CN103012589A - 人源抗人血管内皮细胞生长因子抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人源抗人血管内皮细胞生长因子（VEGF）抗体及其编码基因与应用。本发明通过基因工程手段和噬菌体表面展示技术，从全合成单链人抗体库中筛选出抗VEGF基因工程单链抗体，获得其可变区基因序列，通过生物信息学手段对其CDR区氨基酸进行改造，并利用链交换的方法，通过突变库构建与筛选，最终获得一系列高亲和力抗VEGF抗体，其和人VEGF的亲和力为10^-9～10^-11M。本发明完成了抗体的免疫活性和生物活性鉴定，证实其具有拮抗VEGF与VEGFR2结合的特性，能有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖。本发明为将来针对VEGF靶标的抗肿瘤和老年性视黄斑变性提供一种新的特异性候选抗体分子。

Description

人源抗人血管内皮细胞生长因子抗体及其应用

技术领域

本发明涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，主要是特异性针对新生血管尤其是特异性针对恶性肿瘤和视网膜病变中新生血管形成的关键因子VEGF，具有抑制肿瘤和其他新生血管形成相关疾病中VEGF的生物学活性，从而达到抑制恶性肿瘤生长和转移及各种眼内新生血管性病变的治疗或诊断用基因工程抗体。 

背景技术

新生血管形成牵涉各种病症的病理发生过程，包括实体瘤、增生性视网膜病变、与年龄相关的黄斑退行性病变、关节炎和银屑病。实体瘤中，新生血管发生使肿瘤细胞获得有利的生长环境和自我增殖的能力。大量研究证实VEGF在正常和病理性血管发生中具有重要的调节作用，发现即使VEGF单等位基因的缺失也会导致胚胎死亡，说明，其在血管系统发生及分化过程中具有不可替代的作用。进而研究证实，VEGF是肿瘤和视网膜病变中新生血管形成的关键因子。糖尿病及其他局部缺血相关的视网膜病变病人的眼液中VEGF浓度与血管快速增殖现象具有高度相关性。抗VEGF中和抗体抑制裸鼠内各种肿瘤细胞系的生长并抑制缺血性视网膜病症模型的血管发生。因此，抗VEGF单克隆抗体或VEGF其他抑制剂在实体瘤及各种眼内新生血管性病变的治疗中将具有良好的应用前景。 

针对VEGF信号通路的药物研究进展迅速（Sharma PS et al.,2011;Bagri A et al.,2010），主要集中在针对VEGF-A和VEGFR2两个分子上。VEGF与VEGFR2结合，可以明显促进内皮细胞的增殖、分化和迁移，进而促进血管发生。中和抗体通过抑制其与受体的结合，抑制VEGF的生物学功能，从而达到抑制肿瘤或病理性血管发生的目的。 

2004年，针对VEGF靶标的治疗用人源化抗体贝伐单抗（阿伐斯汀，商品名阿伐斯汀，即阿伐斯汀）经FDA批准上市，用于治疗结肠癌，其后又陆续被批准用于治疗非小细胞型肺癌、肾细胞癌、乳腺癌和恶性胶质瘤(Hurwitz H et al.,2001;Miller K et al.,2007;Cohen MH et al.,2009;Summers J et al.,2010)，目前其年销售额已经超过60亿美元。另一株上市的人源化Fab抗体ranibizumab也于2006年批准上市，用于治疗湿性视黄斑变性(Rosenfeld PJ et al.,2006)。而处于临床和临床前研究阶段的针对VEGF的抗体类药物也有很多，其中VEGF受体胞外片段与免疫球蛋白的Fc片段融合蛋白VEGF-Trap已经进入III期临床(Bagri A et al.,2010;Holash J et al.,2002;Lockhart AC et al.,2010)。VEGF的受体主要包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。一般认为，VEGFR2是VEGF-A 通路是抗血管发生治疗的主要靶向，目前，针对VEGFR2的抗体药物包括：全人源抗体remucirumab(Spratlin JL et al.,2010;Posey J A et al.,2003;Spratlin J et al.,2011)和人源化抗体DC101/IMC-1C11等(Cabebe E&Wakelee H,2007)。 

人源抗体是治疗性抗体发展的最新发展方向。人抗体库技术和人抗体转基因小鼠技术是目前获得人源抗体的两个重要途径，两者各具特色。与转基因小鼠相比，抗体库技术突破了抗体体内制备的限制，使抗体的研制简单、快速而且便捷。然而，就目前的发展现状而言，抗体库技术成功的案例与转基因小鼠相比还有一定的差距。但是，抗体库技术也为抗体的改造提供了强大的技术支持，它使得治疗性抗体的获得和改造比之前任何时候都更容易。尤其是在针对一些通过免疫很难获得较好效果的靶标抗原特异性抗体的研制方面，抗体库技术具有明显的优势。目前已经有两株来自抗体库技术的抗体被批准上市，另有多株抗体处于临床研究阶段，充分证实抗体库技术的巨大的实用价值。 

非免疫性抗体库包括天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。其中，半合成抗体库以剑桥大学的CAT抗体库技术为代表，Humira就是通过该技术上市的第一个产品。2000年，Marphosys AG公司首次报道了大容量全合成抗体库技术，即HuCAL GOLD专利技术。通过该技术目前已经获得了数十株具有开发价值的候选抗体，目前进入临床阶段的有17个项目。该技术的最大优势在于可以通过合理设计对抗体库进行优化，同时，其抗体框架基因为可替换的盒式结构，便于后期的抗体优化和改造，基于这一优势，HuCAL库目前已经将其抗体库更新至第三代，库容量达到4.5×10¹⁰，从抗体库中可筛选到亲和力达到pM水平的高亲和力抗体。因此，利用抗体库获得治疗性人源抗体技术已经非常成熟，是目前最成功的开发治疗性抗体的技术手段之一。抗体库技术的另一优势表现在可用于抗体的优化和体外亲和力成熟工作。对亲本抗体通过构建突变库并结合有效的筛选，可以获得亲和力更高、活性更好、结构更稳定及理化特性改进的突变体抗体。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供人源抗VEGF抗体及其活性片段的氨基酸序列。 

本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的编码基因。 

本发明的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在治疗恶性肿瘤及其他病理性血管发生类疾病中的应用。 

本发明运用噬菌体表面展示技术，从大容量全合成人源单链抗体库中，通过多轮的生物淘洗（bio-panning），筛选获得特异性抗人VEGF₁₆₅的单链基因工程抗体(singlechain variable fragment,scFv)，并通过对抗体的体外亲和力成熟进一步获得一系列高亲和力突变体Fab抗体。 

