,将细胞重悬于1ml预冷的洗液中;
g流式细胞仪测定:将细胞转入流式管,以阴性对照细胞设置阴性门和阳性门的分界线,记录各管细胞的平均荧光强度(Mean Channel Fluorescence,MCF);以LogC-MCF进行曲线拟合,得出参考品和待测样品的EC50值,计算两者EC50值的比值得出待测样品相对参考品的结合活性。
本发明采用的对数生长期高表达CD20的细胞为人Burkitt′s淋巴瘤细胞Raji细胞。
本发明采用的完全培养基是RPMI1640完全培养基,即在RPMI1640基础培养基的基础上添加10%FBS和1%双抗(链霉素与青霉素)。
更进一步的,在实施步骤b中,所述参考品和待测样品合适的预稀释浓度是10-20μg/ml。所述参考品和待测样品为抗人CD20单克隆抗体。
更进一步的,在实施步骤b中,所述参考品和待测样品的系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。
更进一步的,在实施步骤d、f中,所述洗液是含1%FBS的PBS溶液。
本发明细胞与待测单抗若不在24孔板内培养,改成在流式管或者EP管中进行抗原抗体孵育,缺点:细胞容易沉降,堆积在管底,这样就会导致细胞表面抗原与待测抗体的结合不充分,而在24孔中,板底面积大,实验设计的细胞密度,正好铺满24孔板底面积的80%左右,而且细胞能够均匀分散,这样就有利于抗CD20单抗到达细胞表面的CD20表位,细胞表面的抗原与待测抗体可以充分结合。
该方法专属性好,特异性强;精密度高,重复性,日间差以及人员操作误差RSD均小于10%,根据线性、精密度以及准确度的验证结果,可知测定范围为80%~120%。参考品和待测样品的曲线拟合常数R2均大于0.95。因此,采用本发明的方法能够快速,准确,高效的进行抗CD20单克隆抗体结合活性分析,这对于抗CD20单克隆抗体的研究开发,质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。
附图说明
图1:流式荧光直方图叠加图,其中Plot1为阴性对照细胞,Plot 2为抗CD20单抗与Raji细胞表面的CD20产生特异性结合的阳性细胞;
图2:参考品和同型对照Human IgG1的结合活性曲线拟合图;
图3:参考品和待测样品的结合活性曲线拟合图;
图4:抗CD20单克隆抗体结合活性方法验证(线性和范围)-线性拟合图;
图5:抗CD20单克隆抗体结合活性ELISA检测法4参数拟合图;
图6:参考品结合活性曲线拟合图-不同样品稀释浓度范围。
具体实施方式
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下列实施例涉及到的材料和试剂,实验条件和方法如下:
1材料和试剂
材料:参考品:Rituxan(Biogen-IDEC公司产品,批号:B6027),待测样品(抗人CD20单克隆抗体,嘉和生物药业有限公司制备),Human IgG1:Remicade(Johnson&Johnson公司产品)。
试剂:RPMI1640培养基粉末(购于GIBCO,Cat.No.31800-022),链霉素/青霉素双抗(购于GIBCO,Cat.No.15070-063),FBS(购于GIBCO,Cat.No.10099-141),FITC Mouse anti-Human IgG(购于BD公司,Cat.No.555786)。
细胞株:Raji细胞株(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,目录号:TCHu 44)。
2抗CD20单克隆抗体结合活性检测过程:
1)细胞铺板:取对数生长期的Raji细胞,用RPMI1640完全培养基制成单细胞悬液,计数,并计算细胞密度及活率,调整活细胞密度至0.5-2.0×106个/ml,以500μl/孔加入24孔细胞培养板中,阴性对照孔以500μl/孔加入完全培养基。
2)参考品及待测样品稀释:取参考品及待测样品,根据标示浓度,用RPMI1640完全培养基预稀释至10-20μg/ml,再进行2倍系列梯度稀释,得到11个稀释度。
3)加样:将稀释好的系列梯度浓度的参考品及待测样品以500μl/孔依次加入铺好细胞的24孔细胞培养板中,阴性对照孔以500μl/孔加入完全培养基。完成后将细胞培养板放置于37℃,5%二氧化碳培养箱中孵育0.5-1h。
