CN103031301B - 白菜热诱导miRNA及其鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及白菜热诱导miRNA及其鉴定。本发明鉴定了新颖的白菜热响应miRNA，miR-9.3(miR-1885.3)(如SEQ ID NO：1所示)，其响应热应力而下调，而它的两个靶标(QQT1和FRA-8)响应热应力而上调。本发明进一步证实，拟南芥中miR-9.3的下调和靶标QQT1的过表达提高的耐热性。因而本发明包括这类新的核酸分子、含有这些分子的载体、宿主细胞，以及这些分子、载体在转化植物细胞以提供耐热植物中的应用。本发明也涉及利用上述序列制备耐热性提高的植物和/或其部分的方法。

Description

白菜热诱导miRNA及其鉴定

技术领域

本发明属于农业领域，具体涉及白菜保守和新miRNA家族中热诱导miRNA及其鉴定。

背景技术

白菜是一类品种繁多的蔬菜作物，比较基因组学的工作揭示白菜和拟南芥有着非常保守的线性排列和染色体片段的共线性关系，推测它们是在大约13到17百万年前从一个共同的祖先那里进化而来(Mun et al.，2009)。因为白菜在进化中发生了相当于拟南芥全基因组范围内三倍化的事件，所以白菜基因组含有三倍化的拟南芥基因组的相应片段的同源对应物。在许多区域白菜类的蔬菜作物经常受到高温的胁迫。全球范围内，相当一部分农作物的损失是由于高温和其伴随的其他逆境胁迫造成(Mittler，2006)。虽然抗热分子育种已经成为可能，但作物的基因改良因为缺乏抗热基因资源而受到限制。

植物内源的小片段非编码RNA参与到了植物对非生物胁迫的响应中。小RNA主要分为四大类：微小RNA(microRNAs)，反式作用干扰小RNA(ta-siRNAs)，天然反义转录小RNA(nat-siRNAs)和重复序列相关小RNA(ra-siRNAs)(Jamalkandi et al.，2009)。植物典型的miRNA大约21nt，由DCL1/HYL1复合体从形成茎环结构的前体中加工而成(Kurihara et al.，2006)，进入到RISC复合体中剪切靶基因，发挥植物发育和逆境响应方面的调控(Shukla et al.，2008；Chen X，2009)。最近几年的工作揭示了植物和动物中miRNA更复杂的加工机制。大部分已知miRNA是从基因间区域转录而来的，但也有小部分来自基因内含子区域(Babiarz et al.，2008；Zhu et al.，2008)、或者外显子区域(Li et al.，2010)、转座子(Devor E et al.，2009；Piriyapongsa et al，2008)甚至tRNA区域(Keita.，2010)。同时最近也报导了miRNA加工途径和其他小RNA加工途径之间的交叉互作。例如，长度22nt的miRNA而非21nt的经典miRNA激活了次级干扰小RNA的产生(Axtell et al.，2006；Cuperus et al.，2010；Chen et al.，2010)；miRNA的前体茎环结构也能进入DCL3/RDR2加工途径产生24nt的小RNA(Vazquez et al.，2008；Chellappan et al.，2010)。miRNA通常被认为发挥的是剪切靶基因和翻译抵制的作用(Brodersen et al.，2008)，但最近发现来自miRNA前体的24nt小RNA也参与到了在转录前水平对靶基因的甲基化作用(Wu et al.，2010，Chellappan et al.，2010)。另一方面，在拟南芥和水稻中通过高通量的降解组测序验证了许多受miRNA剪切的靶基因(German et al.，2008；Addo-Quaye et al.，2008；Li et al.，2010；)。miRNA及其靶基因在时期转换(Wanget al.，2009；Wu et al.，2009)、激素信号传递(Mallory et al.，2005；Reyes et al.，2007)和极性分化方面(Zhou et al.，2007；Sieber et al.，2007；Liu et al.，2010；Liuet al.，2011)扮演着重要角色，同时在抵御逆境比如干旱(Li et al.，2008，Martin etal.，2010)、过氧化(Sunkar et al.，2006)和缺磷胁迫(Fujii et al.，2005)方面发挥作用。其中miR398在过氧化胁迫下显著下调。拟南芥中miR398靶向两个高度同源的铜锌超氧化物歧化酶CSD1和CSD2，调控了植物对过氧化胁迫的耐受性(Sunkar et al.，2006)。但是，在全基因组水平上哪些白菜miRNA响应热胁迫还没有被报导。总的来说，在白菜保守和特异miRNA家族中鉴定热诱导miRNA可进一步提高我们对植物抗热机制的了解。

热激胁迫干扰细胞稳态，并使叶片黄化，延迟植物的生长和发育甚至致死。在热激转录因子(HSFs)调控下热激蛋白(HSPs)的积累被认为在对热激响应(HSR)过程中扮演着中心角色(Kotak et al.，2007)。有些蛋白如DREB2A(Sakumaet al.，2006)，MBF1C(Suzuki et al.，2005)，CTL1(Kwon et al.，2007)的累积被认为可以提高对植物抗热的能力，一些信号分子如乙烯、脱落酸(Larkindale et al.，2005)、过氧化氢和IP3(Liu et al.，2006)等也与植物高温耐受通路有交叉互作。但这些蛋白是否受小RNA的调控或者是否调控了相关的miRNA靶基因是未知的。

随着小RNA深度测序技术的进步，许多作物的miRNA被发现(Zhu et al.，2008；Lelandais-Briere et al.，2009；Pantaleo et al.，2010)。白菜是与模式生物拟南芥最为同源的作物之一(Snowdon et al.，2007)。白菜类的作物对高温非常敏感，产量和质量因此严重受损，尤其是在夏季和高温地区。最近白菜全基因组的测序和注释有了非常大的进展，使得在全基因组水平调查miRNA成为可能。鉴定热诱导miRNA提供了揭示植物响应热激胁迫机制的一种渠道。

发明内容

本发明提供分离的核酸分子，所述核酸分子含有：

(a)SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

(b)与(a)互补的核苷酸序列；

(c)与(a)或(b)具有至少80％序列相同性的核苷酸序列；和/或

(d)在严格条件下与(a)、(b)和/或(c)杂交的核苷酸序列。

在一优选实施例中，前述(c)中所述序列的相同性为至少85％，优选至少90％，更优选至少95％。

在一优选实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、2和22-40中任一所示。

本发明提供一种嵌合基因，其含有在植物细胞中有活性的操作性连接于本发明所述核酸分子的启动子，所述启动子任选地进一步操作性连接于3’非翻译核酸分子。

本发明提供一种载体，其含有本发明所述的核酸分子或嵌合基因。

本发明提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的嵌合基因或载体。

在一具体实施例中，所述宿主细胞是植物细胞。

本发明提供含有本发明所述的植物细胞的植物或其部分。

本发明提供产生自本发明所述的植物的种子。

本发明提供本发明所述的载体在转化植物细胞以提供耐热植物中的应用。

本发明提供一种制备耐热性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括降低所述植物中具有SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列或与SEQID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列具有至少80％序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步骤。

在一优选实施例中，所述降低所述植物中具有SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列具有至少80％序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步骤包括选自下组的一个或多个步骤：

将一核苷酸序列导入所述植物，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的互补序列，或是与SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的互补序列具有至少80％相同性的核酸序列；