本发明提供的人源抗VEGF抗体其轻链CDR3的氨基酸序列含有如SEQ ID NO.3~9 中的任意一条。 

进一步地，本发明提供的一种人源抗VEGF抗体，其轻链CDR1、CDR2分别含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其重链CDR1、CDR2和CDR3分别含有如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。 

进一步地，本发明提供的人源抗VEGF抗体其轻链CDR1氨基酸序列为RASQSVSSSYLA（SEQ ID NO.29），其轻链CDR2氨基酸序列为GASSRAT（SEQ IDNO.30），其轻链CDR3氨基酸序列为SEQ ID NO.3~9中的任意一条；其重链CDR1氨基酸序列为SYAMS（SEQ ID NO.31），重链CDR2氨基酸序列为AITGTGGETYYTDSVKG（SEQ ID NO.32）、重链CDR3氨基酸序列为GWSYNGVDP（SEQ ID NO.33）。 

更进一步地，本发明提供的人源抗VEGF抗体其重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别选自以下各组中的一组：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列、SEQID NO.13和SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.13和SEQID NO.18所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列、SEQID NO.13和SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列。 

本发明提供的抗体包括全抗体和各种其他形式的基因工程抗体。如，抗VEGF抗体可以是全抗体或抗体片段。本发明提供的上述抗体，其为单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD。 

此处所公开和要求保护的SEQ ID NOs：13～20所示序列包括“保守序列修饰”。即，不明显影响和改变所述抗体或含有所述氨基酸序列抗体的结合特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。本发明所述保守序列修饰在此特指核苷酸或氨基酸替换、添加或缺失。可以通过本领域的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变等将修饰导入SEQ ID NOs：13～20中，如本发明实施例中通过对抗体CDR区进行丙氨酸扫描和对部分位点进行氨基酸突变，即为保守序列修饰的范例。保守氨基酸替换包括氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基或其他氨基酸残基代替。本领域中，已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（如赖氨酸、精氨酸、组氨酸），具有酸性侧链的氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸），具有不带电极性侧链的氨基酸（如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非极性侧链的氨基酸（如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸），具有β分支侧链的氨基酸（如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和具有芳香侧链的氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，优选用来自于同一侧链家族的另一种氨基酸残基代替人抗EGFR抗体中的非必须氨基酸残基。 

因此，此处公开的核苷酸序列编码的抗体或\和含有此处公开的氨基酸序列的抗体 包括基本上由经保守序列修饰的相似序列编码的，或含有经保守序列修饰的相似序列的抗体，均应视为本发明的范畴。 

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因，均应视为本发明的范围。例如本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。 

本发明还提供了编码上述抗体的基因。 

其中，编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列选自以下各组中的一组：SEQ IDNo.21和22所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.23所示的核苷酸序列、SEQID No.21和SEQ ID No.24所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.25所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.26所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ IDNo.27所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.28所示的核苷酸序列。 

本发明提供了含有上述基因的表达载体。 

本发明提供了含有上述表达载体的宿主菌、宿主细胞或表达盒。 

本发明提供了含有上述抗体的药物或检测试剂。 

本发明还提供了上述抗体在制备以VEGF为靶标的疾病治疗药物中的应用。 

本发明更进一步提供：编码抗体的独立基因；表达载体，载体转染宿主细胞相关控制技术及宿主细胞，抗体表达流程及在细胞培养上清中回收抗体。本发明同样提供含有抗体的组分和药理学上可接受的递送分子或溶液。本治疗用组分为无菌，可低温冻干。 

本发明提供了一种制备上述抗体的方法：包括，利用噬菌体展示抗体库技术筛选抗VEGF特异性单链抗体，获得抗体轻重链可变区基因，并将其克隆入全抗体表达载体，以便通过哺乳动物表达系统对其进行全抗体表达，获得其全抗体蛋白。 

本发明制备上述抗体的方法具体为：通过在自构建的大容量全合成抗体库（ZL200910091261.8）中进行抗VEGF抗体的筛选获得了一株特异性噬菌体抗体VA6，其单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示，将其轻重链可变区基因（分别如SEQID NO.39和SEQ ID NO.40所示）分别克隆入哺乳动物细胞瞬时表达载体pABL和pABG1中，构建全抗体重组表达载体，并在HEK293T细胞中进行瞬时表达，纯化后获得全抗体蛋白纯品，利用计算机辅助分子设计的方法对VA6与VEGF的结合模型进行了预测和分析，设计了一系列定点突变的突变体，并通过突变体亲和力分析筛选出亲和力有所提高的突变体抗体VA6-9B，以VA6-9B的重链可变区为基础，设计并构建了轻链噬菌体抗体Fab突变库Vκ-9B，通过筛选，获得了7株高亲和力Fab突变体抗体，分别将其轻、重链可变区基因克隆入载体pABκ和pABG1，构建全抗体重组表达载体，并在HEK293T细胞中进行瞬时表达，利用ProteinA株进行纯化，获得全抗体蛋白纯品以进行亲和力及其他活性分析。 

抗体分子本身可以做诊断或治疗用。进而，抗体可以被标记、交联或偶联及与其 他蛋白或多肽分子融合表达形成复合物（如细胞毒性物质、放射性毒素和\或化学分子等）用于诊断和治疗。 

本发明提供了一种免疫毒素，包含连接于细胞毒性剂的上述抗体。 

其中，连接方式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。 

所述细胞毒性剂包括化学分子、放射性同位素、多肽或毒素对细胞具有杀伤或诱导细胞死亡特性的物质。 

一种双特异性或多特异性分子，包含上述抗体或抗体的抗原结合部位。 

本发明提供了一种抗体与其他蛋白或\和多肽的融合蛋白，包含上述抗体和功能性蛋白或多肽分子的复合物。例如将抗体基因与免疫毒素或细胞因子基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。 

在本发明实施例中，将上述抗体可变区分别导入全抗体哺乳动物细胞瞬时表达载体pABK和pABG1中，通过共转染HEK 293细胞进行瞬时分泌表达，得到全抗体Amv1、Amv2、Amv3、Amv4、Amv5、Amv6、Amv7。 