4)收获细胞:收获细胞至无菌的1.5ml EP管,用1ml预冷的洗液洗涤细胞1次,2000r/min离心5分钟,弃上清液,收集细胞,将细胞重悬于100μl预冷的洗液中。
5)染色:加入FITC标记的Mouse anti-Human IgG,10μl/孔,4℃避光冰浴孵育0.5-1h。
6)洗涤:用1ml预冷的洗液洗涤细胞2次,2000r/min离心5分钟,弃上清液,收集细胞,将细胞重悬于1ml预冷的洗液中。
7)流式细胞仪测定:将细胞转入流式管中,以阴性对照细胞设置阴性门和阳性门的分界线,记录各管细胞的平均荧光强度。
8)结果分析:以LogC-MCF进行曲线拟合,得出参考品和待测样品的EC50值,曲线拟合常数R2,按照下列公式计算待测样品的结合活性:
实施例1抗CD20单克隆抗体结合活性检测
以抗CD20单克隆抗体待测样品(嘉和生物药业制备)为材料,采用上述方法检测其结合活性。
结果如图1,与Raji细胞表面的CD20产生特异性结合的抗CD20单克隆抗体能够与FITC Mouse anti-Human IgG相结合,从而产生荧光,荧光强度随着所结合的抗CD20单抗浓度的增加而增强,FITC荧光强度越高,峰形逐渐往右移;而阴性对照细胞由于没有与抗CD20单克隆抗体结合,因此峰形位置不变,没有产生右移,荧光强度极低。
如图3,参考品及待测样品曲线拟合情况良好,曲线拟合常数R2>0.95,通过计算,可以得出该抗CD20单克隆抗体待测样品的结合活性为87%。
实施例2抗CD20单克隆抗体结合活性检测(专属性评价)
以不针对CD20靶点的Human IgG1:Remicade(Johnson&Johnson公司产品)为待测样品,采用上述方法检测其结合活性。
结果如图2,不针对CD20靶点的单克隆抗体即使在与参考品相同稀释浓度条件下,与高表达CD20的细胞仍然没有结合,平均荧光强度与阴性对照几乎相等。由此可见,本发明检测方法能够特异性地进行针对CD20靶点的单克隆抗体结合活性检测。
实施例3抗CD20单克隆抗体结合活性检测(精密度评价)
以抗CD20单克隆抗体药物待测样品(嘉和生物药业制备)为材料,对方法的精密度进行评价。首先由1名实验人员采用下述方法对同一待测样品平行实验5次,考察方法的重复性;然后由2名实验人员采用下述方法对同一待测样品进行结合活性检测,考察方法的人员误差;最后由1名实验人员在3个不同的工作日内采用下述方法对同一待测样品进行结合活性检测,考察方法的日间差。
结果如表1,由1名实验人员对同一待测样品,重复实验5次,检测结果的RSD<10%,参考品和待测样品的曲线拟合参数R2>0.95(曲线拟合图略),说明本发明方法的重复性能够达到精密度要求。
如表2,由2名实验人员对同一待测样品平行各检测1次,检测结果的RSD<10%,参考品和待测样品的曲线拟合参数R2>0.95(曲线拟合图略),说明本发明方法的人员操作误差能够达到精密度要求。
如表3,由1名实验人员在3个不同的工作日内,对同一待测样品每天检测1次,检测结果的RSD<10%,参考品和待测样品的曲线拟合参数R2>0.95(曲线拟合图略),说明本发明方法的日间差能够达到精密度要求。
表1.抗CD20单克隆抗体结合活性检测重复性评价结果汇总表
表2.抗CD20单克隆抗体结合活性检测人员操作误差评价结果汇总表
表3.抗CD20单克隆抗体结合活性检测日间差评价结果汇总表
实施例4抗CD20单克隆抗体结合活性检测(准确度评价)
以抗CD20单克隆抗体参考品Rituxan(Biogen-IDEC公司产品)为材料,用RPMI1640完全培养基将其稀释成效价水平分别为80%,100%,120%作为待测样品,对这3个待测样品按照下列实验方法由3名分析人员各检测1次,统计实验结果。
结果如表4,对效价水平分别为80%,100%,120%的3个待测样品,每个待测样品分别由3名分析人员各检测1次,参考品和待测样品的曲线拟合参数R2>0.95(曲线拟合图略),每个待测样品的3次检测结果的RSD<10%,效价水平的理论值和真实值的标准偏差SD<10%,说明本发明方法能够满足准确度要求。
表4.抗CD20单克隆抗体结合活性检测准确度评价结果汇总表
实施例5抗CD20单克隆抗体结合活性检测(线性和范围评价)
以抗CD20单克隆抗体参考品Rituxan(Biogen-IDEC公司产品)为材料,用RPMI1640完全培养基将其稀释成结合活性分别为50%,75%,100%,125%,150%作为待测样品,对这5个待测样品采用上述方法进行检测。