下调编码SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ IDNO：2所示核苷酸序列具有至少80％相同性的核苷酸序列的基因的表达；

使编码SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1和22-40任一所示的核苷酸序列或SEQ IDNO：2所示核苷酸序列具有至少80％相同性的核苷酸序列的基因突变，以降低或消除SEQ ID NO：1和22-40中任一序列与其mRNA靶标的结合，和/或降低或消除SEQ ID NO：1和22-40中任一序列结合上后该mRNA靶标的切割；和

使所述植物与能抑制SEQ ID NO：1和22-40中任一核苷酸序列、SEQ IDNO：2所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：1和22-40中任一核苷酸序列或SEQ IDNO：2所示核苷酸序列具有至少80％相同性的核苷酸序列的化合物接触。

本发明提供一种制备耐热性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括提高所述植物中具有SEQ ID NO：3或55所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或55的核苷酸序列具有至少70％序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的蛋白序列或与SEQID NO：5所示氨基酸序列具有至少70％相同性的蛋白序列的水平的步骤。

在一具体实施例中，所述提高所述植物中具有SEQ ID NO：3或55所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或55的核苷酸序列具有至少70％序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO：5或56所示氨基酸序列的蛋白序列或与SEQ ID NO：5或56所示氨基酸序列具有至少70％相同性的蛋白序列的水平的步骤包括选自下组的一个或多个步骤：

在所述植物中过表达一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO：3或55所示核苷酸序列，或与SEQ ID NO：3或55所示核苷酸序列具有至少70％相同性的核苷酸序列，或编码具有SEQ ID NO：5或56所示氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列，或编码具有与SEQ ID NO：5或56所示氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列；和

使SEQ ID NO：3或55所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：3或55具有至少70％相同性的核苷酸序列突变，以降低或消除SEQ ID NO：1与由SEQ ID NO：3或55或所述与SEQ ID NO：3或55具有至少70％相同性的核苷酸序列形成的mRNA的结合，和/或降低或消除SEQ ID NO：1与由SEQ ID NO：3或55或所述与SEQ ID NO：3或55具有至少70％相同性的核苷酸序列形成的mRNA结合后该mRNA的切割。

本发明提供一种制备耐热性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法提高所述植物中具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少70％序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的蛋白序列或与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列具有至少70％相同性的蛋白序列的水平的步骤。

在一具体实施例中，所述提高所述植物中具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少70％序列相同性的核苷酸序列的核酸序列的水平的步骤包括选自下组的一个或多个步骤：

在所述植物中过表达一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列具有至少70％相同性的核苷酸序列，或编码具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列，或编码具有与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的蛋白序列的核苷酸序列；和

使SEQ ID NO：4所示核苷酸序列或与SEQ ID NO：4具有至少70％相同性的核苷酸序列突变，以降低或消除SEQ ID NO：1与由SEQ ID NO：4或所述与SEQ ID NO：4具有至少70％相同性的核苷酸序列形成的mRNA的结合，和/或降低或消除SEQ ID NO：1与由SEQ ID NO：4或所述与SEQ ID NO：4具有至少70％相同性的核苷酸序列形成的mRNA结合后该mRNA的切割。

本发明提供本发明所述的核酸分子在调节植物耐热性中的应用。

本发明还提供本发明所述的核酸分子在提供耐热性植物的遗传分析或标记物辅助的选择方法中的应用。

本发明还提供本发明所述的核酸分子在提供耐热性植物的植物育种方法中的应用。

附图说明

图1显示常温或热处理的白菜四个数据库中小RNA的长度分布。NT1和HT1是实验1中分别进行了NT和HT处理后测序得到的小RNA数据库；NT2和HT2是实验2中分别进行了NT和HT处理后测序得到的小RNA数据库。(A)NT和HT小RNA数据库小RNA总数的长度分布；(B)NT和HT小RNA数据库小RNA各类的长度分布。

图2显示热激胁迫下bra-miR398a的累积和其靶基因BracCSD1的表达变化。(A)bra-miR398和BracCSD1靶位点的比对；(B)Northern杂交检测白菜两个NT和HT生物学重复中的bra-miR398a；(C)实时PCR检测BracCSD1的表达变化。

图3显示来自miRNA前体中热响应小RNA。成熟序列用带有正向箭头的下划线标出，miRNA*用带有反向箭头的下划线标出。阿拉伯数字依次代表均一化后小RNA在NT1，HT1，NT2，HT2数据库中的读数。(A)bra-miR156h-2前体上产生的小RNA的匹配位点和丰度；(B)bra-miR167a-2前体上产生的小RNA的匹配位点和丰度；(C)bra-miR400前体上产生的小RNA的匹配位点和丰度。

图4显示热处理条件下bra-miR9.3b和其靶基因的表达变化。(A)从miR9b前体中产生的三对miRNA/miRNA*；(B)从miR9b前体中产生的三对miRNA/miRNA在四个数据库中的丰度；(C)bra-miR9.3b和其潜在靶基因互补位点的比对；(D)Norhtern杂交检测热激条件下的bra-miR9.3b；(E)RT-PCR检测热激条件下bra-miR9.3b潜在靶基因的表达情况。

图5显示bra-miR10和其靶基因的进化关系及热响应情况。(A)bra-miR10前体和BracPAP10的序列比对。bra-miR10成熟序列的反义链及方法用带有反向箭头的下划线标出，BracPAP10互补位点用正向箭头的下划线标出；(B)从miR10前体中产生的热响应小RNA；阿拉伯数字依次代表均一化后小RNA在NT1，HT1，NT2，HT2数据库中的读数；(C)RT-PCR检测BracPAP10在热处理条件下的表达变化；(D)5’-RACE PCR显示BracPAP10断点落在bra-miR10与BracPAP10互补的位点。

图6显示两个新miRNA和实证靶基因的进化关系。(A)bra-miR4前体和BracDRL1的序列比对；bra-miR10成熟序列及方法用带有正向箭头的下划线标出，BracPAP10互补位点反义序列用反向箭头的下划线标出；(B)5’-RACEPCR显示BraVEL1断点落在bra-miR4-5p和BracVEL1的互补位点，BracDRL1断点落在bra-miR4-3p和BracDRL1的互补位点；(C)bra-miR9b前体和BracTAO1的序列比对，bra-miR9b成熟序列及方法用带有正向箭头的下划线标出，BracTAO1互补位点反义序列用反向箭头的下划线标出；(D)5’-RACE PCR显示BraTAO1断点落在bra-miR9.1和BracTAO1的互补位点。

图7显示p35S:amiR1885b.3载体的构建。

图8显示了另一种p35S:amiR1885b.3+p35S:BracQQT1载体的构建。

图9显示了p35S:BracQQT1载体的构建。

图10显示了p35S:amiR1885b.3载体的构建。

具体实施方式

本文中，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”可包括任何嘧啶碱基和嘌呤碱基的聚合物或寡聚物，优选是胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤(见Albert L.Lehninger，Principles of Biochemistry，at 793-800(Worth Pub.1982)，本文将其全文以引用的方式纳入本文)。本发明包括脱氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸组分，以及它们的任何化学变体，如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。所述聚合物或寡聚物在组成上可以是同源或异源的，且可从天然来源分离得到，或可人工合成产生。此外，核酸可以是DNA或RNA，或其混合物，可以单链或双链形式(包括同源双链、异源双链或杂合状态)永久或暂时存在。

