CN103026362A - 制造用于检测靶碱基的含rna探针的方法 - Google Patents

Abstract

公开了制造用于检测靶碱基的含RNA探针的简单而有用的方法；碱基序列信息处理方法；碱基序列信息处理装置；碱基序列信息处理系统；和用于检测碱基的方法。所公开的碱基序列信息处理方法包含这样的步骤，其中产生含有7-14个碱基和具有25-40℃的Tm值的部分碱基序列，且靶碱基或邻近靶碱基的碱基为自所述部分碱基序列3’或5’端的第3、第4、第5个碱基。当关于在未基于研究者角色的直觉或经验的情况下，简单而有效地制造用于检测靶碱基的含RNA探针时，所公开的方法是有用的。所述方法不仅在遗传工程领域而且在医学研究领域中极为有用。

Description

制造用于检测靶碱基的含RNA探针的方法

技术领域

本发明在第一方面涉及用于处理核苷酸序列信息的方法、用于处理核苷酸序列信息的装置、用于处理核苷酸序列信息的系统、用于制造用于检测靶核苷酸的含RNA的探针的方法及用于检测靶核苷酸的方法。

本发明在第二方面涉及用于设计可用于检测靶核酸的含RNA探针的方法、用于处理在设计中使用的核苷酸序列的方法和使计算机可执行所述核苷酸序列处理方法的程序和记录介质。另外，本发明涉及用于实施所述核苷酸序列处理方法的装置。

背景技术

核酸的扩增或检测技术在医学、药学、农业、林业、渔业和食品领域已是不可缺少的，例如，其不但在遗传工程和分子生物学中，而且亦在疾病的诊断、遗传改良食品的检查和微生物、病毒以及病原菌的检测中作为实验工具。

已知有这样一组基因，不管其生物种类如何，其在编码物质、酶和具有相似功能的其它物质的基因上具有高度同源性。亦已知属于同一物种的生物的个体基因组不完全相同，在其核苷酸序列上具有差异，这叫做多态性。已知多态性表现出一至数十个核苷酸的缺失或插入、特定核苷酸序列的重复等等。一种核苷酸用另一种核苷酸进行取代，叫做单核苷酸多态性(SNP，本文中可阐述为单核苷酸取代)，其作为在搜索疾病相关的基因、测定疾病的易感性或了解药物的敏感性差异(作用和副作用)方面的指示物已引起关注。用于检测所述取代的方法研究亦正在进行中。

用于检测具有高度同源性的基因群中特定基因并用于检测SNP的方法包括这样的方法，其中让通过含RNA探针和靶DNA杂交形成的RNA-DNA杂交体经受核糖核酸酶的切割(例如专利文件1)。在该方法中，设计含RNA探针以便当探针和靶DNA之间存在错配时，核糖核酸酶不能切割杂交体，从而可确认靶DNA中特定核苷酸或核苷酸取代的存在或不存在。

一直通过以下方法设计用于基因检测的常规探针：以靶核酸的核苷酸序列为基础，选择在探针和靶核酸之间发生特异杂交的这样的核苷酸序列，将待形成的杂交体的Tm值或探针的自我互补性用作指示物。亦提供了用于设计合适探针的多种软件。

然而，可仅在包括或不包括特定核苷酸、或包括导致或可能导致核苷酸取代的特定核苷酸的区域中，来设计如上所述的用于检测靶核酸的含RNA探针，因此，与设计常规探针的情况相比，在区域的选择上具有限制。此外，需要探针中含有的RNA部分对核糖核酸酶H的敏感性有很大程度的变化，所述变化程度取决于特定核苷酸或SNP的存在/不存在。迄今为止，这些限制使得研究者们没有选择，只能在其经验或反复试验的基础上设计含RNA探针。

现有技术文献

专利文件

专利文件1：美国专利No. 5,660,988

发明概述

本发明要解决的问题

在第一方面，本发明的目的是提供制造用于检测靶核苷酸的含RNA探针的简单有用的方法，提供用于处理核苷酸序列信息的简单有用的方法、装置和系统，和提供用于检测靶核苷酸的简单有用的方法。

在第二方面，本发明的目的是提供设计用于检测靶核酸的含RNA探针的简单有用的方法，提供用于处理核苷酸序列的简单有用的方法、装置和系统。

解决问题的手段

为了解决上述问题，本发明人致力于研究设计用于检测靶核酸的含RNA探针，先前研究者们一直是通过针对待检测的靶核酸中每一特定核苷酸或单个核苷酸取代的反复试验来设计所述探针。本发明人已检查了大量的以组合-组合为基础的条件组合，结果发现，当与核糖核酸酶H组合使用时，设计成满足特定条件的序列的含RNA探针能够有效检测特定核苷酸或SNP，从而导致了本发明的完成。本发明人亦开发出用于设计上述含RNA探针的核苷酸序列处理方法；开发出使计算机能执行所述处理方法的程序；开发出核苷酸序列的处理装置；以及还开发出用于处理核苷酸序列的系统，其设计用于检测靶核苷酸的含RNA探针，另外仅通过输入来自与核苷酸序列处理装置连接的客户端(client)装置的靶核酸的核苷酸序列信息，提供关于能够有效检测特定核苷酸或单个核苷酸取代的引物对的信息，所述客户端以可与所述核苷酸序列处理装置经由网络进行通信的状态连接。藉此，本发明人完成了本发明。

因此，本发明第一方面概述为涉及：

[1]用于处理核苷酸序列信息的方法，其通过用于处理核苷酸序列信息的装置来实施，该方法包括以下步骤：

将靶核苷酸的位置信息输入到待输入的核苷酸序列中，藉此输出包含输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，所述待输入的核苷酸序列包含靶核苷酸、邻近靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近靶核苷酸3’侧的核苷酸；

产生包含靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，其与包含靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

产生核苷酸序列及其互补核苷酸序列，其通过将核苷酸序列中的靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸变换为RNA来获得，在核苷酸序列中包含靶核苷酸或邻近靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息；和

自通过RNA核苷酸变换获得的核苷酸序列及其互补核苷酸序列产生部分核苷酸序列，其包含靶核苷酸或邻近靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息，

其中

(d)部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)核苷酸序列中靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置。

[2]用于处理核苷酸序列信息的方法，其通过用于处理核苷酸序列信息的装置来实施，该方法包括以下步骤：

将靶核苷酸的位置信息输入到待输入的核苷酸序列中，藉此输出包含输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，所述待输入的核苷酸序列包含靶核苷酸、邻近靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近靶核苷酸3’侧的核苷酸；

产生包含靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，其与包含靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

自输出的核苷酸序列和所产生的互补核苷酸序列产生部分核苷酸序列，其包含靶核苷酸或邻近靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息，

其中

(d)部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)核苷酸序列中靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置；和

产生部分核苷酸序列，其通过将核苷酸序列中的靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸变换为RNA来获得，在部分核苷酸序列中包含靶核苷酸或邻近靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息。

[3]用于处理核苷酸序列信息的方法，其通过用于处理核苷酸序列信息的装置来实施，该方法包括以下步骤：

将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中，藉此输出包含输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，所述待输入的核苷酸序列包含靶核苷酸、邻近靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近靶核苷酸3’侧的核苷酸；

产生包含靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，其与包含靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

对输出的核苷酸序列和产生的互补核苷酸序列进行下列判定(determination)中的至少一项判定：

(a)判定靶核苷酸是否为嘌呤核苷酸，

(b)判定邻近靶核苷酸3’侧的核苷酸是否为嘌呤核苷酸，和

(c)判定邻近靶核苷酸5’侧的核苷酸是否为嘌呤核苷酸，

藉此从输出的核苷酸序列和所产生的互补核苷酸序列将为嘌呤核苷酸的一个核苷酸确定为RNA位置，藉此输出包含RNA位置信息的核苷酸序列；

自包含RNA位置信息的待输出核苷酸序列产生包含RNA位置信息的部分核苷酸序列，

其中

(d)部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)表明为RNA位置的一个核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置；和

产生部分核苷酸序列，其通过将确定为RNA位置的核苷酸变换为RNA来获得，在核苷酸序列中包含RNA位置信息或在部分核苷酸序列中包含RNA位置信息。

[4]用于处理[3]的核苷酸序列信息的方法，其中输出包含RNA位置信息的核苷酸序列的步骤包含：基于靶核苷酸和所确定的RNA位置之间的相对位置，自通过RNA核苷酸变换获得的所产生的部分核苷酸序列中，确定用于选择作为用于检测靶核苷酸的含RNA探针优良的部分核苷酸序列的优先级(priority)；和输出包含所确定优先级的核苷酸序列或部分核苷酸序列。

[5]通过计算机实施的程序，其包含[1]-[4]中任何一项的用于处理核苷酸序列信息的方法的步骤。

[6]计算机可读取的记录介质，其特征为该介质储存[5]的程序。

[7]用于处理核苷酸序列信息的装置，其包含：

用于将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中藉此输出包含输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件(means)，所述待输入的核苷酸序列包含靶核苷酸、邻近靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近靶核苷酸3’侧的核苷酸；

用于产生包含靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述核苷酸序列与包含靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

用于产生核苷酸序列及其互补核苷酸序列的组件，所述核苷酸序列通过将核苷酸序列中的靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸变换为RNA来获得，在核苷酸序列中包含靶核苷酸或邻近靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息；和

用于自通过RNA核苷酸变换获得的核苷酸序列及其互补核苷酸序列，产生部分核苷酸序列的组件，所述部分核苷酸序列包含靶核苷酸或邻近靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息，

其中

(d)部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)核苷酸序列中靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置。

[8]用于处理核苷酸序列信息的装置，其包含：

用于将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中藉此输出包含输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述待输入的核苷酸序列包含靶核苷酸、邻近靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近靶核苷酸3’侧的核苷酸；

用于产生包含靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述序列与包含靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

用于自输出的核苷酸序列和产生的互补核苷酸序列产生部分核苷酸序列的组件，所述部分核苷酸序列包含靶核苷酸或邻近靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息，

其中

(d)部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)核苷酸序列中靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置；和

用于产生部分核苷酸序列的组件，所述部分核苷酸序列通过将核苷酸序列中的靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸变换为RNA来获得，在部分核苷酸序列中包含靶核苷酸或邻近靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息。

[9]用于处理核苷酸序列信息的装置，其包含：

用于将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中藉此输出包含输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述待输入的核苷酸序列包含靶核苷酸、邻近靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近靶核苷酸3’侧的核苷酸；

用于产生包含靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述序列与包含靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

用于对输出的核苷酸序列或产生的互补核苷酸序列进行下列判定中的至少一项判定的组件：

(a)判定靶核苷酸是否为嘌呤核苷酸，

(b)判定邻近靶核苷酸3’侧的核苷酸是否为嘌呤核苷酸，和

(c)判定邻近靶核苷酸5’侧的核苷酸是否为嘌呤核苷酸，

藉此自输出的核苷酸序列或所产生的互补核苷酸序列将为嘌呤核苷酸的一个核苷酸确定为RNA位置，藉此输出含有RNA位置信息的核苷酸序列；

用于自包含RNA位置信息的输出核苷酸序列中产生包含RNA位置信息的部分核苷酸序列的组件，其中

(d)部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)表明为RNA位置的一个核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置；和