结果如图4,结合活性效价水平的理论值和真实值进行线性回归,线性拟合参数R2>0.95,说明在效价水平为50%-150%范围内,本发明方法线性良好。
根据精密度、准确度和线性验证结果,本发明方法的检测范围应为80%-120%。
实施例6抗CD20单克隆抗体结合活性检测检测(耐用性评价)
以抗CD20单克隆抗体药物待测样品(嘉和生物药业制备)为材料,按照上述方法进行检测。将处理好的样本,避光放置于4℃,分别于0h、2h、4h、6h和16h对样本进行流式细胞仪检测,以考察本发明方法的耐用性。
如表5,当样品经过荧光染色后,避光放置于4℃,分别于0h、2h、4h、6h和16h应用流式细胞仪进行检测,参考品和待测样品的曲线拟合参数R2>0.95(曲线拟合图略),RSD满足<10%,实验数据表明在4℃避光条件下,与Raji细胞进行特异性结合的待测样品与参考品,经过荧光染色后,在16h内这种特异性结合是稳定的,这说明本方法能够达到耐用性对样品结合稳定性的要求。
表5.抗CD20单克隆抗体结合活性检测耐用性(稳定性)评价结果汇总表
对比实施例1抗CD20单克隆抗体结合活性检测(ELISA法)
以抗CD20单克隆抗体待测样品(嘉和生物药业制备)为材料,采用下述方法检测其结合活性。
多聚赖氨酸溶液预处理细胞培养板:取多聚赖氨酸溶液稀释浓度至5-15μg/ml,以500μl/孔加入96孔细胞培养板,37℃避光孵育1-3h。
洗板:无菌PBS洗板2次,200μl/孔,最后再用1640基础培养基洗板1次。
细胞铺板:取对数生长期的Raji细胞,用RPMI1640完全培养基制成单细胞悬液,计数,并计算细胞密度及活率,调整活细胞密度至1.0-3.0×105个/ml,以100μl/孔加入96孔细胞培养板中,空白对照孔加入500μl/孔的1640完全培养基,完成后,置于离心机中以2000r/min离心5min。
细胞固定:加入新鲜配制的0.25%戊二醛-PBS溶液,100μl/孔,4℃避光固定10-15min。
封闭:用0.05%Tween20-PBS(PBST)以200μl/孔洗板3次后,加入5%脱脂奶粉-PBS溶液200μl/孔,置于37℃封闭1-2h。
参考品及待测样品稀释:取参考品及待测样品,根据标示浓度,用2%脱脂奶粉-PBS溶液稀释至1-3mg/ml,再进行3倍系列梯度稀释,共得到11个稀释度。
加样:用PBST以200μl/孔洗板3次后,将稀释好的系列梯度浓度的参考品及待测样品以100μl/孔依次加入96孔细胞培养板中,空白对照孔加入100μl/孔的5%脱脂奶粉-PBS溶液,完成后将细胞培养板放置于37℃培养箱中孵育0.5-1.5h。
加入HRP标记的二抗:用PBST以200μl/孔洗板3次后,加入1∶10000稀释的羊抗人IgGFab-HRP,100μl/孔,置于37℃培养箱中孵育0.5-1.5h。
显色:加入TMB底物溶液,100μl/孔,37℃培养箱中显色10-15min。
终止反应:用1N H2SO4以100μl/孔加入各孔终止反应。
读数:在450nm/620nm条件下进行读板,记录OD(450-620)。
结果分析:扣除空白对照孔的OD值后,分别用参考品孔和待测样品孔OD值与样品稀释浓度进行4参数拟合,确定参考品和待测样品的EC50值,曲线拟合参数R2,按照下列公式计算待测样品的结合活性:
如图5,参考品及待测样品曲线拟合情况良好,曲线拟合常数R2>0.95,通过计算可以得出该抗CD20单克隆抗体待测样品的结合活性为174%,该检测结果远远高于流式检测结果,出现这种明显偏差的主要原因是:ELISA检测方法费时、费力,细胞必须经过固定后才能进行检测,而CD20膜蛋白比较脆弱,容易受到固定液的破坏,导致抗原抗体结合能力降低。因此,同样是抗原抗体的结合反应,ELISA方法需要多达0.1-0.3mg的样品才能使抗原抗体的结合趋于饱和状态。而流式检测法,其在操作过程中无需经过细胞固定,收获细胞染色后即可以进行检测,CD20膜蛋白不会受到固定液的破坏,抗原抗体的结合反应达到饱和状态需要的样品量仅为1-2μg,该方法操作简单,省时、省力,重复性好,准确性高、灵敏度强,检测结果可靠,因此,应用流式细胞术检测法能够快速、简便、准确、高效地应用于抗CD20单克隆抗体药物筛选和结合活性检测。
对比实施例2抗CD20单克隆抗体结合活性检测(不同样品预稀释浓度范围)
以抗CD20单克隆抗体参考品Rituxan(Biogen-IDEC公司产品)为材料,降低样品预稀释浓度对曲线拟合的影响,采用上述方法检测其结合活性。