术语“基因”指含有一区域(转录区)的DNA序列，该区域操作性连接于适当的调节区域(如启动子)，在细胞中被转录成RNA分子(如mRNA)。基因的转录区可以是编码氨基酸序列或功能RNA如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA和反义RNA的核苷酸序列。因此，基因可含有几个操作性连接的序列，如启动子、含例如参与启动翻译的序列的5’前导序列、转录区、内含子、和含如转录终止位点的3’非翻译序列。

“嵌合基因”(或重组基因)指在物种中天然不存在的任何基因，尤其指其核酸序列的一个或多个部分在自然界中以互不相关的形式存在的基因。例如，启动子在自然界中与部分或所有转录区域或其它调节区域不关联。术语“嵌合基因”应理解为包括表达构建物，其中启动子或转录调节序列操作性连接于一个或多个编码序列或反义序列(有义链的反向互补链)或反向重复序列(有义和反义，从而转录后RNA转录物形成双链RNA)。

“3’UTR”或“3’非翻译序列”(也常称为3’非翻译区或3’端)指基因的编码序列下游的核酸序列，其包含例如转录终止位点和(大多数情况下，但不是全部的真核mRNA)聚腺苷酸化信号(如AAUAAA或其变体)。转录终止后，mRNA转录物在聚腺苷酸化信号下游被切割，并加入poly(A)尾，该poly(A)尾参与该mRNA向胞质的转运(在那发生翻译)。

“基因表达”指操作性连接于适当的调节区域(尤其是启动子)的DNA区域被转录成RNA的过程，该RNA是有生物学活性的，即该RNA能被翻译成生物学活性蛋白或肽(或活性肽片段)，或该RNA自身具有活性(如在转录后基因沉默或RNAi中)。

某些实施方式中的活性蛋白指组成型活性的蛋白。编码序列优选是有义取向，并编码所需的生物学活性蛋白或肽，或活性肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列优选以反义DNA或反向重复DNA的方式存在，含有反义取向或有义和反义取向的短序列的靶基因。“异位表达”指在通常不表达的组织中表达。

“转录调节序列”在本文中定义为能调节操作性连接于转录调节序列的(编码)序列的转录速率(rate of transcription)的核酸序列。本文所定义的转录调节序列包含启动转录(启动子元件)、维持和调节转录所需的所有序列元件，包括弱化子和增强子。虽然大多数情况下指编码序列的上游(5’)转录调节序列，但此定义也包括编码序列下游(3’)所发现的调节序列。

本文中，“启动子”指起到控制一种或多种基因的转录的核酸片段，根据转录方向，启动子位于所述基因转录起始位点的上游，结构上由DNA依赖性RNA聚合物的结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点、阻遏子和激活子蛋白结合位点，以及本领域周知的直接或间接调节由该启动子引起的转录量的核苷酸序列)所鉴定。

“组成型”启动子是在大多数组织中在生理学和发育条件下有活性的启动子。组成型启动子例如包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区，衍生自根癌农杆菌的T-DNA的1′-或2′-启动子，遍在蛋白1启动子，Smas启动子，肉桂基醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)，Nos启动子，pEmu启动子，rubisco启动子，GRP1-8启动子及本领域技术人员已知的各种植物基因的其它转录起始区。如果希望低水平表达，则可以使用弱启动子。弱组成型启动子包括例如，Rsyn7启动子的核心启动子(WO99/43838及美国专利No.6,072,050)，核心35S CaMV启动子等。

“诱导型”启动子是可从生理学(如通过外部施与某些化合物)或发育上进行调节的启动子。诱导型启动子的例子是Hsp70启动子，其是可由热刺激诱导的启动子。也可以使用可由化学物质、雌激素或植物生长素诱导的启动子等等。

“组织特异性”启动子是仅在特定类型的组织或细胞中有活性的启动子。“启动子在植物或植物细胞中有活性”是指启动子在植物或植物细胞中驱动转录的一般能力，它并不暗含关于启动子时空活性的内容。

本文中，“操作性连接”指处于功能关系的多核苷酸连接。当核酸与其它序列以功能关系连接时，该核酸与其它核酸序列“操作性连接”。例如，如果启动子，或甚至是转录调节序列能影响到编码序列的转录，那么它们与该编码序列操作性连接。操作性连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的。

本文中，“核酸构建物”或“载体”指采用重组DNA技术产生的人造的核酸分子，用于递送外源DNA到宿主细胞中。载体骨架可以是，例如双运载体或超双运载体(superbinary vector)(见US5591616、US2002138879和WO95/06722)、共整合载体或T-DNA载体，如本领域已知的且在本文其它部分也有描述，在该骨架中可整合入嵌合基因，或者，如果其已存在合适的转录调节序列，仅需在该转录调节序列下游整合入所需的核酸序列(如编码序列、反义或反向重复序列)。载体通常还含有有利于他们在分子克隆中应用的遗传元件，如可选择标记物、多克隆位点等(见下文)。

本文中，“宿主细胞”可指天然存在的细胞或含有载体并支持该载体复制的转化细胞。宿主细胞可以是培养的细胞、外植体、体内细胞等。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，如植物细胞。

“严格杂交条件”可用于鉴别与给定核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中将不同。通常，严格条件选为在规定离子强度和pH下比特定序列的解链温度(Tm)低约5℃。Tm是在规定离子强度和pH下50％的靶序列杂交到最佳匹配探针的温度。通常，严格条件将选择为，盐浓度约0.02摩尔，pH为7，和温度至少为60℃。降低盐浓度和/或升高温度会增加严格性。RNA-DNA杂交(使用如100nt探针进行的Northern印迹)的严格条件是，例如包括至少一次在63℃、0.2X SSC中进行20分钟的洗涤的条件或其同等条件。DNA-DNA杂交(使用如100nt探针进行的Southern印迹)的严格条件是，例如包括至少一次(通常2次)在至少50℃(通常约55℃)、0.2X SSC中进行20分钟的洗涤的条件或其同等条件。可参见Sambrook等，(1989)，和Sambrook和Russell(2001)。

“序列相同性”和“序列相似性”可通过使用全球或本地比对算法比对两条肽或两条核苷酸序列而确定。然后，当它们具有至少某个最低百分比的序列相同性(如下文所述)时(最佳采用例如GAP或BESTFIT程序进行比对，使用它们的默认参数)，可将序列称为“基本上相同”或“基本上相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全球比对算法比对两条序列的全长序列，使匹配的数量最大化，并将空隙数量最小化。通常使用GAP默认参数，空隙产生罚分(gap creation penalty)＝50(核苷酸)/8(蛋白)，空隙延伸罚分(gap extentionpenalty)＝3(核苷酸)/2(蛋白)。对于核苷酸，使用的默认的计分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白，使用的默认的计分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。可使用计算机程序进行序列比对和序列相同性百分比计分，例如使用Accelrys Inc.(9685Scranton Road，San Diego，CA92121-3752USA)的GCG Wisconsin Package，第10.3版，或EmbossWin version 2.10.0(使用“needle”程序)。或者，可使用算法如FASTA和BLAST等检索数据库，测定相似性百分比或相同性百分比。优选地，序列相同性指整条序列长度上的序列相同性。