用于产生部分核苷酸序列的组件，所述部分核苷酸序列通过将确定RNA位置的核苷酸变换为RNA来获得，在核苷酸序列中包含RNA位置信息，或在部分核苷酸序列中包含RNA位置信息。

[10]用于处理[9]的核苷酸序列信息的装置，其中用于输出包含RNA位置信息的核苷酸序列的组件包含：基于靶核苷酸和所确定的RNA位置之间的相对位置，自通过RNA核苷酸变换获得的所产生的部分核苷酸序列中，确定用于选择作为用于检测靶核苷酸的含RNA探针优良的部分核苷酸序列的优先级；和输出包含所确定优先级的核苷酸序列或部分核苷酸序列。

[11]用于处理核苷酸序列信息的系统，其包含[7]-[10]中任何一项的用于处理核苷酸序列信息的装置和经由网络连接的客户端装置，其中

客户端装置包含：用于经由网络将包含输入的核苷酸序列的信息传输至用于处理核苷酸序列信息的装置的传输组件，和

用于处理核苷酸序列信息的装置包含：用于基于包含核苷酸序列的传输信息产生和输出所产生的部分核苷酸序列的组件，所述所产生的部分核苷酸序列通过RNA核苷酸变换获得。

[12]用于制造用于检测靶核苷酸的含RNA探针的方法，其包括制备与部分核苷酸序列具有相同序列的含RNA和DNA的核酸片段的步骤，所述部分核苷酸序列通过RNA核苷酸变换来获得，其通过[1]-[4]的用于处理核苷酸序列信息的方法来产生。

[13]用于检测靶核苷酸的方法，其包括以下步骤：让样品中的核酸与用于检测靶核苷酸的含RNA的探针杂交，所述探针通过[12]的方法制造；在杂交步骤之后，将核糖核酸酶H处理施用至用于检测靶核苷酸的含RNA探针；和检测用于检测靶核苷酸的含RNA探针是否被核糖核酸酶H切割。

此外，本发明在第二方面涉及：

[1]用于设计用于检测靶核苷酸的含RNA探针的方法，其包括制造满足以下条件的核苷酸序列的步骤：

(a)一个嘌呤核苷酸为RNA，其它的为DNA，

(b)衍生自待检测的靶核酸的核苷酸序列或其互补链具有7-14个核苷酸，

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置，和

(d) Tm值在25-40℃范围之内；

[2]　[1]的设计方法，其中步骤(a)中的RNA核苷酸为对应于选自以下的核苷酸的核苷酸：其中可能导致靶核酸中单核苷酸取代的核苷酸、邻近核苷酸的3’侧的核苷酸、互补链中对应于可能导致靶核酸中单核苷酸取代的核苷酸的核苷酸和互补链中邻近核苷酸的3’侧的核苷酸；

[3]用于检测靶核酸的方法，其包括以下步骤：通过[1]或[2]的方法来设计用于检测靶核苷酸的含RNA探针；合成探针；让合成的含RNA探针与样品中的核酸杂交；和施用核糖核酸酶H处理来检查探针是否被核糖核酸酶切割；

[4]用于处理靶核酸的核苷酸序列的方法，所述方法用于设计用于检测靶核苷酸的含RNA探针，所述方法包括：

获得核苷酸序列信息的步骤，其中获得待检测的靶核酸的核苷酸序列信息；

对核苷酸进行判定的步骤，其中进行判定以确定选自以下的核苷酸是否为嘌呤核苷酸：靶核酸的核苷酸序列的一个核苷酸、邻近所述一个核苷酸3’侧的核苷酸、靶核酸的互补链核苷酸序列中对应于所述一个核苷酸的核苷酸和互补链的核苷酸序列中邻近所述核苷酸3’侧的核苷酸；

产生核苷酸信息的步骤，其中将嘌呤核苷酸中的一个设置为RNA，将其它的设置为DNA；

产生部分核苷酸序列的步骤，其中将衍生自待检测的靶核酸或其互补链的核苷酸序列中的核苷酸数量设定为7-14，藉此产生关于部分核苷酸序列的信息；

选择核苷酸序列的步骤，其中基于部分核苷酸序列的信息选择其RNA核苷酸位于距3’端或5’端3-5个核苷酸的位置的核苷酸序列；和

选择含特定核苷酸的序列的步骤，其中选择含特定核苷酸的序列，其中通过核苷酸序列选择步骤获得的核苷酸序列的Tm值在25-40℃范围之内；

[5]　[4]的用于处理核苷酸序列的方法，所述方法进一步包括设计用于扩增靶核酸的引物的步骤，其中基于靶核酸的核苷酸序列信息，设计用于扩增靶核酸的片段的引物对，所述靶核酸包含对应所设计的含RNA探针的区域；

[6]　[4]的用于处理核苷酸序列的方法，其中核苷酸序列信息中的所述一个核苷酸为其中可能导致单核苷酸取代的核苷酸；

[7]特征为可使计算机执行[4]或[5]的核苷酸序列处理方法的程序；

[8]在其上记录[7]的程序的计算机可读取的记录介质；

[9]用于处理靶核酸的装置，所述装置用于设计用于检测靶核酸的含RNA探针，所述装置包含：

用于获得核苷酸序列信息的组件，其中获得待检测的靶核酸的核苷酸序列信息；

用于对核苷酸进行判定的组件，其中进行判定以确定选自以下的核苷酸是否为嘌呤核苷酸：靶核酸的核苷酸序列的一个核苷酸、邻近所述一个核苷酸3’侧的核苷酸、靶核酸的互补链核苷酸序列中对应于所述一个核苷酸的核苷酸和互补链核苷酸序列中邻近所述核苷酸3’侧的核苷酸；

用于产生核苷酸信息的组件，其中将嘌呤核苷酸中的一个设定为RNA，将其它的设置为DNA；

用于产生部分核苷酸序列的组件，其中将衍生自待检测的靶核酸或其互补链的核苷酸序列中的核苷酸数量设定为7-14，藉此产生关于部分核苷酸序列的信息；

用于选择核苷酸序列的组件，其中基于关于部分核苷酸序列的信息，选择其中RNA核苷酸位于距3’端或5’端3-5个核苷酸的位置的核苷酸序列；和

用于选择含特定核苷酸的序列的组件，其中通过核苷酸序列选择步骤获得的核苷酸序列的Tm值在25-40℃范围之内；

[10] [9]的用于处理核苷酸序列的装置，其进一步包含设计用于扩增靶核酸的引物的组件，其中基于靶核酸的核苷酸序列信息，设计用于扩增靶核酸的片段的引物对，所述靶核酸包含对应所设计的含RNA探针的区域；

[11] [9]的用于处理核苷酸序列的装置，其中核苷酸序列信息中的所述一个核苷酸为其中可能导致单核苷酸取代的核苷酸；和

[12]用于处理核苷酸序列的系统，其包含[9]或[10]的核苷酸序列处理装置和经由网络以能够与之通信的状态与核苷酸序列处理装置连接的客户端装置，其特征在于：

客户端装置包含用于将靶核酸的核苷酸序列信息传输至核苷酸序列处理装置的传输组件，和用于获得以下信息的组件：自核苷酸序列处理装置传输的靶核酸中关于用于检测靶核酸的含RNA探针的信息，或探针信息，和关于用于扩增靶核酸的引物的信息。

发明效果

根据本发明，研究者可简单地设计用于检测靶核酸的含RNA探针，而以前是基于他们的经验或感觉来设计所述探针，这使得可有效检测靶核酸以及靶核酸中的特定核苷酸(本文中可称为靶核苷酸)或SNP。亦提供了关于能够有效检测靶核酸中特定核苷酸或单核苷酸取代的引物对的信息，因此，可由在检测靶核酸方面具有很少经验或没有经验的研究者来容易地设计用于检测靶核酸的含RNA探针，这使得可有效检测感兴趣的靶核酸中的特定核苷酸或SNP。

附图简述

图1表示流程图，其显示本发明用于处理核苷酸序列的方法的步骤。

图2表示流程图，其显示本发明用于处理核苷酸序列的方法的步骤的实例。

图3表示流程图，其显示本发明用于处理核苷酸序列的方法的步骤的实例。

图4表示多个图示，其各自显示因根据本发明的方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图5表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图6表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图7表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图8表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图9表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图10表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图11表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图12表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图13表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图14表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图15表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图16表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图17表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图18表示多个图示，其各自显示因根据本发明方法设计的含RNA探针的Tm值而致的特异性结果的实例。

图19表示本发明装置的框图的实例。

图20为显示数据存储器23的内部结构的图示。

图21表示本发明用于处理核苷酸序列的方法的流程图的实例。

图22表示ST3的流程图。

图23表示ST4的流程图。

图24表示ST31的流程图。

图25表示ST32的流程图。

图26表示概括ST1-ST4中输入或产生的数据形式的表格。

图27表示在处理步骤ST2中所参考的表格。

图28表示显示在处理步骤ST18-ST25中产生的串(string) N的表格。

图29表示在判定步骤ST11-ST17中所参考的表格。

图30表示在处理步骤ST33中所参考的表格。

图31表示在判定步骤ST5中所参考的表格。

图32表示在处理步骤ST10中输出的数据的表格。

用于实施本发明的实施方案

下面将具体阐述本发明。

本发明提供在检测靶核酸的方法中使用的含RNA探针，其基于探针与靶核酸杂交后是否被核糖核酸酶H切割。关于按照本发明设计的含RNA探针的特征，下面以实例方式给出了关于含RNA探针的解释，所述探针用于在靶核酸中特定位置检测核苷酸X。本文中核苷酸X可为靶核酸中的任何核苷酸，例如，因单核苷酸取代而被正常核苷酸取代的核苷酸，或通常存在但可能被另外的核苷酸取代的核苷酸。上述核苷酸X在本文中亦可称为靶核苷酸。

本发明的含RNA探针具有能够与包含上述靶核酸中的核苷酸X的区域或与该区域互补的区域杂交的序列。因此，探针具有以下序列：其为选自靶核酸或其互补链的核苷酸序列的一部分并且其与包含核苷酸X或与靶核酸互补链中核苷酸X互补的核苷酸(称作核苷酸Y)的区域杂交。所述序列的链长不受特别限制，优选为7-14个核苷酸。核苷酸X、核苷酸Y或邻近核苷酸X和核苷酸Y各自3’侧的核苷酸中的至少一个为嘌呤核苷酸(腺嘌呤或鸟嘌呤)，由此选择这些嘌呤核苷酸的任何一个，以使当设计本发明的含RNA探针时，仅该核苷酸被设定为RNA，其它的被设定为DNA。例如，在核苷酸X和邻近核苷酸X 3’侧的核苷酸为嘧啶核苷酸(胞嘧啶或胸腺嘧啶)的情况下，可通过从靶核酸的互补链序列设计含RNA探针(将核苷酸Y或邻近核苷酸Y 3’侧的核苷酸设定为RNA)来满足这一条件。对于DNA核苷酸，除dATP、dCTP、dGTP和dTTP外，还可使用例如dUTP、肌苷、7-DEAZA-GTP、7-DEAZA-ATP和LNA-修饰的DNA核苷酸。RNA核苷酸位于距探针3’或5’末端3-5个核苷酸的位置。在优选方面，RNA核苷酸位于自探针3’或5’末端的任一端第三或第四个核苷酸的位置。探针的Tm值在25-40℃范围之内，优选25-32℃。本文中在具有500 nM DNA浓度和50 mM盐浓度的条件下，使用最近毗邻法并进一步使用Biochemistry, 第36卷, No. 34, 第10581-10594页(1997)中所述的方法来计算Tm值。

