CN103026208B - 用于大肠杆菌的快速检测的传感器及其制造方法 - Google Patents

用于大肠杆菌的快速检测的传感器及其制造方法 Download PDF

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Abstract

制造生物芯片传感器的方法，包括提供前体；在基板上沉积前体，以形成涂层；和利用能量源，进行涂层的迅速融化/淬火处理，以便形成对大肠杆菌细菌的快速的化学发光响应具有增强的反射率的微米/纳米纹理表面。

Description

用于大肠杆菌的快速检测的传感器及其制造方法
相关申请的交叉参考
本申请要求在2010年7月22日提交的美国临时专利申请号61/366,638和在2011年7月21日提交的美国专利申请序列号13/187,587的权益。两个申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及大肠杆菌(E–Coli)细菌的检测，和更具体地，涉及用于迅速的化学发光响应的微米/纳米等级纹理的传感器。
背景技术
本章节提供与本公开相关的背景信息，其不一定是现有技术。
在不同类型的食物、水和其他可食用的污染物之中，细菌污染更常见。细菌的生存和生长总是取决于所提供的适当的周围温度、大气条件、湿气和营养素。
大肠杆菌是食物产品如花生酱和菠菜等中非常常见的细菌，并且大肠杆菌的食用可导致不同类型的健康疾病，例如痢疾。
通过常见的标准生物化学检验程序检测大肠杆菌需要较长的时间(例如，8至48小时)[参考文献1]。
能可靠地检测食物、水和其他介质中的大肠杆菌的快速的传感器将在短时间内避免很多健康危害。
检测大肠杆菌细菌的简单而迅速的方法是通过酶促化学发光程序。例如，由大肠杆菌释放的、作为它的新陈代谢过程的部分的酶β-半乳糖苷酶可以是非常有用的生物标记。
适于β-半乳糖苷酶的化学发光底物是苯基半乳糖-取代的二氧杂环丁烷(dioxetane)[参考文献2和3]。
Lumi530，4-甲氧基-4-(3-b-D-半乳糖苷苯基)螺旋[1,2-二氧杂环丁烷-3,2’-金刚烷]的商品制剂也可以是β-半乳糖苷酶活性的检测和量化的最佳替代物[参考文献4]。
酶β-半乳糖苷酶和二氧杂环丁烷底物之间的化学反应导致波长在530nm左右的光的发射，和如此发射的光可通过光检测器或光度计检测，从而确定大肠杆菌的存在。
采用上述讨论的生物标记和试验的生物传感器已经能够迅速检测大肠杆菌[参考文献2]。
这样的生物传感器的功效和响应时间高度地取决于传感器的表面纹理；期望具有高反射率的微米/纳米结构的表面。
最近几年中，已经在硅晶片的表面纹理上进行了很多研究。目的是在硅晶片的表面上生产微米/纳米结构，显著地增加表面积，和因而增强生理化学过程。
然而，当硅晶片的表面具有比发射光的波长小的亚波长结构时，可产生强的吸收作用。
参考图1，随着如图2中示例的孔深度增加，表面的反射率大大减少。因此，这些结构之间的深度、大小和间距的控制对于传感器的功效是至关重要的。
可在KOH或NaOH蚀刻剂中产生硅表面上的孔。尽管这样的碱性蚀刻技术是简单的和低成本的，然而它的缺点是费时、需要加热和产生极差的均匀性。为了硅表面上纹理结构的较好的均匀性，必需机械地搅拌蚀刻溶液。另外，在KOH或NaOH蚀刻剂中碱性金属离子的存在与细菌增殖是不相容的，并且可能对传感器的功效有害。
发明概述
本章节提供本公开的总体概述，并且不是它的全部的范围或它的所有的特征的全面的揭露。
公开了用于快速检测大肠杆菌细菌的微米/纳米等级纹理的传感器组装体。传感器组装体包括支撑基板和具有增强化学发光响应的几何特征的涂层。
此外，也公开了实现这种超细纹理的涂层的方法。该方法包括将适当的材料(例如，硅)利用沉积技术沉积在基板上，并且将其同时地/随后地处理以实现增强化学发光响应的期望拓扑学。
沉积技术可以是等离子体或相似的技术，并且可采用固态或气态前体材料。
表面纹理技术可采用激光、电子束、等离子体束或任何其他强热源。
如此制备的生物芯片利用“生物标记底物混合物(Biomarkersubstrate mixture)”功能化。生物标记底物混合物的实例是Lumi530和硫酸多粘菌素B(polymyxin-B-sulfate)溶液，在这个整篇文献中有时也可将其称为“底物混合物(Substrate Mixture)”。为了促进标记扩散到和吸收到传感器表面中，利用上述提及的“生物标记底物混合物”，在4-6℃的冷藏库中过夜，完成生物芯片的功能化。如此功能化的生物芯片备用于大肠杆菌的检测。
从本文提供的描述，进一步的适用性将变得显而易见。在这个概述中的描述和具体的实例仅仅意欲作为说明的目的，并不意图限制本公开的范围。
附图说明
本文描述的图形和图表仅仅是为了示例所选的实施方式，而不是所有可能的实施方式，并不意图限制本公开的范围。