“宿主细胞”或“重组细胞”或“转化的细胞”指至少一种核酸分子，尤其是含有编码所需蛋白的嵌合基因或转录后产生反义RNA或反向重复RNA(或发夹RNA)以用于使靶基因/基因家族沉默的核酸序列的核酸分子，被导入细胞后所产生的新的独立细胞(或有机体)。宿主细胞优选是植物细胞或细菌细胞。宿主细胞可含有作为染色体外(游离基因)复制分子的核酸构建物，或更佳地，含有整合到该宿主细胞的核内或质体基因组中的嵌合基因。本文中，术语“宿主”还指病原体能侵入或感染的宿主植物物种，但根据上下文，该定义是清楚的。植物物种依病原体而分为“宿主”或“非宿主”物种。“非宿主”物种是即使在最适疾病发生的条件下也对所有种类的病原体感染都完全免疫的物种。“宿主”物种也称为病原体的“宿主范围”，对优选种类(但不是全部)的病原体免疫。

术语“可选择标记物”与本领域常规的术语含义类似，在本文中指任意遗传物质，当该物质表达时，可用于选择含有该可选择标记物的细胞。可选择标记物基因产物赋予例如抗生素抗性，或更优选的，除草剂抗性或其它可选择性状，例如表型性状(如着色上的变化)或营养需求。术语“报告子”主要指可视标记物，例如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、荧光素酶、GUS等。

术语“同源”或“异源”指核酸或氨基酸序列与它们的宿主细胞或有机体(尤其是在转基因有机体中)之间的关系。同源序列指在宿主物种中天然存在的序列(如用番茄基因转化番茄)，而异源序列指在宿主细胞中天然不存在的序列(如用来自马铃薯的序列转化番茄)。根据上下文，术语“同源物”或“同源的”可互换使用，指都是来自共同祖先序列的后代的序列。

本文中，术语“等位基因”指基因在特定位点上的一种或多种可替换形式。在生物体的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上特定的位置或位点上。一个等位基因存在于一对同源染色体的各个染色体上。

术语“蛋白质”或“多肽”在本文中可互换使用，指由氨基酸链构成的分子，与特定的作用模式、大小、三维结构或来源无关。因此，蛋白质的“片段”或“部分”仍然可称为“蛋白质”。“分离的蛋白质”指不再存在于其天然环境中的蛋白质，例如是体外的，或不在重组细菌或植物宿主细胞中。

本文中，“植物(作物)”包括各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜等，十字花科鼠耳芥属的拟南芥等，禾本科的水稻，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科芸薹属或鼠耳芥属的植物。“植物”包括植物细胞，植物组织或器官，植物原生质体，可再生植物的植物细胞组织培养物，植物愈伤组织，植物细胞块，和植物中完整的植物细胞，或植物的部分，如胚芽、花粉、胚珠、果实(如收获的番茄)、花、叶、种子、根、根尖等。

术语“增加的水平”和“降低的水平”在本文中指明显增加的水平或明显降低的水平。通常，当测试样品中的水平是对照样品或参比样品中的相应水平的至少5％，例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％以上或更低，该水平增加或降低。

本申请中，术语“含有”为开放式的限定方式，指包括其后所限定的内容，但并没有排除没有明确列出的内容。此外，“由……组成”与“基本上由……组成”是可互换的，指除具体指明的成分外，本发明的组合物可含有额外的成分，所述额外的成分不改变本发明的独特特征。

此外，“一种”、“一个”等不排除包括多于一个的可能性，除非文中以清楚表明仅有一个或一种。因此，“一种”、“一个”通常指“至少一种”、“至少一个”。

如本文所用，“丰度”就是一种序列的小RNA存在的总数量(如序列的条数)，也即相同序列的小RNA的总数量。丰度的测定可通过小RNA高通量测序(Illumina GAII)的方法测定，或通过本领域已知的其它方法进行。

小RNA的表达量可通过领域技术人员熟知的技术来获得，常规的例如通过Northern印迹技术，例如可设计特异性针对该小RNA的探针(携带可检测信号，如荧光)来测定。

本发明已鉴定了新颖的白菜(Brassica rapa)热响应miRNA，miR-9.3(如SEQ ID NO：1所示)，其响应热应力而下调，而它的两个靶标(QQT1和FRA-8)响应热应力而上调。本发明进一步证实，拟南芥(Arabidopsis thaliana)中miR-9.3的下调和靶标QQT1的过表达提高的耐热性。

本发明的核酸分子

本发明提供一种分离的、重组或合成核酸分子，含有(a)SEQ ID NO：1所示的核酸序列或SEQ ID NO：2所示的前体序列；(b)与(a)互补的核苷酸序列；(c)与(a)或(b)具有至少80％序列相同性的核苷酸序列；和/或(d)在严格条件下与(a)、(b)和/或(c)杂交的核苷酸序列。

SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列是miR-9.3(本文中也用miR-1885.3表示)的成熟序列，长20个核苷酸。已显示在热应力中miR-9.3下调，而它的两个靶标上调。miR-9.3与目前已鉴别的miRNA家族都不同源。miR-9.3可被它的互补核苷酸序列下调。本发明者已进一步证实，在拟南芥中miR-9.3的下调和其靶标之一QQT1的过表达增加了该植物的耐热性。

本发明还包括：具有与SEQ ID NO：1的核苷酸序列互补的序列的核酸分子，如反义RNA或其它抑制性RNA，如RNAi中使用的核酸分子；或在严格条件下与SEQ ID NO：1的一部分杂交的核酸分子。这些互补的或杂交的序列可以是任意长度的序列，本领域技术人员将理解序列的适当长度应与其使用目的相符。优选地，这些互补的或杂交的序列长度至少为15、16、17、18或19个核苷酸。更优选地，这些互补细胞和杂交序列的长度为20个核苷酸。预期与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有80％相同性将能确保所设有互补的和/或杂交的序列与SEQ ID NO：1结合。优选地，所述互补序列和杂交序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少80％的相同性，例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选基于其全长序列。

本发明还涉及与(a)或(b)的序列具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的相同性的核苷酸序列。可采用本文上述部分提及的方法测定两条核苷酸序列的相同性。

本发明还包括SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其代表了miR-9.3的前体miRNA。本发明也包括具有与SEQ ID NO：2的核苷酸序列互补的序列的核酸分子，如反义RNA或其它抑制性RNA，如用于RNAi中的核酸分子；或在严格条件下与SEQ ID NO：2的一部分杂交的核酸分子。这些互补序列和杂交序列可以是任意长度，本领域技术人员将理解序列的适当长度应与其使用目的相符。优选地，这些互补的或杂交的序列长度至少为15、16、17、18或19个核苷酸。预期与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有80％相同性将能确保所设有互补的和/或杂交的序列与SEQ ID NO：2结合。优选地，所述互补序列和杂交序列与SEQID NO：2的核苷酸序列具有至少80％的相同性，例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选基于所述互补或杂交序列的全长序列。

应理解，本发明包括与本文所列所有序列(引物序列除外)，例如SEQ IDNO：1-6、22-40和53-56具有上文所述序列相同性(至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列，或严格条件下与所有这些序列(包括具有所述相同性的序列)杂交的序列。