表1  Amv系列抗体重链CDR氨基酸序列 

	H-CDR1	H-CDR2	H-CDR3
				氨基酸序列	SYAMS	AITGTGGETYYTDSVKG	GWSYNGVDP
来源	SEQ ID No.10	SEQ ID No.11	SEQ ID No.12

表2  Amv系列抗体轻链CDR区氨基酸序列 

	L-CDR1	L-CDR2	L-CDR3	命名
					氨基酸序列	RASQSVSSSYLA	GASSRAT	LQDDKEPL（SEQ ID No.3）	Amv1
氨基酸序列	RASQSVSSSYLA	GASSRAT	KQVFSKLE（SEQ ID No.4）	Amv2
					氨基酸序列	RASQSVSSSYLA	GASSRAT	QQKPKNPN（SEQ ID No.5）	Amv3
氨基酸序列	RASQSVSSSYLA	GASSRAT	QQQVWDPW（SEQ ID No.6）	Amv4
					氨基酸序列	RASQSVSSSYLA	GASSRAT	KQTPYPPH（SEQ ID No.7）	Amv5
氨基酸序列	RASQSVSSSYLA	GASSRAT	QQTRSDPG（SEQ ID No.8）	Amv6
					氨基酸序列	RASQSVSSSYLA	GASSRAT	MQLIDKLY（SEQ ID No.9）	Amv7
来源	SEQ ID No.1	SEQ ID No.2

本发明描述的抗体Amv1~Amv7具有良好的治疗应用前景，主要表现为与人VEGF165具有特异性高亲和力，可以抑制VEGF与VEGFR2的结合，并抑制人VEGF诱导的内皮细胞增殖和KDR受体磷酸化。 

该一系列抗VEGF抗体与VEGF结合亲和力Kd在10^-8～10^-11M水平，突变体体外抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖的ED50值不超过5nM，5μg/ml的突变体抗体可以完全抑制内皮细胞KDR受体磷酸化。 

该一系列抗VEGF抗体经ELISA实验证实，仅特异性结合人VEGF，而与其他蛋白无非特异性结合，抗体仅与天然的VEGF双体结合，与变性的VEGF不结合。 

该一系列抗体经竞争结合抑制实验证实可特异性抑制VEGF与VEGFR2的结合， 但对VEGF与VEGFR1的结合无抑制作用。同时，该系列抗体可以完全抑制VEGF与阿伐斯汀的结合，但反之阿伐斯汀不能完全抑制其与VEGF的结合，表明，其抗原表位与阿伐斯汀不完全相同，但本发明各抗体间抗原表位基本相同。 

以Amv6轻链为研究对象，其氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。对其LCDR1、LCDR2和LCDR3进行定点氨基酸突变，结果表明：LCDR1中第24位Arg突变为Gln，其亲和力不变；第29位Val突变为Ile，亲和力不变；第31位Ser突变为Gly，亲和力不变；第32位Ser突变为Gly或删除后，亲和力不变；LCDR2中第51位Gly突变为Ala，亲和力不变，第52位Ala突变为Gly、第54位Ser突变为Asn、第57位Thr突变为Pro、Glu后亲和力不变或略有提高。 

对上述抗体的重链CDR区丙氨酸扫描实验结果证实，SEQ ID No.13的HCDR1（SYAMS）、HCDR2（AITGTGGETYYADSVKG）和HCDR3（GWSYNGVDP）对抗体与抗原结合能力或抗体结构具有重要影响，尤其是SEQ ID No.13中第32位Tyr（HCDR1中的Y）、第33位Ala（HCDR1中的A）；第50位Ala（HCDR2中的A)，第52位Thr（HCDR2中的T)，第56位Gly（HCDR2中的G)、第58位Thr（HCDR2中的T)、第59位Tyr（HCDR2中的Y)、第63为Ser（HCDR2中的S)；HCDR3中第99位Gly（HCDR3中的G)、第100位Trp（HCDR3中的W)、第101位Ser（HCDR3中的S)、第102位Tyr（HCDR3中的Y)、第103位Asn（HCDR3中的N)、第104位Gly（HCDR3中的G)、第106位Asp（HCDR3中的D)、第107位Pro（HCDR3中的P)，其突变为丙氨酸后，亲和力均发生明显变化。进一步对部分CDR氨基酸序列进行替换突变，结果表明，HCDR1(SEQ IND No.10)可以是X1X2AMS，在此，X1可以是Ser或Asp，X2可以是Tyr或Ala；其CDRH2（SEQ ID No.11）可以是AIX1X2TGGX3X4YYADX5VKG，在此，X1可以是Thr或Ser，X2可以是Gly、Ser或Lys，X3可以是Glu或Ala，X4可以是Thr或Ala，X5可以是Ser、Gln或Ala；其CDRH3（SEQ ID No.12）可以GWSYNGX1DP，在此，X1可以是Val或Ala。并且，经进一步实验证实，其重链CDR区的氨基酸突变结果同样适用于Amv系列其它抗体。 

本发明提供一系列抗VEGF抗体，他们可以抑制VEGF所诱导的一种或多种生物学活性，比如，VEGF的促有丝分裂和促新生血管生成活性。VEGF拮抗剂通过阻碍VEGF与细胞表面受体结合发挥作用，也可以通过杀伤或使VEGF活化的细胞失活发挥作用，或者通过在VEGF与细胞表面受体结合后阻碍内皮细胞活化发挥作用。VEGF拮抗剂所具有的所有干扰功能均应平等地视为本发明的目的。 

本发明通过噬菌体展示技术获得7株抗VEGF165的全人源抗体，这些抗体的序列是独特的，未见文献报道。抗体蛋白具有特异性拮抗VEGF与VEGFR2结合的生物学 功能；本发明的抗体可以完全抑制阿伐斯汀与VEGF的结合，反之，阿伐斯汀不能完全抑制VEGF与抗体的结合，表明其作用位点或模式存在不同，但可能其作用位点空间结构上非常接近。利用上述获得的人源中和性抗VEGF基因工程抗体可变区基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体，或以此为基础改建后的含有此抗体基因的任何其它基因，获得具有中和VEGF生物学活性的抗体产物，或利用体外标记或交联的方法获得的复合物，制成临床上用于治疗恶性肿瘤或其他病理学血管发生相关疾病的特异性抗体药物。 

附图说明

图1所示为pComb3载体示意图。 

图2所示为VEGF抗体对VEGF与R1和R2相互作用的竞争性抑制作用。其中A为VEGF抗体对VEGF与R1相互作用的竞争性抑制作用；B为VEGF抗体对VEGF与R2相互作用的竞争性抑制作用。 

图3所示为Amv抗体对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞表面VEGFR2(又称KDR)磷酸化的影响，1：VEGF(-),2：VEGF(50ng/ML),3：VEGF(50ng/ML)+阿伐斯汀(1μg/ML),4：VEGF(50ng/ML)+Amv1(1μg/ML),5：VEGF(50ng/ML)+Amv6(1μg/ML),6：VEGF(50ng/ML)+Amv7(1μg/ML),7：VEGF(50ng/ML)+赫赛汀(1μg/ML)。其中图3A：人脐静脉内皮细胞表面KDR受体磷酸化Westernblot图；图3B为Westernblot条带灰度扫描统计分析结果。 