当探针与包含核苷酸X的靶核酸(DNA)或其互补链杂交并用核糖核酸酶H进行处理时，与不满足上述任何一个条件的探针相比，核糖核酸酶H能更有效地切割满足上述条件的含RNA探针。因此，满足上述条件的含RNA探针能够以高灵敏度检测靶核酸中核苷酸X的存在情况。

在本发明设计用于检测靶核酸的含RNA探针的方法中，首先获得靶核酸的核苷酸序列信息。本文中“靶核酸的核苷酸序列信息”指靶核酸的核苷酸序列和核苷酸序列中一个核苷酸的位置。“一个核苷酸的位置”指期需被检测的靶核酸中的一个核苷酸的位置。当设计含RNA探针以检测一组基因(其与靶核酸表现出高度同源性)中的特定基因时，用常规方法对该组中这些基因的核苷酸序列实施同源性分析，以在其保守区域或高度同源区域中找出在靶基因和其它基因之间表现出低度同源性或不同的核苷酸，藉此可将该核苷酸的位置设定为所述一个核苷酸的位置。当设计含RNA探针来检测SNP时，可通过以下方式来设计含RNA探针：用通过基因组分析等估计可能导致SNP的核苷酸作为上述一个核苷酸，或用在公开的数据库中描述的SNP的位置的核苷酸作为上述一个核苷酸。核苷酸序列不受特别限制，如果其为核酸序列，优选为DNA序列。另外，核苷酸序列中的所述核苷酸的位置可为一个或多于一个位置。在所述核苷酸多于一个位置的情况下，将多于一个位置的每个位置都用作设计用于检测靶核酸的含RNA探针的本发明方法中所述一个核苷酸的位置。此外，靶核酸的核苷酸序列信息可为任何核苷酸序列和核苷酸序列中一个核苷酸的位置，或从各种开放数据库中获得的核苷酸序列和核苷酸序列中一个核苷酸的位置。

基于靶核酸的核苷酸序列信息来产生满足下列条件的序列组：

(a)一个嘌呤核苷酸为RNA，其它的为DNA；

(b)衍生自待检测的靶核酸或其互补链的核苷酸序列具有7-14个核苷酸；

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置，或备选地位于距5’端3-5个核苷酸的位置；和

(d) Tm值在25-40℃范围之内；

在核苷酸位置多于一个位置的情况下，对于位于多于一个位置的每个核苷酸位置，产生序列组。

当产生上述序列组时，优选应用以下设置的另外条件：

(e)在条件(a)中，如果探针中存在与介于设定为RNA的嘌呤核苷酸至5’侧2个核苷酸(即共有3个核苷酸)范围的序列互补的序列，或存在与介于5’侧1个核苷酸至设定为RNA的嘌呤核苷酸的3’侧1个核苷酸(即共有3个核苷酸)范围内的序列互补的序列时，则将所述序列排除在序列组之外；和

(f)将包含具有四个或更多个核苷酸的互补部分的反向重复核苷酸序列(回文序列)的序列排除在序列组之外。

另外，当产生序列组时，优选根据以下设置的标准来排列探针，这取决于在上述条件中的条件(a)和(c)是否如以下条件组的任一个中所述。在如下所述的优先级1-6中，数值越小，意味着优先次序越高。如下所述的“靶核酸中的一个核苷酸”指靶核苷酸，在以下优先级中亦称作“所述一个核苷酸”。

1. 在靶核酸中的一个核苷酸为嘌呤核苷酸并且邻近所述一个核苷酸的3’和5’侧每一侧的核苷酸皆为嘌呤核苷酸的情况下：

优先级1：(a)所述一个核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级2：(a)邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级3：(a)所述一个核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

优先级4：(a)邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

2. 在靶核酸中的一个核苷酸为嘌呤核苷酸、邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为嘌呤核苷酸并且邻近所述一个核苷酸的5’侧的核苷酸为嘧啶核苷酸的情况下：

优先级1：(a)所述一个核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级2：(a)邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级3：(a)邻近互补链(反义链)中对应于所述一个核苷酸的核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级4：(a)所述一个核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

优先级5：(a)邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

优先级6：(a)邻近反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

3. 在靶核酸中的一个核苷酸为嘌呤核苷酸、邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为嘧啶核苷酸并且邻近所述一个核苷酸的5’侧的核苷酸为嘌呤核苷酸的情况下：

优先级1：(a)所述一个核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级2：(a)所述一个核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

4. 在靶核酸中的一个核苷酸为嘌呤核苷酸、邻近所述一个核苷酸的3’和5’侧的每一侧的核苷酸皆为嘧啶核苷酸的情况下：

优先级1：(a)所述一个核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级2：(a)邻近反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级3：(a)所述一个核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

优先级4：(a)邻近反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

5. 在靶核酸中的一个核苷酸为嘧啶核苷酸、邻近所述一个核苷酸的3’和5’侧每一侧的核苷酸皆为嘌呤核苷酸的情况下：

优先级1：(a)反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级2：(a)邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级3：(a)反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸的为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

优先级4：(a)邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

6. 在靶核酸中的一个核苷酸为嘧啶核苷酸、邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为嘌呤核苷酸并且邻近所述一个核苷酸的5’侧的核苷酸为嘧啶核苷酸的情况下：

优先级1：(a)反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级2：(a)邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级3：(a)邻近反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级4：(a)反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

优先级5：(a)邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

优先级6：(a)邻近反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

7. 在靶核酸中的一个核苷酸为嘧啶核苷酸、邻近所述一个核苷酸的3’侧的核苷酸为嘧啶核苷酸并且邻近所述一个核苷酸的5’侧的核苷酸为嘌呤核苷酸的情况下：

优先级1：(a)反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级2：(a)反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

8. 在靶核酸中的一个核苷酸为嘧啶核苷酸、邻近所述一个核苷酸的3’和5’侧每一侧的核苷酸皆为嘧啶核苷酸的情况下：

优先级1：(a)反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级2：(a)邻近反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距3’端3-5个核苷酸的位置。

优先级3：(a)反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

优先级4：(a)邻近反义链中对应于所述一个核苷酸的核苷酸的3’侧的核苷酸为RNA，其它的为DNA；和

(c) (a)中提出的RNA核苷酸位于距5’端3-5个核苷酸的位置。

亦包括在本申请中的是使用通过如上所述的设计方法获得的含RNA探针来检测靶核酸的方法。例如，通过已知的方法来合成经上述方法设计的具有高优先级的含RNA探针的序列。可让合成的含RNA探针与样品中的核酸进行杂交，接着用核糖核酸酶H处理来检查探针是否被核糖核酸酶H切割，藉此检测样品中的靶核酸。用于检查探针是否已被切割的程序不受特别限制，可使用用于核酸分析的已知程序。例如，可使用电泳或高效液相色谱法从其链长度的变化来检测探针的切割。特别优选的方面包括，例如，一个方面为用两种物质标记含RNA探针，所述两种物质为荧光物质和对由荧光物质发出的荧光具有淬灭作用的物质，其中这些物质在探针内的RNA核苷酸的每一侧的适当距离处放置。在探针完整的条件下，所述含RNA的探针几乎不发出荧光，但当探针被切割及荧光物质与淬灭物质之间的距离变大的时候则将产生荧光。设计所述含RNA探针使得可能通过观测反应时从反应溶液发出的荧光来检测靶核酸。已知有各种荧光剂和淬灭物质，其很多已可市购。在本发明中，可使用通过本发明设计的含RNA探针实施靶核酸检测，作为用于检测以下的方法：检测特定核苷酸或是否存在特定核苷酸，特别是检测由于导致单核苷酸取代所致的在靶核酸中出现的核苷酸的存在情况，或检测通常存在但在导致单核苷酸取代的情况下已被另一核苷酸取代的核苷酸的不存在情况。

基于上述设计用于检测靶核苷酸的含RNA探针的方法，本发明用于处理核苷酸序列的方法(亦称作核苷酸序列处理方法)包括：步骤(S1)，首先获得靶核酸的核苷酸序列信息；步骤(S2)，检查获得的核苷酸序列信息；和步骤(S3)，设计含RNA探针(图1)。设计所述探针的步骤(S3)包括序贯处理上述条件(a)-(d)的步骤。此外，优选包括处理上述条件(e)-(f)的步骤。

如将更详细阐述的那样，设计含RNA探针的步骤由以下组成：

对核苷酸进行判定的步骤，其中基于核苷酸序列信息判定选自以下的核苷酸是否为嘌呤核苷酸：核苷酸序列信息中的一个核苷酸、邻近所述一个核苷酸3’侧的核苷酸、互补链中对应于核苷酸序列信息中所述一个核苷酸的核苷酸和邻近互补链中的核苷酸3’侧的核苷酸；

产生核苷酸信息的步骤，其中将嘌呤核苷酸中的一个设定为RNA，将其它的设定为DNA；

产生部分核苷酸序列的步骤，其中将衍生自待检测的靶核酸或其互补链的核苷酸序列中的核苷酸数量设定为7-14，藉此产生关于部分核苷酸序列的信息；

选择核苷酸序列的步骤，其中基于关于部分核苷酸序列的信息，选择其中RNA核苷酸位于距3’端或5’端3-5个核苷酸的位置的核苷酸序列；

选择含特定核苷酸的序列的步骤，其中选择含特定核苷酸的序列，其中通过核苷酸序列选择步骤获得的核苷酸序列的Tm值在25-40℃范围之内。

获得靶核酸的核苷酸序列信息的步骤可包括基于获得的核苷酸序列信息从开放的公共数据库获得更多的详细信息的另外步骤。而且，检查获得的核苷酸序列信息的步骤可包括用从开放的公共数据库获得的信息来比较和检查获得的核苷酸序列信息的另外步骤。

另外，可增加步骤(S4)：设计能够扩增与通过本发明设计的含RNA探针杂交的靶核酸中区域的引物对(图2或3)。此外，亦可增加步骤(S5)：制作在上述步骤中提供的含RNA探针和针对各个探针设计的引物对的组的清单。用于在设计所述引物对的步骤中设计引物对的方法不受特别限制，并且可使用已知方法来设计所述引物对，使得可扩增与靶核酸中含RNA探针序列杂交的区域。所述引物对可为在核酸扩增中的已知方法例如PCR、ICAN和LAMP法中使用的任何一种。可将用由此设计的引物来对衍生自样品中靶核酸的DNA片段的扩增与用于检测靶核酸的本发明方法联合，以便在小量样品情况下高度灵敏地检测目的基因中特定核苷酸或单核苷酸取代的存在或不存在情况。