图1是显示来自具有特定孔宽度和孔高度的图形化表面的光反射的微机械加工的基板或晶片或涂层的示例性说明；
图2是在可见光谱中显示来自具有渐增的孔深度的微机械加工的基板或晶片或涂层的反射率的示例性说明；
图3显示根据本公开的教导，采用DC等离子体喷射沉积和激光图案形成技术制备的Si传感器的实例；
图4是采用沉积和图案形成技术开发超细/纳米结构的传感器的制造方案的示例性说明；和
图5显示依照本公开的教导采用开发的Si传感器的样品，在大肠杆菌细菌和生物标记底物的存在下的示例性化学发光响应。
贯穿附图的几个视图，相应的参考数字表示相应的零件。
具体实施方式
本发明提供用于病原体如大肠杆菌的快速检测的方法和/或传感器。同样地，本发明具有传感器的应用。
本方法包括提供基板和将涂层沉积在基板上，涂层具有外表面。在将涂层沉积在基板上期间和/或之后，在其上产生纹理外表面，纹理外表面具有多个凸起和凹陷，以便产生通常高的表面积，并且多个凸起和/或多个凹陷之间具有标称间距，这使得预先确定的电磁辐射波长的内部散射最小化，因此使得预先确定的电磁辐射波长的反射最大化。在一些实例中，涂层可以是硅涂层和/或可将生物标记底物应用于涂层的纹理外表面。
例如和仅仅用于说明性的目的，在将含有每毫升107菌落形成单位(CFU/ml)浓度的大肠杆菌溶液放置到传感器上至少60秒之后，依照本发明制造的传感器可反射具有大约530纳米波长的至少4000相对发光单位(RLUs)的电磁辐射。在这样的实例中，含有二氧杂环丁烷的生物标记底物可导致与大肠杆菌的酶促反应，以便从反应产生具有大约530纳米波长的电磁辐射。
在一些实例中，在将含有107CFU/ml浓度的大肠杆菌溶液放置到传感器上至少60秒之后，传感器可反射具有大约530纳米波长的至少5000RLUs的电磁辐射，然而，在其他实例中，在相同的条件下，传感器反射至少6000RLUs。
在将含有107CFU/ml浓度的大肠杆菌溶液放置到传感器上至少120秒的情况下，传感器可反射至少6000RLUs，在其他实例中至少8000RLUs，和/或至少10000RLUs。应该理解，这样的发光计数可以比本领域的传感器的当前状态大两倍、三倍、和/或四倍。同样地，依照本发明，用于制造用于病原体的快速检测的传感器的方法在发光检测中提供预料不到的和显著的增加。
可利用技术，如电化学沉积、激光烧蚀、热喷射沉积、等离子体沉积、物理气相沉积、化学气相沉积和/或其组合，将涂层沉积到基板上。另外，可通过涂层外表面上多个分散位点的迅速融化和淬火产生纹理外表面。可利用热源如激光、电子束、等离子体等等，产生涂层外表面上多个分散位点的迅速融化和淬火。
现在将参考附图更加全面地描述非限制性的实施方式。
具体参考图1，对于入射光102落到具有特定孔宽度104和孔深度105的周期图形化结构的表面或晶片或涂层101上，适当反射光103代表图形化或纹理结构101的反射率行为。
如图2中显示的，在可见光谱201、202和203中的反射率行为分别受到涂层101的孔深度105显著地影响。当孔深度105增加同时保持细孔宽度104恒定时，由于孔内的光的内部散射和吸收，反射率大大减少。与平坦的表面201的反射率比较，来自图形化的表面202和203的反射率随着孔深度105的逐渐增加逐渐地减少。
依照本公开的教导，孔宽度104和孔深度105的适当结合可从纹理或图形化的表面产生高的反射率，同时提供快速化学发光响应所期望的大表面积。此外，依照当前的教导，可通过非化学的蚀刻工艺有效地加工这种期望的图形化表面。
在如图3中显示的本教导的一些实施方式中，Si生物芯片300包括圆柱型基板301，硅涂层302——采用等离子体喷射技术和硅粉末前体沉积，接着进行随后激光束辐射以产生具有期望特征的图形化表面。303是在扫描电子显微镜下观察的示例性图形化Si结构。
具体参考图4，当前的教导提供利用适当的前体制造传感器的制造方案，所述适当的前体通过附加工艺沉积，和同时地/随后通过能量束处理以产生期望的纹理表面。如图4中示意性地显示的，制造方案包括表面制备步骤，之后是沉积步骤和最后的表面图形化步骤。基板401用于采用附加工艺404沉积前体403以形成薄层402。随后采用能量束405，将薄层402纹理化406。
依照本教导的原理，附加工艺404可以是气相沉积或喷射沉积技术，包含，但不限于，DC等离子体、感应等离子体、电子束沉积、激光束沉积、化学气相沉积(CVD)和等离子体增强的CVD(PECVD)技术。同样地，前体材料403可以是固体、或液体或气体或它们的组合。