图4所示为Western blot检测Amv1抗体与VEGF单双体结合活性。其中，A为Amv1抗体与还原形态VEGF结合情况，B为Amv1抗体与非还原形态VEGF结合情况，C为阿伐斯汀抗体与还原形态VEGF结合情况，D为阿伐斯汀与非还原形态VEGF结合情况。 

图5所示为Biacore测定Amv系列抗体阿伐斯汀和Trap12的相互封闭抑制作用。以VEGF为固定抗原，以过饱和的第一结合相抗体结合后，进一步结合过饱和的第二结合相抗体，观察第一相抗体对第二相抗体的结合阻抑作用。A为阿伐斯汀为第一结合相，横坐标样品为第二结合相，B为Trap12为第一结合相，横坐标抗体样本为第二结合相，C为Amv1为第一结合相，横坐标抗体样本为第二结合相。 

图6所示为Amv抗体对VEGF诱导的内皮细胞增殖的抑制作用。图6A：为Amv1；图6B：为Amv3；图6C：为Amv4；图6D：为Amv5；图6E：为Amv6；图6F：为Amv7对VEGF诱导的内皮细胞增殖的抑制作用。 

图7A为表达载体pABL的图谱；图7B为表达载体pABκ的图谱；图7C为表达载体pABG1的图谱。 

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

实施例1大容量噬菌体抗体库的大规模筛选 

一、材料与方法： 

1.材料：大容量全合成噬菌体单链抗体库由中国人民解放军军事医学科学院构建（ZL200910091261.8），库容量1.35×10¹⁰。筛选抗体库的抗原为HEK293T细胞表达的重组VEGF165（浓度为1mg/ML），菌株为XLI-Blue（美国Stratagene公司）；所用噬菌体为M13KO7（美国Invitrogen公司）。真核表达载体pABG1和pABκ及pABL为本室保存，载体信息见（图7A、图7B、图7C），哺乳动物细胞HEK293T细胞购自Invitrogen公司。 

2.方法 

2.1重组蛋白抗原VEGF165的制备： 

将VEGF165基因（由军事医学科学院生物工程研究所师明磊博士惠赠，具体来源及序列可见师明磊博士论文：重组VEGF可溶性受体的构建表达与鉴定，中国人民解放军军事医学科学院，2008)利用常规分子克隆方法克隆入真核瞬时表达载体pABG1（图7C）。具体而言，利用酶切位点EcoR I和BamH I克隆入载体，构建重组表达质粒，并利用HEK293T细胞对重组质粒进行表达，利用在VEGF165的C端引入的6个His的组氨酸标签进行纯化，获得蛋白纯品，蛋白定量后分装冻存。 

2.2噬菌体抗体库的呈现 

取冻存的抗体库，在200ml 2×YTCG（葡萄糖浓度为0.5%）培养基中37℃培养至OD600=0.5，按MOI=20∶1的比例加入辅助噬菌体M13KO7，室温静置20min。37℃，150rpm缓慢摇床培养1h，加入卡那霉素至终浓度为50μg/ml，并加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于30℃，220rpm摇床培养10~12h。次日，离心收取培养上清加入1/5体积的PEG8000 buffer（20%PEG+2.5mol/L NaCl），混匀后于冰上放置45min，沉淀噬菌体。4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀重悬于5ml含2%BSA和15%甘油的PBS缓冲液中，-70℃冻存备用。 

2.3抗VEGF特异性抗体的淘选： 

将重组蛋白抗原VEGF用包被液稀释为10μg/mL包被免疫管，1mL/管，4℃包被过夜。次日，免疫管用PBS洗涤2遍，2min/遍，然后用2%BSA 37℃封闭2h。将制备好的噬菌体抗体库用封闭液（2%BSA，0.1%吐温-20）37℃封闭30min。将预封闭后的噬菌体抗体库加入封闭后的免疫管中，37℃作用1h，室温轻摇30min。弃免疫管中溶液，进行洗涤。洗涤后，加入1mL 0.2mol/L的甘氨酸-盐酸（pH2.2）洗脱，室温作用10min，立即用1mol/L Tris中和至pH7.4。以1:9的比例加入对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue，37℃缓慢摇床培养1h；取1%涂2×YTCTG平板上，37℃培养并对菌落数进行统计，计 算投入产出比。同时将剩余菌液涂2×YTCTG平板，37℃培养过夜。用液体2×YTCTG培养基将菌落刮取下来，取适量菌液投入100ML 2×YTCTG液体培养基中，37℃摇床培养至OD600=0.5时，按2.1的方法进行噬菌体呈现。以用于下一轮筛选。 

2.4噬菌体ELISA鉴定阳性克隆 

挑取经筛选后的单个克隆，用2.1的方法进行单克隆呈现，呈现过夜的噬菌体上清进行噬菌体ELISA。抗原（VEGF）用PBS稀释至1μg/ML，加入96孔酶联板，50μl/孔，4℃包被过夜。次日，弃包被液，酶联板用PBST洗2次，PBS洗一次，每次3min，用2%BSA+0.1%吐温-20封闭，200μl/孔，37℃，2h。弃封闭液，加入经封闭后的单克隆噬菌体抗体，50μl/孔，37℃，静置1h。弃去液体，用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min。将HRP-标记鼠抗M13抗体用PBST稀释，稀释比例为1∶5000，同时加入BSA至终浓度2%，37℃预封闭15min。将预封闭后的鼠抗M13抗体加入酶联板，50μl/孔，37℃静置30min。弃去液体，酶联板用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min。弃去洗涤液，加入底物显色液，50μl/孔，室温静置显色。用2N H₂SO₄终止显色。酶标仪测定光吸收值。 