在本发明中，亦可将含RNA探针设计在DNA序列中，所述DNA序列用已经设计的引物对扩增，所述引物对可在用于核酸扩增的已知方法中使用。在这种情况下，可将所扩增的DNA序列中的一个核苷酸设定为本发明的“一个核苷酸”，藉此通过本发明方法来设计含RNA的探针，以便可使用该探针来以高灵敏度检测扩增的序列。

允许计算机执行本发明的核苷酸序列处理方法的程序可为能够实施上述核苷酸序列处理方法的步骤中的任何一个，包括用例如Ruby、Perl、Python、C、C++、Java?等等编写的程序。

在其上记录有程序的计算机可读取记录介质包括但不限于例如：光盘，例如压缩光盘(CD)、数字多功能光盘(DVD)、蓝光光盘(BD)等等；闪存、硬盘和其它。可使用计算机可读取的任何介质。

基于上述设计用于检测靶核苷酸的含RNA探针的方法，本发明用于处理核苷酸序列的装置(亦称作核苷酸序列处理装置)包括：用于首先获得待检测的靶核酸的核苷酸序列信息的组件，用于检查获得的核苷酸序列信息的组件和用于设计含RNA探针的组件。用于设计所述探针的组件包括用于序贯处理上述条件(a)-(d)的组件。此外，优选包括处理上述条件(e)-(f)的组件。

如将要更详细地阐述的那样，用于设计含RNA探针的组件由以下组成：

用于对核苷酸进行判定的组件，其中基于核苷酸序列信息判定以下核苷酸中的至少一种是否为嘌呤核苷酸：靶核酸的核苷酸序列中的一个核苷酸、邻近所述一个核苷酸3’侧的核苷酸、靶核酸的互补链核苷酸序列中对应于所述一个核苷酸的核苷酸和互补链核苷酸序列中邻近核苷酸3’侧的核苷酸；

用于产生核苷酸信息的组件，其中将嘌呤核苷酸中的一个设定为RNA，将其它的设定为DNA；

用于产生部分核苷酸序列的组件，其中将衍生自待检测的靶核酸或其互补链的核苷酸序列中的核苷酸数量设定为7-14，藉此产生关于部分核苷酸序列的信息；

用于选择核苷酸序列的组件，其中基于关于部分核苷酸序列的信息选择其中RNA核苷酸位于距3’端或5’端3-5个核苷酸的位置的核苷酸序列；

选择含特定核苷酸的序列的组件，其中选择含特定核苷酸的序列，其中通过核苷酸序列选择步骤获得的核苷酸序列的Tm值在25-40℃范围之内。

用于获得靶核酸的核苷酸序列信息的组件，可包括基于所获得的核苷酸序列信息从开放的公共数据库获得更多的详细信息的另外组件。而且，用于检查获得的核苷酸序列信息的组件，可包括用于将所获得的核苷酸序列信息与从开放的公共数据库获得的信息进行比较和检查的另外组件。另外，上述组件可包括用于评估所设计的含RNA探针与非靶核酸杂交的可能性的另外组件。

另外，可增加用于设计引物对的组件，所述引物对能够扩增与通过本发明设计的含RNA探针杂交的靶核酸中的区域。此外，亦可增加用于制作上述组件中提供的含RNA探针和针对各个探针设计的引物对的组的清单的组件。本文中所述引物可为可在用于核酸扩增的已知方法中使用的任何一种引物，所述方法例如PCR、ICAN和LAMP方法。可将用由此设计的引物来对衍生自样品中的靶核酸的DNA片段的扩增和用于检测靶核酸的本发明方法联合，以便高度灵敏地检测小量样品中的目的基因中特定核苷酸或单核苷酸取代的存在或不存在情况。

本发明用于处理核苷酸序列的装置可为以独立方式实施整个处理的装置，或用于处理核苷酸序列的系统，其中信息在核苷酸序列处理装置与客户端装置之间通信，所述客户端装置经由网络以能够与其通信的状态连接到核苷酸序列处理装置。例如，在前者中，可将本发明的程序记录或安装在处于能够执行该程序的状态的计算机硬盘上，藉此将计算机用作本发明的核苷酸序列处理装置。而且，可将本发明的程序记录或安装在处于能够执行该程序的状态的外部介质例如光盘或闪存上，并且可将外部介质连接到计算上，藉此配置可实施本发明的核苷酸序列处理的装置而不必将程序记录或安装在计算机硬盘上。例如，在后者中，可通过客户端装置将靶核酸的核苷酸序列信息传输到本发明的核苷酸序列处理装置，并且可经由PC通信或经由网络例如内联网或互联网通过客户端装置来接收通过核苷酸序列处理装置获得的以下信息：关于用于检测靶核酸的含RNA探针的信息和供设计引物对用的信息。或者，可根据客户端装置的要求来选择和接收这些信息碎片。该系统使得人们可使用本发明的核苷酸序列处理装置，而不管该装置位于何处等类似情况，因此可为有用的。另外，明显的是，为了使核苷酸序列处理装置通过客户端装置而可容易地利用，将系统配置以便信息可通过Web屏幕来传输和接收。

可将本发明设计的含RNA探针和核糖核酸酶H加入到扩增核酸的反应溶液中，这使得可能在单一反应中实行靶核酸的扩增和检测。本发明设计的含RNA探针特别适于检测系统，其中通过PCR扩增靶核酸片段的反应和用热稳定的核糖核酸酶H切割探针的反应同时进行。在这一方面，标记含RNA探针使得通过上述对探针的切割而产生的信号(例如荧光)是合适的，并且所述探针可用于构建供快速检测靶核酸或单核苷酸取代的系统，所述系统与装备有信号检测系统的核酸扩增装置联合在一起。

根据本发明，可制造可用于检测靶核酸或靶核酸中的SNP的含RNA探针，亦提供可与探针联合的用于扩增靶核酸片段的引物对。如上所述的含RNA探针和引物可为用于以良好灵敏度检测靶核酸或SNP的试剂或试剂盒的组分。因此，根据本发明，亦提供用于检测靶核酸或单核苷酸取代的灵敏系统。

将基于图19-32阐述本发明的具体实施方案。

图19表示用于处理本发明的核苷酸序列的装置10。核苷酸序列处理装置10包含：

(a)计算机CPU (中央处理器) 20，其用于计算和控制核苷酸序列处理装置10的操作和处理；

(b)ROM (只读存储器) 21，其用于存储基本计算机程序例如操作系统和运行程序必需的数据；

(c)RAM (随机存储器) 22，其用作CPU 20和暂时存储参数以及图像处理中必需的数据的工作存储器；

(d)数据存储器23，将其配置例如作为硬盘存储器并用于存储图20中所示的各种数据；

(e)程序存储器24，将其配置例如作为硬盘存储器并用于存储图21-25中所示处理用的程序，其用CD-ROM驱动装置45读取；

(f)通信接口36，其与通信终端装置46连接，并用于经由互联网50使基因数据库数据传输到基因数据库服务器单元60并自基因数据库服务器单元60接受基因数据库数据；

(g)连接到键盘41的键盘接口31，用所述键盘输入给定数据和指令命令，并且键盘接口31用于接收通过键盘41输入的数据和指令命令，用于实施接口处理，例如规定的信号转换，并将它们转移至CPU 20；

(h)连接到鼠标42的鼠标接口32，用所述鼠标42在CRT显示器43上输入指令命令，并且鼠标接口32用于接收通过鼠标42输入的数据和指令命令，用于实施接口处理，例如规定的信号转换，并将它们转移至CPU 20；

(i)连接到CRT显示器43的显示器接口33，所述显示器43显示通过CPU 20处理的输出数据、设置和指示屏幕以及其它等等，并且显示器接口33用于将待显示的图像数据转换成CRT显示器43的图像信号，并在CRT显示器43上输出和显示图像信号；

(j)连接到打印机44的打印机接口34，所述打印机44打印通过CPU 20处理的输出数据以及其它等等，并且打印机接口34用于执行待打印的打印数据的规定的信号转换等等，并将数据输出到打印机44上以将其打印；和

(k)连接到CD-ROM驱动装置45的驱动装置接口35，所述CD-ROM驱动装置45读出来自CD-ROM 45a(在其上记录有程序)的用于上述处理的程序的程序数据，并且驱动装置接口35用于执行规定的信号转换，并将读出的图像处理程序等等的程序数据转移到程序存储器24；

其中经由总线30连接这些电路20-24和31-36。

图20表示显示图19中所示的数据存储器23的内部结构的框图。如图20所示，数据存储器23存储以下表格：

(1)用于产生互补核苷酸序列的参考表71；

(2)用于判定RNA位置的参考表72；

(3)用于对嘌呤核苷酸进行判定的参考表73；

(4)用于判定优先级的参考表74-76；

(5)用于对是否25℃ ≤ Tm值 ≤ 40℃作判定的参考表77；和

(6)关于部分核苷酸序列和引物序列的输出信息的表78。

在图27-32中显示了表71-78。

图19中所示的装置执行图21的流程图中指出的处理步骤。图21的ST1为输入靶核酸的核苷酸序列和阐述靶核酸的信息的处理步骤。待输入的串为串K (数字x、串J、符号i) (见图26中所示的表70)。串J为由A、T、G或C的任何字母组成的一维串。串J对应于靶核酸的核苷酸序列。串J的左侧代表核苷酸序列的5’侧，右侧代表核苷酸序列的3’侧。数字x为自然数字。数字x代表靶核苷酸。位于自串J左端第x个位置的字母代表靶核苷酸。符号i表明串K为已经输入的核苷酸序列。符号i用于区分由来自ST2中产生的核苷酸序列的串K代表的核苷酸序列。

ST2是产生靶核酸的互补核苷酸序列的处理步骤。ST2产生串M (数字x、串L、符号c) (见图26中所示的表70)。数字x与串K中的数字x相同。基于图27中的表71从串J产生串L。构成串L的每一个字母具有图27中的表71指出的对应关系，且通过从右到右阅读串J和从左到右重排阅读串J来获得构成串的字母中的每一个。符号c表明串L是互补核苷酸序列。

ST3是判定RNA位置和优先次序的处理步骤。根据图22中所示的流程图来执行ST3。图22中所示的流程图由进行判定的处理步骤ST11-ST17和产生信息的处理步骤ST18-ST25组成。

根据图29中的表73来实施用于进行判定的处理步骤ST11-ST17。在ST11中，当串J左侧的第x位字母为A或G时，则作出判定是(Yes)。另一方面，当串J中相同位置的字母为T或C时，则作出判定否(No)。在ST12和ST13中，对于串J左侧的第(x+1)位的字母，作出相似的判定。在ST14-ST17中，对于串J左侧的第(x-1)位的字母，作出相似的判定。

依赖于ST11-ST17的判定结果，执行处理步骤ST18-ST25。在处理步骤ST18-ST25中，产生由三个字母(符号i或c、数字y、符号z)组成的串N (见图26所示的表70)。具体地，依赖于ST18-ST25中的处理h1-h8，分别产生图28的表72中标明的串N。