本发明的载体

另一方面，本发明涉及含有本发明核酸分子的载体。所述载体可以是表达载体。表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

可有利使用的载体包括已知的植物载体，例如pK7GWIG2(I)和pGreen，以及本领域用于在微生物中转化和表达蛋白质的载体。可参见Arabidopsis，Alaboratory manual Eds.Weigel&Glazebrook，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Lab Press)(2002)，和Maniatis等，Molecular Cloning，冷泉港实验室出版社(1982)。

本发明的宿主细胞

又一方面，本发明涉及含有本发明核酸、嵌合基因或载体的宿主细胞。本发明的合适宿主细胞包括植物细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、人细胞和动物细胞。合适的植物细胞的例子包括但不限于Brassica和Arabidopsis的细胞。合适的酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。合适的真菌细胞包括曲霉(Aspergillus)。合适的动物细胞包括昆虫细胞，如来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞；哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞或PERC6细胞。可使用本领域现有的各种细胞系，如Flp-In细胞系(Invitrogen)。如上文所述，可使用用于将本发明核酸导入宿主细胞的各种载体。这些载体可以是克隆载体、表达载体、沉默载体，可选自例如质粒DNA载体、病毒DNA载体(如腺病毒或腺相关载体)、病毒RNA载体(如逆转录病毒)或病毒植物载体(如烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus)和马铃薯X病毒(potato virus X))。

在另一实施方式中，所述宿主细胞是转基因植物。

本发明植物细胞的转化

植物miRNA可从前体miRNA加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在60-330bp之间。通常，前体miRNA可在植物细胞内被剪切成成熟的miRNA分子。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(一般约22个核苷酸)，然而也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。植物来源的miRNA是在植物细胞中由前体miRNA加工获得的miRNA。前体miRNA也可从植物中分离出来或由人工合成合成。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入植物中后可被植物加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的核酸构建物。因此，本发明提供了一种分离的核酸构建物，所述的核酸构建物可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被植物细胞裂解且表达成所述的miRNA。

在本发明中，将所述的核酸构建物导入到植物细胞中，该核酸构建物在体内被转录成前体miRNA，之后所述的前体miRNA被加工成miRNA，所述的miRNA可与相应的mRNA的部分序列相互补，从而抑制该mRNA相应的目的基因的表达。所述植物细胞再生成植物后，该转基因植物中相应的目的基因的表达与野生型不同。

在一些实施方案中，希望进行瞬时表达。在这些情况中，可以使用标准瞬时转化技术。这种方法包括但不限于病毒转化方法、DNA或RNA显微注射以及本领域熟知的其它方法。

序列说明

本发明涉及以下序列：

SEQ ID NO：1——成熟的miR-9.3序列

SEQ ID NO：2——miR-9.3前体序列

SEQ ID NO：3——拟南芥QQT1的编码序列(AT5G22370.2)

SEQ ID NO：4——拟南芥FRA-8的编码序列(At2g28110.1)

SEQ ID NO：5——拟南芥QQT1的蛋白序列

SEQ ID NO：6——拟南芥FRA-8的蛋白序列

SEQ ID NO：7-21表示5’-RACE-PCR和实时PCR中使用到的引物

SEQ ID NO：22-40分别表示本发明发现的新miRNA

SEQ ID NO：41-52显示实施例2构建质粒所用引物

SEQ ID NO：53显示IPS 1的序列，该序列中的第236-259位碱基在构建p35S:MIMbra-398a质粒时被ACTTCCTTCTTCTATGTCCACAAT(MIM1885b.3)替换

SEQ ID NO：54显示pRS300的序列，该序列中的第803-822位碱基构建p35S:amiR398a质粒时，被ATTGTGGACAAAGAAGGAAG(对应于miR1885*)替换，而第953-972位被CTCCCTTCTTTGTGCACAAT(对应于miR1885)替换

SEQ ID NO：55显示非结球白菜(B.rapa.ssp.chinensis)QQT1的CDS序列

SEQ ID NO：56显示非结球白菜(B.rapa.ssp.chinensis)QQT1的氨基酸序列

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：白菜中响应热应力的miRNA的鉴别

一.材料与方法

小RNA深度测序

构建小RNA文库的材料是一种非结球白菜(B.rapa.ssp.chinensis)的品种Wu-11。所有材料都种植在22℃16小时光照8小时黑暗的长日照条件下；三周后部分材料进行46℃1个小时的热激处理。收集地上部分的植物材料后用Alternative v1.5Protocol(Illumina，2009)提取RNA样品，使用mirVana^TM miRNA分离试剂盒(Ambion，Inc)进行小RNA分离，Illumina GAII测序仪进行深度测序。

保守miRNA的分析

我们将测序得到的小RNA序列与miRbase中拟南芥miRNA家族的成熟序列进行比对，然后将所有不超过四个碱基错配的miRNA序列匹配到白菜全基因组的scaffold序列数据库(http://brassicadb.org)或者表达序列标签数据库(EST)(http://brassica.bbsrc.ac.uk/)，提取出miRNA成熟序列存基因组或者EST上的600bp旁邻序列。进一步用下载到本地的RNAfold软件对旁邻序列进行批量折叠；最后我们用perl脚本语言检查这些前体是否符合miRNA茎环结构的标准(Meyers et al.，2008)。

白菜新miRNA的预测

我们将所有小RNA序列匹配到白菜全基因组的scaffold序列数据库或者表达序列标签数据库(EST)。小RNA匹配到的基因组位点不超过10个的被保留下来，600bp的旁邻序列被提取出来用RNAfold进行二级结构的预测。进一步我们根据miRNA茎环结构的特点判定该小RNA是否落在预测二级结构的茎上，且不超过4个不匹配的位点(连续3个不匹配的位点也是不允许的)(Meyerset al.，2008)。为了调查这些符合标准的茎环结构前体来自基因组的哪个区域，我们使用BLASTN将这些前体序列比对TAIR9的拟南芥cDNA数据库。最后我们将小RNA测序数据库中的小RNA匹配到这些前体上显示出siRNA在前体的分布图。与核糖体RNA或转座子高度同源的前体序列大部分被排除。根据是否同时实测到预测的miRNA*这一个核心标准最终判定出新miRNA。

新miRNA靶基因预测

将miRNA序列与白菜EST数据库中的EST互补序列做比对，保留碱基不匹配低于四个以下的EST序列；匹配结果用打分矩阵的形式给出，完全匹配给1分，G-U配对0.5分，不匹配的给-1分，在第10或第11位不匹配给-2分。如果有连续两个的不匹配、在前十个碱基有2个以上不匹配、在后面的碱基中有3个以上的不匹配，这三种情况均不保留。最后我们把潜在靶基因的EST序列与拟南芥TAIR9的cDNA数据库比对，确认它在拟南芥的同源基因。