2.5噬菌体抗体转换为全抗体： 

载体pABG1、pABκ、pABL分别用于克隆VH、Vκ和Vλ可变区基因，分别采用引物H3F（SEQ ID No.29）和HR（SEQ ID No.30）扩增VH3可变区基因、K3F（SEQ IDNo.31）和KR（SEQ ID No.32）扩增Vκ可变区基因、L3F（SEQ ID No.33）和LR（SEQID No.34）扩增Vλ3可变区基因。轻链可变区Vκ通过PCR扩增后利用酶切位点XbaI和NarI克隆入pABκ，Vλ3通过PCR扩增后利用酶切位点Bsr GI和HindIII克隆入载体pABλ，VH3通过PCR扩增后利用酶切位点Afl II和NheI克隆入载体pABG1。对筛选获得的噬菌体抗体（包括ScFv和Fab）进行全抗体改造，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，通过对重组质粒进行菌液PCR及测序鉴定，获得构建正确的全抗体轻重链表达载体。大提质粒后将抗体轻重链以摩尔比1：1转染HEK293T细胞，进行全抗体的瞬时表达，经ProteinA亲和层析柱对表达上清进行纯化，并对纯化产物通过Bradford法进行蛋白定量，或通过一种定性比较抗体亲和力的酶联免疫吸附测定实验对各全抗体进行相对亲和力比较。对部分抗体通过Biacore测定其与VEGF165结合的亲和常数。 

2.6抗体亲和力测定（Biacore） 

Biacore法测定全抗体亲和力。具体步骤如下： 

预浓缩：Broford法测定抗原浓度，配置pH4.0、pH4.5、pH5.0和pH5.5的10mM醋酸钠，按适当倍数稀释抗原，在CM5芯片上作预浓缩，选择最适pH值的醋酸钠作为包被稀释液，同时分析最适合包被的抗原稀释浓度。 

包被抗原：用最适pH值的醋酸钠稀释VEGF抗原，选择最适稀释度并选择CM5芯片上的一个通道用于耦联，耦联抗原目标值为300RU，并选择另外一个通道作为对照。试验条件为25℃，流速20μL/min，缓冲液为HBS-EP（pH7.4，Bia-Certified）。芯片偶联抗原达到目标值后封闭芯片表面。 

再生条件分析：100nM的抗体流经芯片表面，使抗体和芯片表面的抗原结合，稳定后pH3.5、pH2.5、pH2.0、pH1.5的10mM甘氨酸-盐酸和pH8.5的硼酸盐缓冲液依次流经过芯片表面，直到获得最佳的再生效果，以确定最佳的再生条件。 

抗体与抗原结合的动力学分析：Broford法测定抗体浓度，用HBS-EP缓冲液稀释抗体，取不同浓度（0-100nM中取5个不同浓度）抗体流过抗原通道和对照通道，流速20μL/min，结合时间3分钟，稳定时间1分钟，解离时间15分钟，每一个循环再生条件为10mM甘氨酸-盐酸pH1.5和pH8.5的硼酸盐缓冲液，流速20μL/min，每种溶液再生30s。 

亲和常数计算：所得传感图用Bia-evaluation分析软件4进行1：1 Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。 

二、结果 

对第三轮筛选获得的单克隆进行鉴定，获得特异性大量序列不同的噬菌体抗体，其中一株为抗体VA6，其单链抗体的氨基酸序列如下： 

SYELTQPPSVSVAPGQTARITCSGDALGDKYASWYQQKPGQAPVLVIYEDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQVKSDNYGYVFGGGTKLTVLGSGGSTITSYNVYYTKLSSSGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGWSYNGVDPWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO.38） 

将VA6轻重链可变区基因（如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示）分别克隆入全抗体瞬时表达载体pABL和pABG1中，构建其全抗体表达重组载体，并通过HEK293T细胞瞬时表达系统实现了哺乳动物细胞瞬时分泌表达。通过Biacore测定其与VEGF结合的亲和力，其K_D=12.7nM，其中K_on=3.5×10⁴ 1/Ms，K_off＝4.45×10^-4 1/s。 

实施例2计算机辅助设计对抗VEGF抗体VA6的体外亲和力成熟 

一、实验方法 

1．1 VA6-VEGF复合物三维结构模型的构建 

1.1.1氨基酸序列的数据库检索 

以抗体VA6的轻、重链可变区序列为探针，在最新的蛋白质结构数据库(PDB)中，采用Fasta3.0程序进行序列搜索，找到分别与VA6的轻、重链同源性高的参考蛋白，结果搜索所得的参照蛋白序列与抗体序列同源性均达到40%以上，结构叠合后复合物与ICZ8\VEGF复合物结晶同源性达到94%，符合获得高精度结构模型的要求。 

1.1.2三维结构的同源模建 

采用程序模型进行同源模建分别构建抗体轻、重链结构模型。首先从参考蛋白结构中抽取出一些空间制约条件如键长、键角、α-碳原子之间间距和主链及侧链二面角等，将这些制约条件用几率密度函数（probability density functions，PDFs）来表示，然后根据氨基酸类型、等位残基的主链构象和序列之间局部的相似程度来对空间制约条件施加以不同的权重因子。模建时将几率密度函数应用到未知结构蛋白质序列上，通过优化分子的几率密度函数使制约条件有最小的冲突而得到目标蛋白的三维结构，整个优化过 程通过分子力学和分子动力学模拟来实现。 

1.1.3抗原-抗体复合物空间结构预测 

VA6L以PDB数据库中的晶体结构1BJ1、ICZ8、2DD8中抗体轻链结构为参照，VA6H以数据库中的晶体结构1TZH、2FJG、2QR0中抗体重轻链结构为参照，采用程序模型进行同源模建，获得VA6L、VA6H的结构模型。 

获得抗体轻、重链结构模型之后，通过“结构叠合”加“结构优化”的办法，构建VA6和VEGF结构复合物模型。以PDB数据库中的晶体结构ICZ8为参考模型，将VA6的轻链与重链分别向复合物中抗体的Fab片段分子的轻链与重链做结构叠合。之后在发现模块下，选用CVFF力场对叠合的结构进行分子力学优化。优化后的模型作为抗原-抗体复合物结构的初步模型，进行下一步分析。 

1.2模建结果分析及突变体设计 

1.2.1模建结果分析 

首先计算已得到的抗VEGF单克隆抗体与VEGF复合物结构模型中VA6的氨基酸残基与VEGF的氨基酸残基的距离，根据残基的距离判定该残基是否参与了分子间作用，残基作用距离确定为0.45nm；然后确定VEGF与抗体结合的区域以及VA6与抗原结合的CDR区氨基酸位点。对这些氨基酸的结构及性质进行分析，进而判断可以突变的位点进行突变体设计。 

1.2.2突变体设计及引物合成 

根据对所构建的抗原-抗体三维结构模型的深入分析，确定突变后可能使抗体亲和力提高的氨基酸位点，并设计出目的氨基酸残基种类。根据所设计的突变体以及抗体基因和载体的序列，设计并合成定点突变引物。按实施例1的方法构建其全抗体重组载体、进行表达纯化。 