可对表面图形化步骤3提供以热源405，所述热源405能够逐层处理沉积的材料，其几乎与在基板上通过附加工艺404沉积所述层同时进行。能量来源可能是激光、等离子体、电子、辐射或对流热源。换句话说，利用本文提出的方法，可将从热源405输出的能量导向在基板上沉积的涂层。在这点上，可以简单并且同时的方式通过热源405立即修饰、特制或加工基板上每一个沉积的薄层。具体地，将热源405放置在附加设备404邻近或与附加的设备404整体形成，以将能量施加到正在被加工的基板上。在本教导的一些实施方式中，能量束可采取Gaussian能量分布或矩形能量分布。
表面图形化步骤包括表面层402的快速融化，接着迅速淬火从而产生图形化或纹理表面406，用于传感器应用的增强反射率和大表面积。
图5显示图形化Si结构303的示例性应用，用于在利用所述“生物标记混合物”或“底物混合物”进行虚拟工艺(fictionalization peocess)后，感测大肠杆菌细菌。以相对光单位测量的发射光光子(λ～530nm)的强度或计数作为时间的函数。开始的60秒是温育期，在这个期间测量不到光子计数。温育期为大肠杆菌释放β-半乳糖苷酶提供足够的时间，和因而促进在传感器表面上或在液体状态中的酶和生物标记底物混合物之间的化学反应，以便通过化学发光现象开始发射光子。曲线501代表在缺少大肠杆菌的情况下，来自功能化传感器的发光计数。曲线502代表在缺少传感器的情况下，来自“底物混合物和107CFU/ml大肠杆菌”的发光计数。曲线503指示当传感器和大肠杆菌以107CFU/ml浓度在“底物混合物”内相互作用时发射的光子强度。当由大肠杆菌释放的β半乳糖苷酶与“底物混合物”和/或功能化传感器表面起反应时，发生“底物混合物”和大肠杆菌之间的相互作用，和“传感器”和大肠杆菌之间的相互作用。基于这些曲线，与107CFU/ml相同浓度的大肠杆菌细菌的曲线503比较，曲线502发出较低的光子强度/计数。因此增强的传感器功效显示与只有“底物混合物”相比在温育期后即刻更快速的响应和快速的大肠杆菌细菌检测。
描述的方法、技术、类似物、设备、测量手段、数据、设计、几何学、图解、元件和传感器仅仅作为实例。呈现的详细内容仅仅作为实例被技术人员理解。因此，已经参考优选的实施方式描述了用于监视和检测大肠杆菌的方法、设备和设计及传感器。同样地，在不脱离本发明的范围下，本领域技术人员可随后理解或做出本文当前教导的无法预料的或不曾预料的改变或替换、修饰、改进和变化，其也意欲被所附权利要求所包含。
本文应用的术语仅仅用作描述具体的实例实施方式的目的，和不意欲是限制性的。如本文所用，除非上下文另外清楚的指示，单数形式“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”可倾向于包含复数形式。术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(including)”和“具有(having)”是包含的意思，因此详细说明所述特征、整数、步骤、操作、部件、和/或元件的存在，但是不排除一个或更多其他特征、整数、步骤、操作、部件、元件和/或其组的存在或添加。不能将本文描述的方法步骤、工艺、和操作解释为它们的执行一定需要以讨论的或示例的具体顺序，除非具体指定为显示顺序。也应该理解，可采用另外的或可替换的步骤。
当部分或层被称为在另一个部分或层“上”、“啮合到”、“连接到”或“耦合到”另一个部分或层，其可直接地在另一个部分或层上、啮合到、连接到或耦合到另一个部分或层，或可存在中间部分或层。相反，当部分被称为“直接地在另外的部分或层上”、“直接地啮合到”、“直接地连接到”或“直接地耦合到”另外的部分或层，不可存在中间部分或层。应该以相似的方式解释用于描述部分之间关系的其他词(例如，“在…之间”相对于“直接地在…之间”，“邻近”相对于“直接地邻近”，等等)。如本文所用，术语“和/或”包含一个或多个所列关联项目的任何和所有的组合。
尽管术语第一、第二、第三，等等在本文可用于描述多个部分、元件、区域、层和/或部件，这些术语不应该限制这些部分、元件、区域、层和/或部件。这些术语仅仅用于将一个部分、元件、区域、层或部件与另外的区域、层或部件区别。当在本文中应用时，除非上下文明确指示，术语如“第一”、“第二”和其他数字术语不暗示序列或顺序。因而，在不脱离示例实施方式的教导下，下面讨论的第一部分、元件、区域、层或部件可称为第二部分、元件、区域、层或部件。
空间上相对的术语，如“内部”、“外部”、“在…之下”、“在…下面”、“下面的”、“在…上面”、“上面的”等等可在本文中使描述简单以描述一个部分或特征与在图中阐明的另外的部分或特征的关系。除了在图中描述的方位之外，空间上相对的术语可意欲包含设备在使用或操作中的不同的方位。例如，如果翻转图中的设备，那么，描述为在其他部分或特征的“下面”或“之下”的部分将可定位为在其他部分或特征的“上面”。因而，实例术语“在…下面”可包含上面和下面的方位。设备可进行另外的定位(旋转90度或在其他方位上)，并由此解释本文所用的空间上相对的描述。