Northern杂交

30-50μg RNA样品在19％的聚丙烯酰胺上以100V稳压电泳3-4小时分离，然后以200mA稳流2小时转至杂交膜上(Amersham biosciences-GE healthcare)；3分钟的紫外交联后，将膜与miRNA互补的生物素标记DNA探针杂交过夜；杂交膜用2×SSC、0.1％SDS在42度洗两次(每次五分钟)，再用0.1×SSC、+0.1％SDS在42度洗两次(每次十分钟)。接着在核酸检测封闭缓冲液中加入稳定的亲和素偶联物(Thermo)，然后用1×洗涤缓冲液洗五次(每次五分钟)；最后，在底物平衡缓冲液洗脱后的杂交膜中加入稳定的过氧化物溶液和增强液，将膜压片后，用显影液对底片进行显影。另外用U6探针作为上样量的内参。DNA探针序列由Invitrogen公司合成并进行3’末端的生物素修饰。

5’-RACE PCR

使用5’全长RACE PCR试剂盒，省略去碱性磷酸酶(CAIP)和TAP(TobaccoAcid Pyrophosphatase)处理，将RNA直接连接5’末端接头，使用oligo-dT进行反转录。每个基因使用两条基因特异嵌套引物(表1)，扩增产物连接到PMD18T载体(Takara)上进行测序。

实时PCR和RT-PCR

RNA用TRIzol(Invitrogen)提取后，进行DNase I(Takara)处理，用4μg进行反转录。实时PCR和RT-PCR使用基因特异引物进行扩增(表1)。实时PCR用相对Ct值方法来衡量转录水平表达量，RT-PCR通过电泳方法判断。白菜中与拟南芥ACT4的同源基因BrcACT4用来做内参。每个实验采用三次生物学重复，三次技术重复。

表1：5’-RACE-PCR和实时PCR中使用到的引物

二.结果与分析

全基因组水平分析热响应小RNA

高温抑制植物的生长，引起叶片黄化甚至死亡。叶片黄化的严重程度与处理的温度梯度及时间梯度有关。为了找出在苗期生长过程中基础耐热温度和受热时间的临界点，我们将白菜用44、45、46、47和48℃五个温度梯度处理0.5，1和2小时三个时间梯度(Wang et al.，2011)。我们发现白菜基因型为Wu-11的温度临界点为46℃1小时，在这个条件处理后移至常温(22℃)的苗停止生长，12天后表现出黄化现象。我们预期该条件影响了早期响应小RNA的生成，但不会带来过多因形态和生理的改变而引起的次级效应。为检测热响应的小RNA，我们对苗龄三周的非结球型白菜Wu-11进行了两次独立的热处理实验。第一次实验中，两组白菜分别进行了46℃1小时的热处理(HT1)和22℃1小时的常温处理(NT1)。处理过后，我们对植株的整个地上部分进行取样。片段大小从9nt到36nt的小RNA被分离出来构建小RNA文库，分别命名为HT1和NT1文库。为确认HT1和NT1文库的质量，我们采用了同样的方法进行了第二次重复实验，将得到的文库分别命名为HT2和NT2文库。

NT1和HT1文库中分别包含了14.67百万和12.77百万条的小RNA读数，NT2和HT2文库中分别包含了11.25百万和14.61百万条的小RNA读数(表2)。表1显示了白菜各小RNA数据库的总读数，其中，特异的小RNA指代只在一种处理类型的数据库中存在的小RNA，共有的小RNA指代在两种处理类型的数据库中都存在的小RNA。因为在每个实验中NT和HT的小RNA总数丰度不一样，我们将每个数据库中小RNA的读数均一化为总数一千万时的读数[每千万总数包含的转录量(TP10M)]。

表2：白菜各小RNA数据库的总读数

一些只出现在HT数据库而不出现在NT数据库的小RNA定义为HT1或HT2特异的小RNA，同样只出现在NT数据库的定义为NT 1或NT2特异的小RNA。HT特异的小RNA(HT1、HT2分别为28％、29％)比NT特异的小RNA(NT1、NT2分别为22％、24％)要多一些，意味着热激在诱导一些小RNA的同时也抑制了一些小RNA，且诱导的要比抑制的多。总的来说，在HT和NT数据库中同时出现的小RNA在丰度上占了主要的比例。

白菜的小RNA在长度上分别在9nt到36nt之间(图1)。其中，24nt的小RNA是最多的。相对于NT数据库，在HT数据库中24nt的小RNA总数有所增加，暗示24nt的小RNA在白菜中最多且它的产生对热较为敏感。长度为21nt的小RNA总数介于24nt的小RNA和其他小RNA之间，在热激条件下，主要由miRNA组成的21nt小RNA有所增加，暗示miRNA总数在热激条件下比常温有较高的累积。小RNA种类的长度分布与小RNA丰度的长度分布一致。

白菜热诱导保守miRNA的鉴定

目前在白菜中有来自10个miRNA家族的19个miRNA分别在三篇文献中被报导(He et al.，2008；Hsieh et al.，2009；Kutter et al.，2007)。其中18条miRNA序列与拟南芥完全一致，只有一条是白菜特异的，在NT和HT数据库中都存在。

为了从测序数据库中筛选出保守miRNA，我们将所有小RNA与miRbase中的已知miRNA进行比对，保留不匹配度低于两个碱基的小RNA。满足条件的小RNA匹配到白菜基因组数据库或者表达序列标签上。总共有62个小RNA与拟南芥已知的35个miRNA家族完全一样或者有两个以下碱基的不匹配，定义为白菜保守miRNA。在基因组中这些miRNA共有158个侧翼序列满足茎环结构和miRNA/miRNA*标准，定义为miRNA前体(表3)。我们通过BLASTN将所有这些前体与拟南芥的miRNA前体进行比对。大部分拟南芥MIRNA基因在白菜中基因组中有两到三个同源拷贝，这与二倍体的白菜基因组拥有拟南芥基因组三倍化特征的报导相符(Mun et al.，2009)。我们依据拟南芥同源的MIRNA基因对白菜保守MIRNA基因进行命名。在这158个MIRNA基因中，有136个产生的成熟序列与拟南芥完全一样，22个有低于两个碱基不匹配的相似序列(表3)。

表3：白菜和拟南芥中保守的miRNA家族成员数目

*IM代表白菜miRNA的成熟序列与拟南芥的完全一样；SM代表白菜miRNA的成熟序列与拟南芥的有1到2个不匹配的碱基；H代表该miRNA在十字花科以外的物种中也高度保守；L代表该miRNA是十字花科特异的miRNA。

我们进一步调查白菜这35个已知miRNA家族中有多少个不仅仅局限于在十字花科中保守。miRbase的数据显示，有28个miRNA家族不仅仅在十字花科中保守。其中miR413至miR420和miR426九个miRNA受到质疑(Jones-Rhoades et al.，2006)，这九个没有一个在我们的小RNA数据库和基因组中找到。相反，miR783在拟南芥和火炬松(Pinus taed)保守，但在琴叶拟南芥(A.lyrata)(Fahlgren et al.，2010)和白菜中均未找到。因此白菜的35个miRNA家族中有28个在十字花科以外高度保守，其中至少有22个在单子叶和双子叶植物中高度保守，9个甚至在苔藓植物中高度保守。其余包括miR165家族在内的7个家族很可能是十字花科特异的(表3)。

miR173参与到TAS1和TAS2前体加工成ta-siRNAs的通路中。意料之外的是我们在小RNA数据库中没有找到miR173，也没有找到miR173驱动产生的ta-siRNA序列。我们进一步检查MIR173基因和TAS1、TAS2是否在白菜基因组中存在，也没有找到任何的同源序列。相反，miR390及其驱动的ta-siRNA在我们的小RNA数据库中出现，MIR390基因和TAS3基因也在白菜基因组中存在，意味着MIR390和TAS3在白菜中是有功能的。此外，驱动TAS4的miR828在白菜中被检测到，由TAS4产生的小RNA没有检测到。我们推测白菜基因组中可能不存在TAS1、TAS2和TAS4基因。不管怎样，miR390和TAS3产生的小RNA并不受高温诱导。