1.3抗体亲和力分析 

突变体亲和力分析采用实施例1中的Biacore方法进行。 

二、结果 

1．突变体抗体的亲和力测定 

通过分析，确定对VA6的L90和L92位氨基酸进行突变，并对突变体相对亲和力进行比较，获得亲和力有所提高的突变体抗体VA6L-K90D_D92V（VA6-3），将VA6-3与VEGF重新进行模建分析，并进一步对重链57位Ser突变为Glu，获得亲和力进一步提高的突变体抗体VA6-57。并在此基础上进一步将重链第52位Ser和54位Ser进行突变，结果获得52位和54为均突变为Thr的突变体抗体VA6-9B。 

表3  biacore测定VA6突变体与VEGF结合亲和力 

抗体	Ka（1051/MS）	Kd（10-41/S）	KD（nM）
				VA6	0.35	4.45	12.7
VA6-3	2.83	14.9	5.27
				VA6-57	5.5	9.6	1.8

[0103] 

VA6-9B

0.88

1.6

1.8

2.各突变体氨基酸序列如下 

表4  VA6突变体轻重链CDR区氨基酸序列表 

实施例3  VA6-9B轻链Fab重组噬菌体抗体库的构建及筛选 

一、材料与方法 

1．噬菌体Fab抗体库的构建 

为获得亲和力更高的突变体抗体，选择VA6-9B的重链为对象，通过链交换策略，即构建Vκ轻链基因文库，分别将其与VA6-9B的重链组合，构建了轻链突变抗体库H9B-Vκ。轻链基因文库Vκ基因设计参考文献（Knappik A,Ge LM,Honegger A,et al.Fully synthetichuman combinatorial antibody libraries(HuCAL)based on modular consensus frameworksand CDRs randomized with trinucleotides.J Mol Biol.2000,296:57-86；杜威世博士论文：军事医学科学院，2006），Vκ的框架基因序列如SEQ ID No.35所示。其CDR1区和CDR2区氨基酸序列为RASQSVSSSYLA和GASSRAT。 

噬粒载体Pcom3-FabK为本室在商业化Pcom3载体的基础上进行改造而成，载体示意图如下（图1），设计引物PVKF（SEQ ID No.36）和PVKR（SEQ ID No.37）扩增全合成噬菌体单链抗体库中（杜威世博士论文：军事医学科学院，2006）Vκ3的基因文库，并引入酶切位点SacI和MluI。利用酶切位点SacI和MluI将其克隆入噬粒载体Pcom3-FabK。 

制备大肠杆菌感受态TG1，连接产物通过电击转化进入感受态TG1，获得转座子，构建Fab抗体库。 

2.突变库高亲和力突变体的筛选 

以本实施例中所构建的抗体库为材料，利用哺乳动物细胞CHO重组稳定表达的VEGF165为抗原，通过常规固相筛选进行高亲和力的淘选。具体筛选方法参见实施例1。经过五轮筛选后，对所获得的第三轮后每一轮产物进行单克隆噬菌体展示，并通过噬菌体ELISA鉴定阳性克隆及其特异性。 

3.突变体抗体的全抗体改造及亲和力分析 

方法同实施例1。 

二、结果 

1．突变库构建 

通过转化感受态大肠杆菌TG1,构建Vκ-9B库容量为9×10⁷。 

2.Vκ-9B Fab重组抗体库筛选高亲和力突变体 

对Vκ-9B Fab重组抗体库进行五轮筛选，分别从第三、四、五轮筛选平板上各挑取96个克隆，经鉴定及测序分析，获得7株亲和力提高的Fab抗体，结果如下： 

表5突变体抗体CDR3区核苷酸和氨基酸序列 

名称	L-CDR3基因序列(Vκ3)	L-CDR3氨基酸序列
			3p12b	CTGCAGGATGATAAGGAGCCCCTC	LQDDKEPL
9B-K3-C4	AAGCAGGTGTTCTCTAAGCTGGAG	KQVFSKLE
			4g6b	CAGCAGAAGCCTAAGAATCCCAAC	QQKPKNPN
2p9b	CAGCAGCAGGTGTGGGATCCATGG	QQQVWDPW
			4ge12	AAGCAGACGCCGTATCCGCCCCAC	KQTPYPPH
9B-K3-61	CAGCAGACGCGCTCGGATCCCGGG	QQTRSDPG
			9B-K8	ATGCAGTTGATCGATAAGCTGTAT	MQLIDKLY

4.高亲和力突变体亲和力分析 

将所获得的噬菌体Fab抗体改造成全抗体进行表达及纯化，通过定量ELISA对其亲和力进行初步分析，并通过Biacore测定其全抗体亲和力如下： 

表6：Amv突变体抗体亲和力分析（biacore 3000） 

实施例4突变体抗体Amv6的丙氨酸扫描和\或定点替换突变 

一、材料与方法 

丙氨酸扫描是评价抗体某一区域各氨基酸位点对抗体结构或抗体结合特性影响的有效方法。本实施例中，以Amv6（SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.13组合）为研究对象，通过丙氨酸扫描确定重链CDR区每一个氨基酸残基对结合的能量贡献，对Amv6的重链（SEQ ID NO.13）CDR区采用定点突变的方法逐点突变为不带电荷的Ala，如果该位置本来是Ala，则替换为Gly。构建重链突变体重组载体，分别将其与Amv6轻链重组载体进行组合后共转染HEK293T细胞，进行瞬时表达，纯化表达的突变体抗体，采用ELISA方法测定突变体抗体的相对亲和力（方法见参考文献：曾大地，王双，李鹤，等。生物技术通讯，2010.03，385-388）。 

二、结果 

以Amv6为对照抗体，进行相对亲和力比较，结果表明，重链对结合影响较大的氨基酸位点包括：A32G、A50G、T52A、G56A、T58A、Y59A、S63A、G99A、W100A、 S101A、Y102A、N103A、G104A、D106A和P107A。具体结果见下表： 