符号i或c(其是自串N左边的第一个字母)，是表明RNA位置所处核苷酸序列的符号。符号i表明RNA位置位于ST1中已经输入的核苷酸序列。符号c表明RNA位置位于ST2中已经产生的核苷酸序列。

数字y(其是自串N左边的第二个字母)，是数字x或(x+1)并且是用于鉴定RNA位置的数字。数字y表明从左端的第y位为RNA位置。

符号z(其是自串N左边的第三个字母)，选自α、β和γ。符号z是表明优先次序的字母。字母α表明优先级的最高级，接下来是降序的β和γ。在数据存储器23中暂时存储所产生的串N。

ST4是产生阐述具有7-14个核苷酸的部分核苷酸序列的信息的处理步骤，其中距末端3-5个核苷酸的位置为RNA位置。根据图23所示的流程图来进行该处理。

图23中所示的流程图由处理步骤ST31、ST32和ST33组成。

处理步骤ST31是产生阐述部分核苷酸序列的信息的处理步骤，其中距5’端3-5个核苷酸的位置为RNA位置。根据图24所示的流程图来执行处理步骤ST31。

图24所示的流程图中的ST41是读出串K、串M和串N的处理步骤。

在ST42、ST43、ST45、ST46、ST47和ST48中，探针5’-末端位置、探针大小和RNA位置各自为自然数。RMA位置用串N中的数字y表示。将探针5’-末端位置定义为数字a，探针大小定义为数字b。

ST44是产生串P (串O、数字y、符号z、符号ST31)的处理步骤。在ST44中的产生处理中，首先参考自串N中左边的第一个字母，在ST42中提及的数字y由其衍生。当第一个符号为i时，读出字母，其介于串J中从左端第a个字母到第(a+b-1)个字母之间的范围。通过从左到右重排读出的字母的串所产生的串为串O。当自串N左边第一个字母为符号c时，用相似的方式来进行处理，不同之处在于用串L替代串J。串P中的数字y和符号z与已参考的串N中的数字y和符号z相同。串P中的符号ST31用于产生ST33(其在随后实施)中优先次序的处理步骤的目的。在数据存储器23中暂时存储所产生的串P。

图23所示的流程图中的处理步骤ST32是产生阐述部分核苷酸序列的信息的处理步骤，其中距3’端3-5个核苷酸的位置为RNA位置。根据图25所示的流程图来执行处理步骤ST32。除使用了代表探针3’末端位置的数字外，图25所示的流程图与图24所示的流程图相似。处理步骤ST32以类似于处理步骤ST31 (见图26中所示的表70)的方式来产生串Q (串O、数字y、符号z、符号ST32)。串Q中的符号ST32用于产生关于在其后实施的ST33中的优先次序的信息。

图23中所示的流程图中的处理步骤ST33是产生关于部分核苷酸序列的优先次序的信息的处理步骤。首先，通过ST31和ST32读出串P (串O、数字y、符号z、符号ST31)和串Q (串O、数字y、符号z、符号ST32)，其暂时储存在数据存储器23中。基于已读出的串P和串Q中的符号z和符号ST31或符号ST32，根据图30中的表74-76来确定符号r。因此，基于符号z是否为α、β或γ中的任何一个及符号是否为ST31或ST32，将图30中的表74-76中表明的数字1-6中的任何数字作为符号r产生。符号r为表明已产生的部分核苷酸序列的优先次序的符号。符号r为自然数1-6中的任何一个。本文中1意味着最高的优先次序，接下来按优先级降序是2、3、4、5和6。使用符号r和读出的串P和串Q来产生串R (串O、数字y、符号r) (见图26所示的表70)。将产生的串R暂时储存在数据存储器23中。

ST5是基于Tm值作出判定的处理步骤。对于数据存储器23中暂时储存的所有串R，计算其各自的Tm值。本文中在具有500 nM DNA浓度和50 mM盐浓度的条件下，使用最近毗邻法及进一步使用Biochemistry, 第36卷, No.34, 第10581-10594页(1997)中所述的方法来计算Tm值。使用计算出的Tm值，基于图31中的表77来作出判定。如果作出的判定为否，则删除暂时储存在数据存储器23中的相应串R。

ST6是这样的处理步骤，其中当相同的序列包括在由ST4产生的串中时，从数据存储器23中删除包含串O的串R。读出自串O左侧第(y - 2)位到第y位范围内的串和自串O左侧第(y - 1)位到第(y + 1)位范围内的串，并对串O中是否包括这些读出的串进行搜索。如果这些串包括在串O中，则从数据存储器23中删除包含该串O的串R。

ST7是这样的处理步骤，其中当串O包括4个字母或更多的反向重复核苷酸序列(回文序列)时，从数据存储器23中删除包含该串O的串R。按以下方法对所包括的回文序列进行判定：首先，将探针序列定义为seq，探针的链长定义为n。从5’端到3’端对核苷酸编号如0、1、2、……、(n-1)。在这些定义下实施如下所述的方法。因此，部分序列的开始位置i在第0位至第{(n-1) - (最小靶标大小 x 2 - 1)}位之间变化，从而产生部分序列各自的互补序列，其中部分序列的大小介于4 bp (其为最小靶标大小)至(n - i)/2 (将其四舍五入为最接近的整数)范围。如果所产生的互补序列与介于部分序列的开始位置第i至第(i +部分序列大小)位范围的序列相同，则判定其为回文序列。下面是将本方法表示为程序的实例。

如果通过上述判定作出是回文的判定，则从数据存储器23中删除包含该串O的串R。

ST8是提取部分核苷酸序列的处理步骤。从数据存储器23中读出所有储存在数据存储器23中且通过上述处理未删除的串R。在读出的串R中，提取一个或多个在表明优先次序的符号r中具有最小数字的串R。

ST9是设计引物序列的处理步骤。产生与在ST8中所选择的探针序列相容的引物。用于在设计所述引物对的步骤中设计引物对的方法不受特别限制，并且可使用已知的方法来设计所述引物对，其可扩增能与靶核酸中的含RNA探针的序列杂交的区域。

ST10是输出的处理步骤。在处理步骤ST10中，基于在ST8中提取的串R，在CRT显示器43上输出图32中所示的表78中的信息。输出串O，其中将从左端的第y位字母括入括弧()中。本文中括弧()表明括弧()中的字母位置代表RNA。

基于图21所示的流程图来阐述本发明包括的其它方面。

在ST1中，可使用图19所示的键盘41或鼠标42来输入串K。串K亦可如下输入：通过输入经由互联网50从基因数据库服务器单元60中所获得的。而且在ST1中，可输入阐述与靶核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的信息。因此，可在ST1中输入通过ST2产生的串M。在这种情况下，省略ST2。

在ST3中产生的串N中，符号z表明优先次序，可省略其产生。在ST4中，可省略图23所示的用于产生优先级的处理步骤ST33。亦可省略处理步骤ST6和ST7。

亦可省略用于设计引物的处理步骤ST9。在这种情况下，仅输出一种或多种探针序列。

在这种次序中，可不实施处理步骤ST5-ST7。可按需要改变这些处理步骤的次序。可与ST4同时实施处理步骤ST5-ST7中的一步或多步。在处理步骤ST5-ST7中，可采用使用无效标志(invalid flag)的方法，而不删除储存在数据存储器23的串R中的一些。在这种情况下，将ST8中的提取方法相应地变为已经修改的方法。

虽然可在处理步骤ST8之后实施处理步骤ST9，但有时可在处理步骤ST3-ST7的任何一步之后实施ST9。

如基于以上实施方案所具体阐述的，本发明的核苷酸序列处理方法的特征在于：所述方法包括：产生具有7-14个核苷酸的部分核苷酸序列的处理步骤，其中距3’或5’端3-5个核苷酸的位置为RNA位置；和对部分核苷酸序列的Tm值是否在25-40℃范围之内作出判定的处理步骤。

在更优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列处理方法包括对以下核苷酸是否为嘌呤核苷酸作出判定的步骤：靶核酸中的靶核苷酸、邻近靶核苷酸3’侧的核苷酸和邻近靶核苷酸5’侧的核苷酸。

另外，在更优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列处理方法包括确定选自以下的核苷酸位置为RNA位置的处理步骤：

靶核酸的核苷酸序列中的靶核苷酸；

邻近靶核酸的核苷酸序列中的靶核苷酸3’侧的核苷酸；

与核苷酸序列(其与靶核酸的核苷酸序列互补)中靶核苷酸互补的核苷酸；和

邻近与核苷酸序列(其与靶核酸的核苷酸序列互补)中的靶核苷酸互补的核苷酸3’侧的核苷酸。在又一更加优选的实施方案中，实施本发明的核苷酸序列处理方法以便基于上述对核苷酸是否为嘌呤核苷酸的判定结果来实施确定RNA位置的处理步骤。

在又一更加优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列处理方法中的靶核苷酸为其中可能导致单核苷酸取代的核苷酸。

在优选实施方案中，本发明的核苷酸序列处理方法包括按照基于RNA位置的优先级进行选择。在更优选的实施方案中，将基于RNA位置的优先级应用到以下核苷酸：从较高到较低的优先级，

靶核酸的核苷酸序列中的靶核苷酸；

邻近靶核酸的核苷酸序列中的靶核苷酸3’侧的核苷酸；和

邻近与核苷酸序列(其与靶核酸的核苷酸序列互补)中的靶核苷酸互补的核苷酸3’侧的核苷酸。另外，在更优选的实施方案中，将基于RNA位置的优先级应用到以下核苷酸：从较高到较低的优先级，

与核苷酸序列(其与靶核酸的核苷酸序列互补)中靶核苷酸互补的核苷酸；

邻近靶核酸的核苷酸序列中的靶核苷酸3’侧的核苷酸；和

邻近与核苷酸序列(其与靶核酸的核苷酸序列互补)中的靶核苷酸互补的核苷酸3’侧的核苷酸。

在优选实施方案中，本发明的核苷酸序列处理方法包括按照基于每一端和RNA位置之间的相对位置的优先级进行选择。在更优选的实施方案中，将基于每一端和RNA位置之间的相对位置的优先级以从较高到较低的优先级应用到距3’端3-5个核苷酸的RNA位置和距5’端3-5个核苷酸的RNA位置。

在优选实施方案中，本发明的核苷酸序列处理方法包括对与包含RNA位置的核苷酸序列互补的序列是否存在于核苷酸序列中进行判定的处理步骤。在更优选的实施方案中，对其存在情况或不存在情况进行判定的序列是这样的序列：其与介于RNA位置至5’侧两个核苷酸范围的序列互补，或其与介于RNA位置5’侧一个核苷酸至3’侧一个核苷酸范围的序列互补。