对保守miRNA进行注释之后，我们接着就可以调查哪些是热响应的miRNA。白菜35个miRNA家族中共有62条序列特异的miRNAs，在两次独立实验中都有两倍以上变化的miRNA为热响应miRNA，其中有1条受热诱导，4条受热抑制(表4)。

表4：在热处理条件下丰度上升或者下降超过两倍以上变化的miRNA

*NT1和HT1是实验1中分别进行了NT和HT处理后测序得到的小RNA数据库；NT2和HT2是实验2中分别进行了NT和HT处理后测序得到的小RNA数据库。

Bra-miR398a非常显著地下调了十倍以上，已知它在拟南芥的同源基因通过调控它的靶基因CSD1一个铜锌超氧化物歧化酶来响应过氧化胁迫(Sunkar etal.，2006)。为验证bra-miR398的热响应，我们用Northern杂交检测了miR398的表达，和用实时PCR检测了靶基因的表达。bra-miR398a在HT样品中的累积量要比NT样品少得多(图2A，2B)。相反，BracCSD1在HT样品中累积量要高于NT样品(图2C)。这个结果暗示BracCSD1参与了白菜的热响应，而miR398通过对BracCSD1的剪切介导BracCSD1的表达。

从miRNA前体产生的小RNA分析

在拟南芥中有许多小RNA从miRNA前体中产生。有一类被称为miRNA兄弟小RNA，它们也通过剪切靶基因发挥转录后调控(Zhang et al.，2010)。依据小RNA在前体上的分布，我们把小RNA分成三类：与miRNA成熟序列有部分重叠的miRNA变体，与miRNA*有部分重叠的miRNA*变体，和分布于miRNA与miRNA*侧翼序列的miRNA兄弟小RNA。多数与热响应miRNA来自同一前体的小RNA与miRNA热响应的变化模式一致。例如，来自bra-miR156h-2的miRNA变体与miRNA*变体同时表现出受热诱导上调的趋势(图3A)。但是，也有一些miRNA*变体的热响应变化与同一前体上的miRNA变体相反。比如，bra-miR167a和bra-miR400的miRNA*变体受热抑制，而它们的miRNA变体却不变或有微量的上调(图3B，C)。这些结果暗示高温可能以不同的方式影响了miRNA和miRNA*变体的合成和稳定性。

白菜热响应特异miRNA的鉴定

为预测白菜中新的miRNA，我们将数据库中所有长度在20-22bp的小RNA匹配到白菜基因组或表达序列标签，提取出其旁邻的600bp片段，使用RNAfold软件预测它的二级结构。按照miRNA茎环结构特点(Meyers et al.，2008)，判断落在茎环上且碱基不匹配低于四个以下的小RNA前体候选下来进行后续分析。然后我们将候选前体与拟南芥cDNA数据库进行BLASTN，最后将数据库中的小RNA匹配到候选前体上，做出前体上小RNA的分布图。我们剔除了绝大多数与核糖体或转座子同源且有许多小RNA弥散分布的前体。

根据miRNA/miRNA*同时存在的核心标准，我们鉴定到了来自19个miRNA家族的21个新miRNA(表5)。根据miRNA和EST序列的互补性我们进一步预测了新miRNA的靶基因。在这些新miRNA中，miR5和miR19受热诱导上调两倍以上，而miR7和miR9b.3受热抑制下调两倍以上(表4)。miR9b.3的前体可以产生三对miRNA/miRNA*序列(图4A)。在热处理条件下，miR9.3、miR9.3*和miR9.2*的累积量大大减少(图4B)。我们用northern杂交的方法验证了miR9b.3在HT样品中剧烈下降。相反，它的靶基因在HT中表现出上调的变化(图4C-E)。

表5：白菜新miRNA的成熟序列

另一个热响应的miRNA是bra-miR10(图5A，B)。在热处理条件下，bra-miR10上调了1.5倍左右。在bra-miR10前体上产生的小RNA也均表现出了热诱导上调的趋势。相反，miR10的靶基因BracPAP10表现出了受热下调的变化(图5C)。我们的结果显示bra-miR9b.3和bra-miR10作为两个白菜特异的miRNA，参与到了白菜的热响应通路中。

白菜新miRNA和其靶基因的进化关系

通过对miRNA前体与拟南芥cDNA数据库的同源比对，我们发现有十个miRNA的前体和编码基因的一些片段高度同源。其中有三个miRNA剪切的靶基因可能是miRNA进化而来的祖先。bra-miR4前体可能是从BracDRL1基因进化而来(图6A)。图6B显示bra-miR4-3p和bra-miR4-5p是两个从同一前体中来的小RNA，较低丰度的bra-miR4-3p靶基因预测是BracDRL1，而较高丰度的bra-miR4-5p靶基因预测是BracVEL1。为验证bra-miR4-3p和bra-miR4-5p对靶基因的剪切，我们进行了5’RACE PCR实验。如预期的一样，BracDRL1和BracVEL1与miRNA互补区域检测到高频率的断点。类似的，bra-miR9.1和bra-miR9.3也是来自同一前体的小RNA，该前体可能从BracTAO1中进化而来。5’-RACE实验显示bra-miR9.1能够剪切BracTAO1(图6D)。我们认为来自同一miRNA前体的不同miRNA能够在转录后水平调控不同的靶基因。第三个可能是从靶基因中进化而来的是bra-miR10(图5A)。我们的5’-RACE PCR确认了bra-miR10对其靶基因bracPAP10的剪切(图5B)。

一些新miRNA与编码基因没有长片段的相似性，可能是在原先的位置发生随机突变后获得了miRNA茎环结构的特征(Chen et al.，2007)。有一些植物的miRNA被认为是从转座子(TE)中进化而来(de Felippes et al.，2008)。我们注意到bra-miR3是唯一一个序列与TE有一定相似性的miRNA。在白菜中，bra-miR3/miR3*被检测到，但前体中不存在任何其他的miRNA兄弟小RNA，提示DCL1/HYL1复合体可能识别这一个茎环结构。像bra-miR3这样的miRNA前体很有可能是从TE中进化而来。

实施例2：bra-miR1885.3及其靶基因BrcQQT1抗热性鉴定

一.材料和方法

p35S:BracQQT1的构建：以白菜cDNA为模板，用引物对(BracQQT1-1Sand BracQQT1-921A)[见用于载体构建的引物表]和KOD-plus聚合酶(ToYoBo公司)进行PCR扩增；将PCR产物后通过rTaq(Takara公司)进行加A，连接到PMD18T载体(宝生物工程(大连)有限公司)；最后通过KpnI和XbaI进行双酶切，将酶切产物连接到pCAMBIA2301载体的KpnI和XbaI的酶切位点之间。