表7：Amv6重链CDR区丙氨酸扫描突变体抗体亲和力变化情况 

注：+-表示亲和力无明显变化，-表示亲和力降低2倍以上，--表示亲和力降低10倍以上，---表示亲和力降低100倍以上。 

以上实验结果表明，A32G、A50G、T52A、G53A、T58A、Y59A、S63A、G99A、W100A、S101A、Y102A、N103A、G104A、D106A和P107A等15个氨基酸位点对抗体结构或结合活性影响较大，因此，可以作为进一步亲和力改造的靶点。对其中的活性影响比较大的氨基酸位点N103A，进一步突变成Ser、Leu、Gln和Asp，四个突变体亲和力均下降10倍以上，进一步证明该位点对结合的重要性。尽管将105Val突变为Ala之后其亲和力没有明显变化，但实验证实将105Val突变为Phe，亲和力下降超过100倍，突变为Ile，Met和Leu，亲和力下降均在10倍以上，表明该位点对结合能力或抗体结构具有重要影响。另外，为验证这些突变对不同Amv抗体的影响是否具有普适性，将亲和力提高的重链位点G53A、T58A、和S63A在另外两株抗体Amv1和Amv4上进行验证，结果表明，其亲和力同样得以改善。同时，将53位的Gly进一步突变为Ser和Lys，其亲和力较突变为Ala进一步提高，进一步提示该位点的重要性，将63位的Ser突变为Gln，其亲和力也有所提高。因此，认为重链的CDR区丙氨酸扫描的结论适用于Amv系列其它抗体。 

另外，采用定点突变的方法对Amv6的CDR1L和CDR2L中的部分氨基酸进行定点氨基酸替换突变，结果表明(SEQ ID NO.19)：将第29位的Val替换为Ile、第31为Ser替换为Gly、第32位Ser替换为Gly或进行缺失突变、第52为Ala替换为Gly、第54位Ser突变为Asn、第55位Arg突变为Leu、第57位Thr突变为Pro或Glu均对亲和力没有不利影响，有些甚至可以提高抗体的亲和力。以上结果均为Amv抗体的改造 提供了大量的数据支持，因此认为，以Amv系列抗体为改造对象，通过一个或几个位点的突变所获得的具有生物学活性的Amv抗体的衍生抗体均属于本发明的范围。 

实施例5抗VEGF抗体的生物活性测定 

一、材料与方法 

1.重组VEGFR1和VEGFR2的制备： 

VEGFR1和VEGFR2的基因由军事医学科学院生物工程研究所师明磊博士惠赠，（具体来源可见师明磊博士论文：重组VEGF可溶性受体的构建表达与鉴定，中国人民解放军军事医学科学院，2008）。将VEGFR1的第1~3个结构域和VEGFR2的第2~4结构域编码基因利用酶切位点EcoR I和Nhe I克隆入瞬时表达载体pABG1，构建重组表达载体VEGFR1-pABG1和VEGFR2-pABG1，进而再将鼠抗体IgG2a的Fc段（基因购自Origene公司，货号为MC200172）利用酶切位点NheI和BamHI分别克隆入重组载体VEGFR1-pABG1和VEGFR2-pABG1，以替换其中的人IgG1的序列，获得重组表达载体mFc-VEGFR1和mFc-VEGFR2。将两种质粒分别瞬时转染HEK293T细胞进行瞬时表达，并利用ProteinA柱对表达上清进行纯化，获得重组蛋白纯品，定量后分装冻存。 

2.竞争性ELISA分析抗体对VEGF与VEGFR1(VEGF受体1)\VEGFR2（VEGF受体2）的抑制作用 

VEGF用PBS稀释至1μg/mL，包被酶联板，50μL/孔，4℃过夜包被。PBS+5%脱脂奶粉封闭酶联板。分别将重组的mFc-VEGF受体1、mFc-VEGF受体2用PBST+5%脱脂奶粉稀释至25nM、50nM。阿伐斯汀（Avastin购自德国罗氏公司）、Amv1、Amv6、Amv7、anti-p-sel-9E（无关抗体对照）用PBST+5%脱脂奶粉稀释至3000nM，并向下进行三倍梯度稀释，共稀释8个梯度。将稀释好的样品按照抗体：受体=1：1的比例混合均匀，然后加入封闭好的酶联板中，每孔加入的样品体积为50μL，37℃孵育1.5h。弃去一抗，PBST洗涤4遍，加入用PBST+5%脱脂奶粉稀释好的兔抗鼠HRP标记二抗，37℃孵育0.5h。弃去二抗，PBST洗涤4遍，PBS洗涤1遍，显色，测定OD492/630nm值。以抗体浓度的自然对数值作为横轴，以测得显色值为纵轴，做曲线。 

3.VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞KDR受体磷酸化实验 

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（购自sciencell公司，Cat No.8000）采用无血清培养基培养24h后，加入终浓度为50ng/ML的人重组VEGF165，实验组加入预先于37℃孵育1h的抗原抗体复合物，检测抗体终浓度为1μg/ML，37℃孵育2min。胰酶处理消化细胞，离心收集细胞并用细胞裂解液进行裂解，将裂解的细胞样品进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，通过Western Blot，采用抗KDR抗体（购自bioworld technology公司，货号：BS1373）和KDR磷酸化抗体（购自bioworld technology公司，货号：BS4205）为一抗，分别检测KDR受体和磷酸化的KDR受体。 

4.Western Bolt分析抗体与VEGF的相互作用 

将β巯基乙醇处理和未处理的VEGF 100ng进行SDS-PAGE电泳，之后将其转移至 硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜，分别以阿伐斯汀和Amv6为反应一抗，37℃作用1h，PBST洗涤10min，以HRP-羊抗人IgG为二抗，37℃作用1h，PBST洗涤10min后加入发光底物和显影液及定影液，进行化学发光反应。 

5.Biacore分析抗体与阿伐斯汀的竞争性抑制作用 

为获得抗VEGF抗体Amv系列抗体与阿伐斯汀及Trap12（VEGFR与人Fc融合蛋白，详细信息见Bagri A et al.,2010;Holash J et al.,2002;Lockhart AC et al.,2010）等之间的竞争关系，采用在CM5芯片（为GE公司产品）上进行竞争抑制结合的方法，使抗体Am1和阿伐斯汀分别以饱和浓度流经包被了VEGF的芯片表面，然后其他抗体分别以饱和浓度流经芯片表面，观察前一株抗体能否阻碍后面抗体与芯片上VEGF的结合。具体使用过程如下： 

取2.23μl 897μg/ML VEGF165加入到200μl的10mM醋酸钠pH 4.5，混合均匀，以此配体液偶联芯片。目标偶联量为400RU，选择用pH 1.5的甘氨酸-盐酸进行再生。通过预实验选择阿伐斯汀的上样浓度为2000nM，Trap12的浓度为1200nM，Amv系列抗体浓度为500nM。上样顺序为第一轮：以阿伐斯汀为封闭抗体，其他抗体的检测顺序为阿伐斯汀、Trap12、Amv1、Amv2、Amv3、Amv4、Amv5、Amv6和Amv7；第二轮：封闭抗体为Trap12，检测抗体的加入顺序与原来相同，第三轮封闭抗体为Amv1，其他同前一轮。依次检测抗体之间的相互封闭抑制作用。 