在优选实施方案中，本发明的核苷酸序列处理方法包括对回文序列是否存在于核苷酸序列中作出判定的处理步骤。在更优选的实施方案中，待判定的回文序列具有四个核苷酸或更多。

在优选实施方案中，本发明的核苷酸序列处理方法包括基于关于所产生探针的部分核苷酸序列的信息对引物的核苷酸序列进行判定的处理步骤。

可使用用于执行本方法的程序和硬件来实施如上所述的本发明的核苷酸序列处理方法。本文中用于执行本方法的程序可为记录在计算机可读取的记录介质上的程序。亦可使用如上所述的用于执行核苷酸序列方法的处理装置来实施本发明的核苷酸序列处理方法。在优选实施方案中，本发明的处理装置具有用于实施本发明的核苷酸序列处理方法的组件，并且将在实施本发明的核苷酸序列处理方法中所参考的表储存在数据存储器中。然而，本发明的核苷酸序列处理方法不限于使用这些方法，亦包括例如通过手动操作处理核苷酸序列。

可在用于处理核苷酸序列的系统中实施如上所述的本发明的核苷酸序列处理方法，其中系统包含用于执行本发明的核苷酸序列处理方法的核苷酸序列处理装置；和以能够经由网络与之通信的状态与核苷酸序列处理装置连接的客户端装置。在优选实施方案中，客户端装置包含用于将靶核酸的核苷酸序列信息传输至核苷酸序列处理装置的组件，和用于获得靶核酸中关于用于检测靶核酸的含RNA探针的信息的组件，所述信息从核苷酸序列处理装置传输。在更优选的实施方案中，客户端装置包含用于获得靶核酸中的关于用于检测靶核酸的含RNA探针的信息和供扩增靶核酸用的引物的信息的组件，所述信息从核苷酸序列处理装置传输。

在不同的方面，本发明提供判定用于检测靶核苷酸的含RNA探针的核苷酸序列的方法，该方法包括本发明的核苷酸序列处理方法。

在不同的方面，本发明亦提供制造用于检测靶核苷酸的含RNA探针的方法，该方法包括本发明的核苷酸序列处理方法。在更优选的实施方案中，制造本发明的探针的方法包括制备含有RNA和DNA的核酸片段的步骤，所述核酸片段具有与由本发明的核苷酸序列处理方法判定的相同的核苷酸序列。

在不同的方面，本发明亦提供用于检测靶核苷酸的方法，该方法包括使用用于检测靶核苷酸的含RNA探针的步骤，其中通过本发明的制造方法来制造探针。在更优选的实施方案中，本发明的用于检测靶核苷酸的方法包括下列步骤：让用于检测靶核苷酸的含RNA探针与样品中的核酸杂交，其中通过本发明的制造方法来制造探针；用核糖核酸酶H对探针施用处理；和检测探针是否被核糖核酸酶H切割。

实施例

下面将通过实施例方式更加具体地阐述本发明，但并非意欲以任何方式将本发明仅限于以下实施例的范围。

实施例1

对因需要检测的靶核酸中一个核苷酸和用于检测靶核酸的探针中RNA核苷酸的位置差异而致的反应特异性差异进行检查。首先，作为靶核酸，将序列表中SEQ ID NO:1描述的序列用作模板1。然后，作为与模板1杂交的探针，即用于检测模板1的探针，在下述实验中设定和使用以下探针：

其中自5’端的第7个核苷酸(即自3’端的第6个核苷酸)为RNA的探针(下文中亦可称作探针中心(probe central)；SEQ ID NO:2)；

其中自5’端的第4个核苷酸(即自3’端的第9个核苷酸)为RNA的探针(下文中亦可称作探针5’-4聚体；SEQ ID NO:3)；

其中自5’端的第3个核苷酸(即自3’端的第10个核苷酸)为RNA的探针(下文中亦可称作探针5’-3聚体；SEQ ID NO:4)；

其中自3’端的第4个核苷酸(即自5’端的第9个核苷酸)为RNA的探针(下文中亦可称作探针3’-4聚体；SEQ ID NO:5)；和

其中自3’端的第3个核苷酸(即自5’端的第10个核苷酸)为RNA的探针(下文中亦可称作探针3’-3聚体；SEQ ID NO:6)。

(1)检查因探针中RNA核苷酸的位置差异而致的反应特异性差异：

将模板1中需要检测的一个核苷酸设置为自5’端的第10个核苷酸。将各自探针中对应于这一第10个核苷酸的核苷酸设定为RNA。为了检查因探针中RNA位置差异而致的特异性差异，设定了表1所示的各个探针的核苷酸序列中的三个核苷酸序列mrm和模板1的核苷酸序列中的三个核苷酸序列nnn，并且合成所有模板1和含RNA探针。在5’端用Eclipse并在3’端用FAM标记所合成探针中的每一个。对于表中的序列，括弧()表明括弧()中的核苷酸为RNA。

表1

然后，使用Cycleave PCR? Core试剂盒(Takara Bio Inc.制造)中除聚合酶外的试剂，用Thermal Cycler Dice?实时系统(Takara Bio Inc.制造)来实施循环探针反应，每一反应中使用1 μM模板1、0.3 μM 每种探针和0.004 U Tli RNase H II。反应条件为55℃，30秒；55℃，30秒的40个循环。为测量荧光值，测量反应开始的荧光值和最大荧光值。当荧光值达到最大时亦计数循环的次数。结果显示在表2中。对于表中的序列，括弧()表明括弧()中的核苷酸为RNA。表中的数值为以荧光值百分比(%)计算的值，其使用以下公式对错配的含RNA探针进行计算：[(最大荧光值-反应开始的荧光值)/最大荧光值时循环的次数]，其中当使用与模板1完全匹配的每一探针时，将公式的值设定为100%。将低于零的荧光值百分比表示为0。此外，在亦完全与含RNA探针匹配的情况下，未观测到荧光值的变化，因此不可进行计算，则将荧光值百分比表示为“-”。

表2

如表2所示，当使用探针中心时，甚至在序列nnn和mrm不互补的情况下，测量到相对高的荧光值百分比(%)，而当使用探针5’-4聚体、探针5’-3聚体、探针3’-4聚体和探针3’-3聚体时，在序列nnn和mrm不互补的情况下，仅测量到相对低的荧光值百分比(%)。从这些结果可推出，通过将探针中RNA的位置设定在自探针的5’端或3’端的第3个核苷酸和第4个核苷酸，比设定在探针的中央、自5’端第7个核苷酸或自3’端的第6个核苷酸，能够以更高的特异性和效率检测目的核苷酸。

(2)检查因需要检测的核苷酸和探针中对应所述核苷酸的RNA的位置差异而致的特异性差异：

为了检查将RNA位置设定在不是探针中对应于靶核酸中需要检测的一个核苷酸的核苷酸位置的情况下的特异性，实施下述实验。首先，将模板1中需要检测的一个核苷酸设定为自5’端的第11个核苷酸。设定表3所示的各个探针的核苷酸序列中的三个核苷酸序列mrm和模板1的核苷酸序列中的三个核苷酸序列nnn，以便在各个探针中将邻近对应于该第11个核苷酸的核苷酸的3’侧的核苷酸设定为RNA，并且合成所有模板1和含RNA探针。在5’端用Eclipse并在3’端用FAM标记所合成探针中的每一个。对于表中的序列，括弧()表明括弧()中的核苷酸为RNA。

表3

然后，在类似于实施例1-(1)的条件下实施循环探针反应。结果显示在表4中。对于表中的序列，括弧()中的核苷酸代表RNA。表中的数值代表使用类似表2中的计算方法计算的荧光值百分比。

表4

将模板1中需要检测的一个核苷酸设定为自5’端的第9个核苷酸。设定了表5所示的各个探针的核苷酸序列中的三个核苷酸序列mrm和模板1的核苷酸序列中的三个核苷酸序列nnn，以便在各个探针中将邻近对应于该第9个核苷酸的核苷酸的5’侧的核苷酸设定为RNA，并且合成所有模板1和含RNA探针。在5’端用Eclipse并在3’端用FAM标记所合成探针的每一个。对于表中的序列，括弧()表明括弧()中的核苷酸为RNA。

表5

然后，在类似于实施例1-(1)的条件下实施循环探针反应。结果显示在表6中。对于表中的序列，括弧()表明括弧()中的核苷酸为RNA。表中的数值代表使用类似表2中的计算方法计算的荧光值百分比。

表6

从表4和6的结果可以推出，如在将探针中对应于需要检测的一个核苷酸的各核苷酸设定为RNA的情况下，在将探针中邻近对应于需要检测的一个核苷酸的各核苷酸的3’端的核苷酸设定为RNA的情况下亦能够特异和高效地检测目的核苷酸。相比之下，可推断在将邻近5’侧的核苷酸设定为RNA的情况下导致特异性降低。

实施例2

对因用于检测靶核酸的含RNA探针的Tm值差异而致的反应特异性进行检查。首先，对于登记在NCBI (http://www.ncbi.nlm.gov/)中的SNP，rs5443、r6s1654416和rs1799821，设计了含有所述SNP之一和具有25-32℃或35-40℃任一Tm值的各探针。在rs5443情况下，如下设计探针：在基因组序列的正(义)链中设计探针，并且其中将邻近对应于基因组序列中SNP位置的核苷酸3’侧的核苷酸设定为RNA，位于自探针5’端的第3个核苷酸和第4个核苷酸；在基因组序列的反义链中设计探针，并且其中将对应于基因组序列的互补链中SNP位置的核苷酸设定为RNA，位于自探针3’端的第3个核苷酸(SEQ ID NOs:7和8)。在rs1654416情况下，如下设计探针：在基因组序列的反义链中设计探针，并且其中将对应于基因组序列的互补链中SNP位置的核苷酸设定为RNA，位于自探针3’端的第3个核苷酸(SEQ ID NOs:9-12)。在rs1799821情况下，如下设计探针：在基因组序列的有义链中设计探针，并且其中将对应于基因组序列中SNP位置的核苷酸设定为RNA，位于自探针5’端的第3个核苷酸(SEQ ID NO:13)和自探针3’端的第3个核苷酸(SEQ ID NO:14和15)。所设计探针的序列和Tm值及在含RNA探针合成中的荧光标记的类型显示在表7中。对于表中的序列，括弧()表明括弧()中的核苷酸为RNA。

表7

对于上述含RNA探针，设计引物对以便能够实施Cycleave PCR。对于从rs5443设计的含RNA探针的rs5443 C探针和rs5443 T探针，设计引物对rs5443 F引物和rs5443 R引物(SEQ ID NO:16和17)。对于rs5443 C探针2和rs5443 T探针2，设计引物对rs5443 F2引物和rs5443 R2引物(SEQ ID NO:18和19)。对于从rs1654416设计的含RNA探针，设计rs1654416 F引物和rs1654416 R引物(SEQ ID NO:20和21)。对于从rs1799821设计的含RNA探针，设计引物对rs1799821 F引物和rs1799821 R引物(SEQ ID NO:22和23)。