人工miRNA的构建：通过人工miRNA设计网站WMD针对引入的人工miRNA序列生成四条引物序列(I到IV)，用此四条引物对包括有内源miR319前体的pBSK质粒(pRS300)进行特定的定点突变。包含有人工miRNA的前体通过叠加PCR产生：第一轮扩增通过如下表的三对引物产生(a)到(c)三种产物；第二轮扩增以这三个产物的混合物为模板进行叠加PCR。

p35S:amiR1885b.3载体的构建：第一轮PCR扩增(a)到(c)以pRS300质粒为模板，分别用三对引物(amiRNA-A/bra-amiR1885b.3*-IVa，bra-amiR1885b.3-IIa/bra-amiR1885b.3*IIIs，和bra-amiR1885b.3-Is/amiRNA-A)通过KOD-plus聚合酶(ToYoBo公司)进行PCR扩增；第二轮扩增以(a)到(c)的扩增产物为模板，用引物对(amiRNA-A/amiRNA-B)通过KOD-plus聚合酶(ToYoBo公司)进行叠加PCR扩增；扩增产物直接进行KpnI和XbaI双酶切，连接到pCAMBIA2301载体的KpnI和XbaI的酶切位点之间。

p35S:MIMbra-1885b.3载体的构建：第一轮扩增产物(a)和(b)以IPS1基因为模板，分别用两对引物(IPS1-1S-BamH1/MIRbra-1885b.3-Ia，MIRbra-1885b.3-IIs/IPS1-522A-Sal1)通过KOD-plus聚合酶(ToYoBo公司)进行PCR扩增；第二轮扩增以(a)和(b)的扩增产物为模板，用引物对(IPS1-1S-BamH1/IPS1-522A-Sal1)过KOD-plus聚合酶(ToYoBo公司)进行PCR扩增；扩增产物直接用BamHI和SalI进行双酶切，连接到pCAMBIA1301载体的BamHI和SalI的酶切位点之间。其中这部分实验利用了IPS1基因(INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION1)的一个特性，IPS1是一非编码蛋白基因，野生型的IPS 1基因中间有一段可与miR399部分互补，通过与miR399稳定结合从而“拮抗”了miR399对其他靶基因的降解作用。发明人将原miR399的结合序列改造为与miR1885互补的序列，经改造的IPS 1基因的mRNA转录本可作为miR1885的“假底物”拮抗其功能的发挥。以IPS 1基因为基础构建MIMbra-miR1885过表达载体并转入拟南芥。

所有构建均置于pCAMBIA2301或pCAMBIA1301载体(CAMBIA公司)组成型表达的花椰菜花叶病毒35S启动子的后面；载体通过农杆菌进行植物浸染。植物种植在22℃恒温、温度为65％的长日照条件下(16小时光照、8小时黑暗)。

鉴别bra-miR398和BracCSD1的耐热性的方法包括：

(1)鉴别野生型和转基因植物之间的基础耐热性和获得耐热性

将2周龄拟南芥暴露于45℃1小时，进行基础耐热性检测；暴露于37℃1小时、3小时，以及49℃1小时，进行获得性耐热性检测(Ogawa等，2007，有修改)。HS处理后，使这些植株在22℃生长3天(进行基础耐热性检测)和6天(进行获得性耐热性检测)，然后拍照，计算存活植株的数量。

(2)分布使用台盼蓝染色和DAB染色鉴别野生型和转基因植株之间小丛死细胞和局部H₂O₂生产。对于台盼蓝染色，在台盼蓝缓冲液(12.5％苯酚、12.5％甘油、12.5％乳酸、48％乙醇和0.025％台盼蓝)中煮沸4周龄野生型和转基因植株的莲座丛(rosettes)1分钟，然后室温孵育10分钟，接着在70％水合氯醛(chloralhydrate)中脱染色(5次)。对于DAB染色，切碎4周龄野生型和转基因植株的莲座丛，放入1mg/mL的DAB溶液(pH3.8)，室温下过夜(约8小时)，接着在96％沸腾的乙醇中清洗10分钟。

二.结果

我们的小RNA测序数据显示白菜bra-miR1885.3受热诱导显著下调，Northern blot的结果验证了成熟bra-miR1885b.3在热处理后下调，进一步我们通过将bra-miR1885b.3白菜的EST数据库进行数据比对，预测了bra-miR1885.3的几个潜在靶基因。用real-time PCR检验了bra-miR1885.3的其中一个靶基因BrcQQT1，发现其受热诱导上调。

为验证白菜BrcQQT1基因的过量表达和bra-miR1885.3的下调是否有助于提高作物的抗热性，我们构建了BrcQQT1在拟南芥过量表达的转基因株系和过表达MIMbra-miR1885.3(mimicry bra-miR1885.3，起到下调bra-miR1885.3的作用)的转基因株系；我们也构建了bra-miR1885.3的转基因株系。

然后，我们对个转基因系采用44℃、1小时的热激方法进行了初步的抗热筛选，结果如表6所示。

表6

结论：过表达bra-miR1885.3的转基因株系对热处理更敏感，下调bra-miR1885.3的MIMbra-miR1885.3转基因植株抗热，而过表达靶基因BrcQQT1的转基因植株也抗热。bra-miR1885.3及其靶基因BrcQQT1可用于不同作物的抗热育种。

Claims (14)

1.分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自：

(a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和

(b)与(a)互补的核苷酸序列。

2.一种表达构建物，其含有在植物细胞中有活性的操作性连接于权利要求1所述核酸分子的启动子，所述启动子任选地进一步操作性连接于3’非翻译核酸分子。

3.一种载体，其含有权利要求1所述的核酸分子或权利要求2所述的表达构建物。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体所含的核酸分子是权利要求1所述的与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列互补的核酸分子，或所含的表达构建物中所含的核酸分子是权利要求1所述的与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列互补的核酸分子。

5.权利要求4所述的载体在转化植物细胞以提供耐热植物中的应用，其中，所述植物为十字花科的植物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为大白菜或小白菜。

7.一种制备耐热性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括降低所述植物中具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的核酸序列的水平的步骤，其中，所述植物为十字花科的植物，其中，所述降低所述植物中具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的核酸序列的水平的步骤包括选自下组的一个或多个步骤：

将一核苷酸序列导入所述植物，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的互补序列；和

下调编码SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的基因的表达。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物为大白菜或小白菜。

9.一种制备耐热性提高的植物和/或其部分的方法，所述方法包括提高所述植物中具有SEQ ID NO:55所示核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的蛋白序列的水平的步骤，其中，所述植物为十字花科的植物，且其中，所述提高所述植物中具有SEQ ID NO:55所示核苷酸序列的核酸序列的水平，和/或提高所述植物中具有SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的蛋白序列的水平的步骤包括选自下组的一个或多个步骤：

在所述植物中过表达一核酸，所述核酸具有SEQ ID NO:55所示核苷酸序列，或编码具有SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的蛋白序列。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物为大白菜或小白菜。

11.权利要求1所述的核酸分子在调节植物耐热性中的应用，其中，所述植物为十字花科的植物。

12.权利要求1所述的核酸分子在提供耐热性植物的遗传分析或标记物辅助的选择方法中的应用，其中，所述植物为十字花科的植物。

13.权利要求1所述的核酸分子在提供耐热性植物的植物育种方法中的应用，其中，所述植物为十字花科的植物。

14.如权利要求11－13中任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为大白菜或小白菜。