结果如图1,当参考品预稀释浓度范围为0.5-1μg/ml,曲线上平台没有达到,这说明抗CD20单克隆抗体与CD20抗原的结合没有达到饱和状态,因此曲线拟合是不准确的,得到参考品的EC50值也是不准确的;而图3中的参考品曲线拟合是比较好的,抗原抗体结合达到饱和,得到结果比较准确、可靠,因此,选择合适的样品预稀释浓度范围对该方法的结果判断比较重要。
综上所述,本发明建立了一种应用流式细胞术检测抗CD20单克隆抗体结合活性的方法,该方法能够满足方法验证过程中对专属性,精密度,线性和范围,准确度以及耐用性等方面的要求,是一种快速、准确、精密、稳定的针对CD20靶点的单克隆抗体结合活性的半定量检测方法,能够简便、高效地进行药物筛选和活性检测,对于抗CD20单克隆抗体的研究开发,质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制,所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子,本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上,除了本文所述的内容外,本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
Claims (9)
1.一种抗CD20单克隆抗体结合活性的检测方法,包括下列步骤:
a细胞培养:取对数生长期高表达CD20的细胞,用完全培养基制成细胞悬液,计数并计算细胞密度及活率,调整至0.5-2.0×106个/ml活细胞密度,加入细胞培养板中,阴性对照孔以加入完全培养基;
b参考品及待测样品稀释:取参考品及待测样品,根据标示浓度,用完全培养基先稀释至预稀释浓度,再进行系列梯度稀释,得到11个稀释度;
c加样:将稀释好的系列梯度浓度的参考品及待测样品以500μl/孔依次加入已铺好细胞的细胞培养板中,阴性对照孔加入完全培养基;完成后将细胞培养板放置于37℃,5%二氧化碳培养箱中孵育0.5-1h;
d收获细胞:收获细胞至离心管内,用1ml预冷的洗液洗涤细胞1次,2000r/min离心5分钟,弃上清液,收集细胞,将细胞重悬于100μl预冷的洗液中;
e染色:加入FITC标记的Mouse anti-Human IgG,10μl/孔,4℃避光冰浴孵育0.5-1h;
f洗涤:用1ml预冷的洗液洗涤细胞2次,2000r/min离心5分钟,弃上清液,收集细胞,将细胞重悬于1ml预冷的洗液中;
g流式细胞仪测定:将细胞转入流式管,以阴性对照细胞设置阴性门和阳性门的分界线,记录各管细胞的平均荧光强度,以LogC-MCF进行曲线拟合,得出参考品和待测样品的EC50值,计算两者EC50值的比值得出待测样品相对参考品的结合活性。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述针对对数生长期高表达CD20的细胞是人Burkitt′s淋巴瘤细胞:Raji。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述完全培养基是含10%FBS和1%链霉素与青霉素的RPMI1640完全培养基。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于在步骤b中,所述参考品和待测样品为抗人CD20单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于在步骤b中,所述预稀释浓度是10-20μg/ml。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于在步骤b中,所述系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。
7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于所述洗液为PBS溶液或生理盐水。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于所述洗液是含1%-2%FBS的PBS溶液。
9.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于所述细胞培养板为24孔细胞培养板。
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