各自合成上述含RNA探针和引物，并且按照试剂盒说明书使用Cycleave PCR? Core试剂盒(Takara Bio Inc.制造)在Thermal Cycler Dice?实时系统(Takara Bio Inc.制造)中实施Cycleave PCR。如下所述制造模板DNA，每一反应中使用相当于10⁵个拷贝的量。首先，人工单独制备各自由引物扩增区域组成的序列，所述引物扩增区域包含每一探针的DNA序列。然后，用常用方法将每一制备好的人工合成序列插入到质粒载体T-载体pMD19 (简单型) (Takara Bio Inc.制造)中的Eco RV T-克隆位点，并且将插入后的载体用作模板DNA。在表8所列的含RNA探针和引物对的组合中实施反应，并且按照Thermal Cycler Dice?实时系统(Takara Bio Inc.制造)的使用说明来检测FAM和ROX信号。在表中，反应1、3和5代表设计的具有介于25-32℃范围内的Tm值的含RNA探针；反应2、4和6代表设计的具有介于35-40℃范围内的Tm值的含RNA探针。

表8

各反应的结果显示在图4-9中。在这些图中，上部分显示FAM信号的检测，下部分显示ROX信号的检测。各部分的垂直轴代表来自FAM和来自ROX的荧光值，水平轴代表循环次数。实线显示用野生型模板的结果，虚线显示用突变型模板的结果。在显示rs5443的检测结果的图4和5中，线条“野生型”代表基因组序列中SNP位置的核苷酸为C时的结果，线条“突变型”代表基因组序列中SNP位置的核苷酸为T时的结果。在显示rs1654416的检测结果的图6和7中，线条“野生型”代表基因组序列中SNP位置的核苷酸为T时的结果，线条“突变型”代表基因组序列中SNP位置的核苷酸为C时的结果。在显示rs1799821的检测结果的图8和9中，线条“野生型”代表基因组序列中SNP位置的核苷酸为G时的结果，线条“突变型”代表基因组序列中SNP位置的核苷酸为A时的结果。

这些结果证明，就用于在经设计具有25-32℃ Tm值的含RNA探针中检测野生型SNP的rs5443 SNP、rs5443 C探针的检测而言，导致仅检测出野生型SNP (图4中FAM，上部分)。用于检测突变型SNP的rs5443 T探针导致仅特异地检测出突变型SNP (图4中ROX，下部分)。用于在经设计具有35-40℃ Tm值的含RNA探针中检测野生型SNP的rs5443 C探针2导致检测出野生型SNP，并另外检测出带微弱信号的突变型SNP (图5中FAM，上部分)。用于检测突变型SNP的rs5443 T探针2导致检测出突变型SNP，并另外检测出带微弱信号的野生型SNP (图5中ROX，下部分)。用设计用于rs1654416的含RNA探针获得了类似的结果(图6和7)。用所有设计用于rs1799821的含RNA探针，每一探针导致特异地检测出野生型SNP或突变型SNP二者之一(图8和9)。从图4-9所示的结果可推出，设计具在25-40℃范围的Tm值的含RNA探针使得可特异检测SNP。

实施例3

对因用于检测靶核酸的含RNA探针的Tm值而致的反应特异性进行了进一步检查，对因加入到反应中的RNase H的量而致的特异性进行了检查。首先，设计了各含有实施例2中所述SNP (rs5443、rs1654416和rs1799821)之一和具有40℃或更高Tm值的探针。在rs5443的情况下，如下设计探针：在基因组序列的反义链中设计探针，并且其中将对应于基因组序列的互补链上SNP位置的核苷酸设定为RNA，位于自探针3’端的第4个核苷酸和第3个核苷酸(SEQ ID NO:24和25)。在rs1654416情况下，如下设计探针：在基因组序列的反义链中设计探针，并且其中将对应于基因组序列的互补链上SNP位置的核苷酸设定为RNA，位于自探针3’端的第4个核苷酸(SEQ ID NO:26)和自探针5’端的第4个核苷酸(SEQ ID NO:27)。在rs1799821情况下，如下设计探针：在基因组序列的反义链中设计探针，并且其中将邻近对应于基因组序列的互补链上SNP位置的核苷酸3’侧的核苷酸设定为RNA，位于自探针5’端的第3个核苷酸(SEQ ID NO:28)和自探针3’端的第4个核苷酸(SEQ ID NO:29)。所设计探针的序列和Tm值及在含RNA探针合成中的荧光标记类型显示在表9中。对于表中的序列，括弧()中的核苷酸代表RNA。

表9

对于上述含RNA探针，设计引物对以便能够实施Cycleave PCR。对于从rs5443设计的探针，设计引物对rs5443 F3引物和rs5443 R3引物(SEQ ID NO:30和31)。对于从rs1654416设计的含RNA探针，设计引物对rs1654416 F3引物和 rs1654416 R3引物(SEQ ID NO:32和33)。对于从rs1799821设计的含RNA探针，设计引物对rs1799821 F3引物和rs1799821 R3引物(SEQ ID NO:34和35)。

各自合成上述含RNA探针和引物，如实施例2实施Cycleave PCR。在这些反应中，使用试剂盒提供的缓冲液来制备试剂盒提供的Tli RNase H II，以便加入到反应中的Tli RNase H II的量为100 U (其为通常加入的量)、10 U和5 U，其用于各自的探针。

rs5443的结果显示在图10 (当加入的Tli RNase H的量为100 U)、图11 (当加入的Tli RNase H的量为10 U)和图12 (当加入的Tli RNase H的量为5 U)中。rs1654416的结果显示在图13 (当加入的Tli RNase H的量为100 U)、图14 (当加入的Tli RNase H的量为10 U)和图15 (当加入的Tli RNase H的量为5 U)中。rs1799821的结果显示在图16 (当加入的Tli RNase H的量为100 U)、图17 (当加入的Tli RNase H的量为10 U)和图18 (当加入的Tli RNase H的量为5 U)中。在这些图中，上部分显示FAM信号的检测，下部分显示ROX信号的检测。各部分的垂直轴代表来自FAM和来自ROX的荧光值，水平轴代表循环的次数。实线显示用野生型模板的结果，虚线显示用突变型模板的结果。

这些结果证明，在加入通常量的Tli RNase H (100 U)下，对于设计具有40℃或更高Tm值的用于检测靶核酸的含RNA探针中的任一种，用于仅特异地检测野生型的各FAM标记的探针亦导致检测突变型。此外，用于仅特异地检测突变型的各ROX标记的探针亦导致检测野生型。从而可推出，设计具有40℃或更高Tm值的用于检测靶核酸的含RNA探针不能够进行特异性检测。

使用设计具有40℃或更高Tm值的用于检测靶核酸的含RNA探针对因加入的RNase H的量而致的特异性进行检查，检查结果可推出，发现通过降低加入的Tli RNase H的量至5 U，rs1799821 G探针3提高了特异性，而其它探针的特异性往往有一定程度的提高，但扩增曲线表现出较不陡的形状，Ct值延迟，因此，这些探针降低了反应性。从这可证明，当使用设计具有40℃或更高Tm值的用于检测靶核酸的含RNA探针时，大多数探针不能够进行特异性检测。

工业适用性

根据本发明，提供了设计用于检测靶核苷酸的含RNA探针的方法，在没有研究者的经验或感觉的基础下，所述方法能够简单有效地检测靶核酸。亦提供用于处理核苷酸序列的方法和装置，这使得以下成为可能：甚至由具有很少或没有本领域经验的研究者都可容易地设计用于检测靶核苷酸的含RNA探针，因此这不仅在遗传工程领域，而且在医学研究领域中极为有用。

字母或数字的解释

ST1：输入靶核苷酸的核苷酸序列和阐述靶核苷酸的信息的处理步骤

ST2：产生靶核酸的互补核苷酸序列的处理步骤

ST3：确定RNA位置和优先级次序的处理步骤

ST4：产生阐述部分核苷酸序列的信息的处理步骤

ST5：基于Tm值作出判定的处理步骤

ST6：从数据存储器23中删除串R的处理步骤

ST7：从数据存储器23中删除串R的处理步骤

ST8：提取部分核苷酸序列的处理步骤

ST9：设计引物序列的处理步骤

ST10：输出的处理步骤

ST11-ST17：判定的处理步骤

ST18-ST25：产生信息的处理步骤

ST31：产生阐述部分核苷酸序列的信息的处理步骤

ST32：产生阐述部分核苷酸序列的信息的处理步骤

ST33：产生关于部分核苷酸序列的优先级次序的信息的处理步骤

ST41：读出串K、M和N的处理步骤

ST44：产生串P (串O、数字y、符号z、符号ST31)的处理步骤

10：用于处理核苷酸序列的装置

20：CPU

21：ROM

22：RAM

23：数据存储器

24：程序存储器

41：键盘

42：鼠标

43：CRT显示器

45：CD-ROM驱动装置

45a：CD-ROM

50：互联网

60：基因数据库服务器单元

70：概述在ST1-ST4中输入或产生的数据形式的表

71：产生互补核苷酸序列的参考表

72：确定RNA位置的参考表

73：对嘌呤核苷酸进行判定的参考表

74：确定优先级次序的参考表

75：确定优先级次序的参考表

76：确定优先级次序的参考表

77：对是否25℃ ≤ Tm值 ≤ 40℃进行判定的参考表

78：关于部分核苷酸序列和引物序列的输出信息的表

序列表自由文本

SEQ ID NO:1；靶核酸模板1。

SEQ ID NO:2；检测模板1的嵌合寡核苷酸探针中心。自5’端的第7个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:3；检测模板1的嵌合寡核苷酸探针5'-4聚体。自5’端的第4个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:4；检测模板1的嵌合寡核苷酸探针5'-3聚体。自5’端的第3个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:5；检测模板1的嵌合寡核苷酸探针3'-4聚体。自3’端的第4个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:6；检测模板1的嵌合寡核苷酸探针3'-3聚体。自3’端的第3个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:7；检测rs5443的SNP的嵌合寡核苷酸rs5443 C探针2。自3’端的第三个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:8；检测rs5443的SNP的嵌合寡核苷酸rs5443 T探针。自3’端的第三个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:9；检测rs1654416的SNP的嵌合寡核苷酸rs1654416 C探针。自3’端的第三个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:10；检测rs1654416的SNP的嵌合寡核苷酸rs1654416 T探针。自3’端的第三个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:11；检测rs1654416的SNP的嵌合寡核苷酸rs1654416 C探针2。自3’端的第三个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:12；检测rs1654416的SNP的嵌合寡核苷酸rs1654416 T探针2。自3’端的第三个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:13；检测rs1799821的SNP的嵌合寡核苷酸rs1799821 A探针。自5’端的第三个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:14；检测rs1799821的SNP的嵌合寡核苷酸rs1799821 A探针2。自3’端的第三个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:15；检测rs1799821的SNP的嵌合寡核苷酸rs1799821 G探针2。自3’端的第三个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:16；扩增包括rs5443 C探针或rs5443 T探针在内的DNA区域的rs5443 F引物。

SEQ ID NO:17；扩增包括rs5443 C探针或rs5443 T探针在内的DNA区域的rs5443 R引物。

SEQ ID NO:18；扩增包括rs5443 C探针2或rs5443 T探针2在内的DNA区域的rs5443 F2引物。

SEQ ID NO:19；扩增包括rs5443 C探针2或rs5443 T探针2在内的DNA区域的rs5443 R2引物。

SEQ ID NO:20；扩增包括rs1654416 C探针、rs1654416 T探针、rs1654416 C探针2或rs1654416 T探针2在内的DNA区域的rs1654416 F引物。