6.人脐静脉内皮细胞增殖实验 

（1）细胞培养：细胞采用人脐静脉内皮细胞(上海博升)完全培养基进行培养（上海博升），生长至90%以上密度时按1：4或1：5进行传代。培养细胞用的培养皿需铺0.4%的明胶。 

（2）细胞种板：96孔细胞培养板预先铺0.4%的明胶。细胞消化后用完全培养基稀释至6×10⁴个/ML，100μl/孔接种于96孔细胞培养板中。37℃，5%CO₂培养箱中培养24h。 

（3）样品稀释与加样：VEGF样品用含2%FBS的基础培养基稀释至1000ng/ML和400ng/ML，抗体用含2%FBS的基础培养基稀释至100μg/ML，并对倍稀释8个梯度。然后，每个稀释度的抗体溶液中加入等体积的VEGF样品，混匀。吸掉96孔培养板中的完全培养基，混匀后的样品立刻或4℃孵育1h后按100μl/孔加入。37℃，5%CO₂培养箱中继续培养72h。加入VEGF样品（终浓度25ng/ML）和抗体样品（终浓度为从0.4~50μg/ML）。 

（4）检测：每孔加入10μl CCK-8试剂（日本同仁），37℃，5%CO₂培养箱中培养2.5h，于450/630nm测吸光值。 

二、结果 

1．抗体对VEGF与VEGFR1和VEGFR2结合的竞争性抑制作用 

竞争性ELISA实验对Amv1和Amv6和Amv7抑制VEGF与其受体R1和R2的相互作用进行分析，结果表明（如图2所示），Amv抗体能够抑制VEGF与VEGFR2的结 合，但对VEGF与VEGFR1的结合无影响。 

2．Amv抗体对VEGF诱导的KDR受体（VEGFR2）的抑制作用 

采用50ng/ML的VEGF诱导人脐静脉内皮细胞，使内皮细胞表面的KDR受体发生磷酸化，Western Blot检测结果显示1μg/ML的Amv抗体能够完全抑制KDR受体磷酸化的发生（图3），其效果与对照抗体阿伐斯汀相同。 

3．Amv1抗体与VEGF单双体结合活性分析 

采用Western Blot分析Amv1和阿伐斯汀与VEGF结合活性，分别对未变性的VEGF双体和变性的VEGF单体的结合活性进行检测，结果表明（如图4所示），Amv1仅与VEGF双体结合，而与变性的单体不结合，而阿伐斯汀不仅能结合双体，也与变性的单体结合，说明两株抗体在与VEGF的结合位点和表位类型上有所不同，Amv抗体针对的表位可能是空间表位。 

4．Biacore分析抗体与阿伐斯汀及Trap12的竞争性抑制作用 

Amv系列抗体与阿伐斯汀及Trap12等之间的竞争关系实验结果表明，当过饱和的阿伐斯汀与VEGF结合后，进一步加入Amv系列抗体，仍可以检测到Amv抗体与VEGF的结合信号（图5A），但过饱和的Trap12可以完全封闭Amv系列抗体与VEGF的结合（图5B），而过饱和的Amv系列抗体（图5C示Amv1对其他抗体的封闭作用）可完全封闭Trap12及阿伐斯汀与VEGF的结合，表明，Amv抗体结合模式或表位与阿伐斯汀有所不同，与Trap12表位可能相同或非常接近。而Amv系列抗体间抗原表位应该相同或极为接近。 

5．人脐静脉内皮细胞增殖抑制实验 

以25ng/ML的VEGF诱导人脐静脉内皮细胞，可导致内皮细胞增殖速度明显加快，Amv系列抗体可抑制VEGF诱导的细胞增殖，且抑制效果随抗体浓度的增加呈现剂量依赖性增强，其中Amv1、Amv3、Amv6和Amv7的抑制效果达到或接近商品化的阿伐斯汀对照抗体。（图6显示为Amv1、Amv3、Amv4、Amv5、Amv6、Amv7）。 

Claims (19)

1.一种人源抗VEGF抗体，其特征在于，其轻链CDR3的氨基酸序列含有如SEQID NO.3~9中的任意一条氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，其轻链CDR1、CDR2分别含有如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其重链CDR1、CDR2和CDR3分别含有如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，其轻链CDR1氨基酸序列为RASQSVSSSYLA，其轻链CDR2氨基酸序列为GASSRAT，其轻链CDR3氨基酸序列为SEQ ID NO.3~9中的任意一条；其重链CDR1氨基酸序列为SYAMS，重链CDR2氨基酸序列为AITGTGGETYYTDSVKG、重链CDR3氨基酸序列为GWSYNGVDP。

4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，其重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别选自以下各组中的一组：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列、SEQID NO.13和SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.13和SEQID NO.18所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列、SEQID NO.13和SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1~4任一所述的抗体，其特征在于，其为单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD。

6.编码权利要求1~5任一项所述抗体的基因。

7.如权利要求6所述的基因，其特征在于，编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列选自以下各组中的一组：SEQ ID No.21和22所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.23所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.24所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.25所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.26所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.27所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.28所示的核苷酸序列。

8.含有权利要求6或7所述基因的表达载体。

9.含有权利要求8所述表达载体的宿主菌、宿主细胞或表达盒。

10.含有权利要求1~5任一项所述抗体的药物或检测试剂。

11.权利要求1~5任一项所述抗体在制备以VEGF为靶标的疾病治疗药物中的应用。

12.制备权利要求1~5任一项所述抗体的方法，其特征在于，利用噬菌体展示抗体库技术筛选抗VEGF特异性单链抗体，获得抗体轻重链可变区基因，并将其克隆入全抗体表达载体，通过哺乳动物表达系统对其进行全抗体表达，获得其全抗体蛋白。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗体轻重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示。

14.一种免疫毒素，其特征在于，包含连接于细胞毒性剂的权利要求1~5任一所述的抗体。

15.如权利要求14所述的免疫毒素，其特征在于，连接方式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。

16.如权利要求14所述的免疫毒素，其特征在于，所述细胞毒性剂包括化学分子、放射性同位素、多肽或毒素对细胞具有杀伤或诱导细胞死亡特性的物质。

17.一种双特异性或多特异性分子，其特征在于，包含权利要求1～5任一项抗体或抗体的抗原结合部位。

18.一种抗体与其他蛋白或\和多肽的融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1～5之任一项抗体和功能性蛋白或多肽分子的复合物。

19.如权利要求18所述的融合蛋白，其特征在于，将抗体基因与免疫毒素或细胞因子基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。

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