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Claims (20)

1.制造用于病原体的快速检测的传感器的方法，所述方法包括：
提供基板；
将涂层沉积在所述基板上，所述涂层具有外表面；和
融化和淬火所述外表面在所述涂层上生产纹理外表面，所述纹理外表面具有多个凸起和凹陷，以便产生通常高的表面积，并且所述多个凸起之间具有标称间距，使得预先确定的电磁辐射波长的内部散射最小化和预先确定的电磁辐射波长的反射最大化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述涂层是硅涂层。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将生物标记底物应用于在所述纹理外表面上。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在将含有每毫升107菌落形成单位(CFU/ml)浓度的大肠杆菌(E-Coli)溶液放置到所述传感器上至少60秒之后，所述传感器反射具有大约530纳米波长的至少4000相对发光单位(RLUs)的电磁辐射。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在将含有107CFU/ml浓度的大肠杆菌溶液放置到所述传感器上至少60秒之后，所述传感器反射具有大约530纳米波长的至少5000RLUs的电磁辐射。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在将含有107CFU/ml浓度的大肠杆菌溶液放置到所述传感器上至少60秒之后，所述传感器反射具有大约530纳米波长的至少6000RLUs的电磁辐射。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在将含有107CFU/ml浓度的大肠杆菌溶液放置到所述传感器上至少120秒之后，所述传感器反射具有大约530纳米波长的至少6000RLUs的电磁辐射。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在将含有107CFU/ml浓度的大肠杆菌溶液放置到所述传感器上至少120秒之后，所述传感器反射具有大约530纳米波长的至少8000RLUs的电磁辐射。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在将含有107CFU/ml浓度的大肠杆菌溶液放置到所述传感器上至少120秒之后，所述传感器反射具有大约530纳米波长的至少10000RLUs的电磁辐射。
10.根据权利要求1所述的方法，其中利用选自电化学沉积、热喷射沉积、等离子体沉积、物理气相沉积、化学气相沉积和其组合的技术，将所述涂层沉积到所述基板上。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述技术是热喷射沉积。
12.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述涂层的所述外表面上多个离散位点的迅速融化和淬火产生所述纹理外表面。
13.根据权利要求12所述的方法，其中利用选自激光、电子束、等离子体和其组合的热源产生所述涂层外表面上所述多个离散位点的迅速融化和淬火。
14.用于病原体的快速检测的传感器，包括：
基板；
连接到所述基板上的涂层，所述涂层具有纹理外表面，所述纹理外表面具有多个凸起和凹陷，所述多个凸起在它们之间具有标称间距，并且是可操作的，以便反射期望的电磁辐射波长，所述纹理外表面通过迅速融化和淬火所述外表面而形成。
15.根据权利要求14所述的传感器，进一步包括在所述涂层的所述纹理外表面上吸附的生物标记。
16.根据权利要求15所述的传感器，其中所述生物标记是化学发光底物。
17.根据权利要求16所述的传感器，其中所述化学发光底物含有二氧杂环丁烷。
18.根据权利要求17所述的传感器，其中所述标称间距反射530纳米的电磁辐射波长。
19.根据权利要求18所述的传感器，其中在将含有每毫升107菌落形成单位(CFU/ml)浓度的大肠杆菌溶液放置到所述化学发光底物上至少60秒之后，所述纹理外表面反射具有530纳米的波长的至少4000相对发光单位(RLUs)的电磁辐射。
20.根据权利要求19所述的传感器，其中在将含有107CFU/ml浓度的大肠杆菌溶液放置到所述化学发光底物上至少60秒之后，所述纹理外表面反射具有530纳米的波长的至少5000RLUs的电磁辐射。
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