SEQ ID NO:21；扩增包括rs1654416 C探针、rs1654416 T探针、rs1654416 C探针2或rs1654416 T探针2在内的DNA区域的rs1654416 R引物。

SEQ ID NO:22；扩增包括rs1799821 A探针、rs1799821 G探针、rs1799821 A探针2或rs1799821 G探针2在内的DNA区域的rs1799821 F引物。

SEQ ID NO:23；扩增包括rs1799821 A探针、rs1799821 G探针、rs1799821 A探针2或rs1799821 G探针2在内的DNA区域的rs1799821 R引物。

SEQ ID NO:24；检测rs5443的SNP的嵌合寡核苷酸rs5443 C探针3。自3’端的第4个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:25；检测rs5443的SNP的嵌合寡核苷酸rs5443 T探针3。自3’端的第3个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:26；检测rs1654416的SNP的嵌合寡核苷酸rs1654416 C探针3。自3’端的第4个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:27；检测rs1654416的SNP的嵌合寡核苷酸rs1654416 T探针3。自5’端的第4个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:28；检测rs1799821的SNP的嵌合寡核苷酸rs1799821 A探针3。自5’端的第3个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:29；检测rs1799821的SNP的嵌合寡核苷酸rs1799821 G探针3。自3’端的第4个核苷酸为RNA。

SEQ ID NO:30；扩增包括rs5443 C探针3或rs5443 T探针3在内的DNA区域的rs5443 F3引物。

SEQ ID NO:31；扩增包括rs5443 C探针3或rs5443 T探针3在内的DNA区域的rs5443 R3引物。

SEQ ID NO:32；扩增包括rs1654416 C探针3或rs1654416 T探针3在内的DNA区域的rs1654416 F3引物。

SEQ ID NO:33；扩增包括rs1654416 C探针3或rs1654416 T探针3在内的DNA区域的rs1654416 R3引物。

SEQ ID NO:34；扩增包括rs1799821 A探针3或rs1799821 G探针3在内的DNA区域的rs1799821 F3引物。

SEQ ID NO:35；扩增包括rs1799821 A探针3或rs1799821 G探针3在内的DNA区域的rs1799821 R3引物。

Claims (13)

1. 用于处理核苷酸序列信息的方法，其通过用于处理所述核苷酸序列信息的装置来实施，所述方法包括以下步骤：

将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中，藉此输出包含所述输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，所述待输入的核苷酸序列包含所述靶核苷酸、邻近所述靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近所述靶核苷酸3’侧的核苷酸；

产生包含所述靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，其与包含所述靶核苷酸位置信息的所述待输出的核苷酸序列互补；

产生核苷酸序列及其互补核苷酸序列，其通过将核苷酸序列中的所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的核苷酸变换为RNA来获得，在所述核苷酸序列中包含所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息；和

自通过所述RNA核苷酸变换获得的核苷酸序列及其互补核苷酸序列产生部分核苷酸序列，其包含所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息，

其中

(d)所述部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)所述部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)所述核苷酸序列中的靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置。

2. 用于处理核苷酸序列信息的方法，其通过用于处理所述核苷酸序列信息的装置来实施，所述方法包括以下步骤：

将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中，藉此输出包含所述输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，所述待输入的核苷酸序列包含所述靶核苷酸、邻近所述靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近所述靶核苷酸3’侧的核苷酸；

产生包含所述靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，其与包含所述靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

自所述输出的核苷酸序列及所产生的互补核苷酸序列产生部分核苷酸序列，其包含所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息，

其中

(d)所述部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)所述部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)所述核苷酸序列中所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的核苷酸位于距所述3’或5’端3-5个核苷酸的位置；和

产生部分核苷酸序列，其通过将所述核苷酸序列中的所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的核苷酸变换为RNA来获得，在所述部分核苷酸序列中包含所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息。

3. 用于处理核苷酸序列信息的方法，其通过用于处理所述核苷酸序列信息的装置来实施，所述方法包括以下步骤：

将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中，藉此输出包含所述输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，所述待输入的核苷酸序列包含所述靶核苷酸、邻近所述靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近所述靶核苷酸3’侧的核苷酸；

产生包含所述靶核苷酸位置信息的核苷酸序列，其与包含所述靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

对于所输出的核苷酸序列和所产生的互补核苷酸序列进行下列判定中的至少一项判定：

(a)判定所述靶核苷酸是否为嘌呤核苷酸，

(b)判定邻近所述靶核苷酸3’侧的核苷酸是否为嘌呤核苷酸，和

(c)判定邻近所述靶核苷酸5’侧的核苷酸是否为嘌呤核苷酸，

藉此从所输出的核苷酸序列和所产生的互补核苷酸序列中将为嘌呤核苷酸的一个核苷酸确定为RNA位置，藉此输出包含所述RNA位置信息的核苷酸序列；

从包含RNA位置信息的待输出的核苷酸序列中产生包含RNA位置信息的部分核苷酸序列，

其中

(d)所述部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)所述部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)所述表明为RNA位置的一个核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置；和

产生部分核苷酸序列，其通过将确定为RNA位置的所述核苷酸变换为RNA来获得，在所述核苷酸序列中包含RNA位置信息，或在所述部分核苷酸序列中包含RNA位置信息。

4. 权利要求3的用于处理核苷酸序列信息的方法，其中输出包含RNA位置信息的核苷酸序列的步骤包括：基于所述靶核苷酸和所确定的RNA位置之间的相对位置，自通过所述RNA核苷酸变换获得的所产生的部分核苷酸序列，确定用于选择作为用于检测靶核苷酸的含RNA探针优良的部分核苷酸序列的优先级；并输出包含所确定优先级的核苷酸序列或部分核苷酸序列。

5. 通过计算机实施的程序，其包含权利要求1-4中任一项的用于处理核苷酸序列信息的方法的步骤。

6. 计算机可读取的记录介质，其特征在于所述介质储存权利要求5的程序。

7. 用于处理核苷酸序列信息的装置，其包含：

用于将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中藉此输出包含输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述待输入的核苷酸序列包含所述靶核苷酸、邻近所述靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近所述靶核苷酸3’侧的核苷酸；

用于产生包含所述靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述核苷酸序列与包含所述靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

用于产生核苷酸序列及其互补核苷酸序列的组件，所述核苷酸序列通过将核苷酸序列中的所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的核苷酸变换为RNA来获得，在所述核苷酸序列中包含所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息；和

用于自所述核苷酸序列及其互补核苷酸序列产生部分核苷酸序列的组件，所述部分核苷酸序列包含所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息，所述核苷酸序列通过所述RNA核苷酸变换获得，

其中

(d)所述部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)所述部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)所述核苷酸序列中的所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置。

8. 用于处理核苷酸序列信息的装置，其包含：

用于将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中藉此输出包含所输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述待输入的核苷酸序列包含所述靶核苷酸、邻近所述靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近所述靶核苷酸3’侧的核苷酸；

用于产生包含所述靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述核苷酸序列与包含所述靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

用于自所输出的核苷酸序列和所产生的互补核苷酸序列产生部分核苷酸序列的组件，所述部分核苷酸序列包含所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息，

其中

(d)所述部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)所述部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)所述核苷酸序列中靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸位于距3’或5’端3-5个核苷酸的位置；和

用于产生部分核苷酸序列的组件，所述部分核苷酸序列通过将所述核苷酸序列中的靶核苷酸或邻近靶核苷酸的核苷酸变换为RNA来获得，在所述部分核苷酸序列中包含所述靶核苷酸或邻近所述靶核苷酸的每个核苷酸的位置信息。

9. 用于处理核苷酸序列信息的装置，其包含：

用于将靶核苷酸的位置信息输入待输入的核苷酸序列中藉此输出包含所输入的靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述待输入的核苷酸序列包含所述靶核苷酸、邻近所述靶核苷酸5’侧的核苷酸和邻近所述靶核苷酸3’侧的核苷酸；

用于产生包含所述靶核苷酸位置信息的核苷酸序列的组件，所述核苷酸序列与包含所述靶核苷酸位置信息的待输出的核苷酸序列互补；

用于对所输出的核苷酸序列和所产生的互补核苷酸序列进行下列判定中的至少一项判定的组件：

(a)判定所述靶核苷酸是否为嘌呤核苷酸，

(b)判定邻近所述靶核苷酸3’侧的核苷酸是否为嘌呤核苷酸，和

(c)判定邻近所述靶核苷酸5’侧的核苷酸是否为嘌呤核苷酸，

其中从所输出的核苷酸序列和所产生的互补核苷酸序列中将为嘌呤核苷酸的一个核苷酸确定为RNA位置，藉此输出包含RNA位置信息的核苷酸序列；

用于从包含RNA位置信息的输出的核苷酸序列中产生包含RNA位置信息的部分核苷酸序列的组件，其中

(d)所述部分核苷酸序列中的核苷酸数量为7-14，

(e)所述部分核苷酸序列的Tm值为25-40℃，和

(f)所述表明为RNA位置的一个核苷酸位于距所述3’或5’端3-5个核苷酸的位置；和

用于产生部分核苷酸序列的组件，所述部分核苷酸序列通过将确定为RNA位置的核苷酸变换为RNA来获得，在所述核苷酸序列中包含RNA位置信息，或在所述部分核苷酸序列中包含RNA位置信息。

10. 权利要求9的用于处理核苷酸序列信息的装置，其中所述用于输出包含所述RNA位置信息的核苷酸序列的组件包含：基于所述靶核苷酸和所确定的RNA位置之间的相对位置，自通过所述RNA核苷酸变换获得的所产生的部分核苷酸序列，确定用于选择作为用于检测靶核苷酸的含RNA探针优良的部分核苷酸序列的优先级；和输出包含所确定优先级的核苷酸序列或部分核苷酸序列。

11. 用于处理核苷酸序列信息的系统，其包含经由网络连接的权利要求7-10中任一项的用于处理核苷酸序列信息的装置和客户端装置，其中

所述客户端装置包含：用于经由网络将包含所输入的核苷酸序列的信息传输至用于处理所述核苷酸序列信息的装置的传输组件，和

用于处理核苷酸序列信息的装置包含：用于基于包含所述核苷酸序列的传输信息，产生和输出通过所述RNA核苷酸变换获得的所产生的部分核苷酸序列的组件。

12. 用于制造用于检测靶核苷酸的含RNA探针的方法，所述方法包括制备与部分核苷酸序列具有相同序列的含RNA和DNA的核酸片段的步骤，所述部分核苷酸序列通过所述RNA核苷酸变换来获得，其通过权利要求1-4的用于处理核苷酸序列信息的方法来产生。

13. 用于检测靶核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：让通过权利要求12的方法制造的用于检测靶核苷酸的含RNA探针与样品中的核酸杂交；杂交步骤之后，将核糖核酸酶H处理施用至用于检测靶核苷酸的含RNA探针；和检测所述用于检测靶核苷酸的含RNA探针是否被所述核糖核酸酶H切割。

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