CN102994628A - 用于检测alk- 1基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测ALK-1基因突变的引物组，至少包括ALK-1基因第1到第10外显子区，3’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组和PCR测序引物组。本发明还公开了所述引物组的用途、包含所述引物组的试剂盒以及使用所述引物组对ALK-1基因进行PCR扩增方法。所述的引物组可以专一性鉴别ALK-1基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性。
Description
技术领域
本发明涉及引物，具体涉及用于检测ALK-1基因突变的引物组，本发明还涉及该引物组的用途，以及包含该引物组的试剂盒。
背景技术
活化素受体激酶1（activin receptor type Ⅱ-like kinase-1,ALK-1也称为ACVRL1）位于12q11-q14，含10个外显子，基因组全长约15kb+。它突变能引起遗传性出血性毛细血管扩张症（hereditary hemorrhagic telangiectasia HHT）或遗传性肺动脉高压（heritablepulmonary arterial hypertension PAH）。有些突变携带者同时具有两种病症。HHT是一种常染色体显性遗传性出血性疾病，以皮肤黏膜多发性毛细血管扩张伴反复出血为特征，临床上一般可分为Ⅰ型HHT和Ⅱ型HHT两种表型。其中Ⅱ型HHT由ALK-1基因突变引起，HHT-Ⅱ最常见的临床表现为反复的自发性出血或轻度创伤出血，以鼻出血最常见，而临床处理却非常棘手。
肺动脉高压是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压（meanpulmonary arterial pressure，mPAP）≥25mmHg的一组临床病理生理综合征。肺动脉高压可以作为一种疾病而独立存在，更常见的是很多疾病进展到一定阶段的病理生理表现。由于肺血管重塑引起肺循环血流动力学改变，最终可导致右心衰竭，甚至死亡。这是一种极度恶性的疾病，七成多患者是年轻人，几乎每个人都知道癌症预后差，但没有人知道肺动脉高压室一种极度恶性疾病，它的病因复杂、发病率高、误诊率高、危害性强，其愈后是灾难性的，可以说，这种病就是心血管疾病中的癌症。这种疾病平均发病年龄是36岁，75%患者集中于20-40岁年龄段，还有15%患者年龄在20岁以下，几岁的孩子也会发病。世界上该病的发病率在1×10-5～1×10-6之间，其中约6%为家族性的。
目前，ALK1基因突变的肺动脉高压患者患病年龄比骨形成蛋白2（BMPR2）基因突变的患者更加年轻化，一旦发病进展更加迅速，更加凶险。因此采用DNA检测寻找ALK-1基因突变有助于查清病因，识别家系中高风险的成员，以及未出生孩子的患病风险，这对提高人口素质，优生优育有重要的意义。对临床上指导用药，寻找病因，基因评估等具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测ALK-1基因突变的引物组。
ALK-1基因的第1到第10外显子区，3’UTR和启动子中的任意一个区域在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，都视为ALK-1基因发生了突变。因而，根据ALK-1基因第1到第10外显子区，3’UTR和启动子序列分别设计出能专一性鉴别ALK-1基因是否突变的特异性引物组。可通过PCR扩增和测序测定ALK-1基因上述区域是否发生改变，以鉴定ALK-1基因是否发生突变。因此，本发明的用于检测ALK-1基因突变的引物组可以是ALK-1基因第1到第10外显子区、3’UTR和启动子中任一区域对应的引物组。
本发明第一个目的提供的用于检测ALK-1基因突变的引物组，包括ALK-1基因第1到第10外显子区，3’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组，即选自ALK-1基因第1到第10外显子区、3’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组，具体地，所述引物组选自ALK-1基因的第1外显子区(Exon1)的PCR扩增引物组、第2外显子区(Exon2)的PCR扩增引物组、第3外显子区(Exon3)的PCR扩增引物组、第4外显子区(Exon4)的PCR扩增引物组、第5外显子区(Exon5)的PCR扩增引物组、第6外显子区(Exon6)的PCR扩增引物组、第7外显子区(Exon7)的PCR扩增引物组、第8外显子区(Exon8)的PCR扩增引物组、第9外显子区(Exon9)的PCR扩增引物组、第10外显子区(Exon10)的PCR扩增引物组、3’UTR的PCR扩增引物组和启动子的PCR扩增引物组中的任意一组，所述的上述各PCR扩增引物组为表1所示。
表1：ALK-1基因PCR扩增引物序列
本发明所述的引物组还包括ALK-1基因第1到第10外显子区、3’UTR和启动子中任一区域对应的PCR测序引物组，具体地，所述引物组包括选自ALK-1基因第1到第10外显子区、3’UTR和启动子分别对应的PCR测序引物组中的任意一组。
本发明所述的PCR测序引物组如表2所示。
表2：ALK-1基因PCR测序引物序列
本发明的第二个目的是提供使用上述PCR扩增引物组在制备通过PCR扩增自生物样品获得核酸样品检测ALK-1基因是否突变的试剂中的用途。
所述PCR扩增包括30个扩增循环反应，其条件为：
变性：温度98~94°C，
退火：温度为55~60°C，
延伸：温度72°C。
本发明中所述的PCR扩增反应中每20μl的反应体系中使用0.2~1μl的各引物和10~100ng模板DNA。
本发明PCR扩增方法还包括PCR产物纯化步骤，所述产物纯化的条件为37°C孵育60min，70°C10min。
本发明的目的之三是提供一种用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，以方便采用DNA测序技术检测导致HHT和（或）PAH疾病的ALK-1基因是否突变。
本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，包括ALK-1基因的第1到第10外显子区，3’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组，所述的各PCR扩增引物组为表1所示。
本发明所述的试剂盒还包括如表2所示的ALK-1基因的的第1到第10外显子区，3’UTR和启动子分别对应的PCR测序引物组中的一组或两组以上的PCR测序引物组。
本发明所述的试剂盒还包括常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂。
所述的PCR扩增试剂包括dNTP、Taq DNA聚合酶等。
所述的PCR产物纯化试剂包括SAP酶、ExoI酶等。
所述的DNA测序试剂包括BigDye mix、EDTA溶液和HIDI溶液等。
本发明的第四个目的是提供使用上述引物组或者试剂盒对ALK-1基因的PCR扩增方法。
本发明第四个目的是通过以下技术方案来实现的：一种使用上述引物组或者试剂盒对ALK-1基因的PCR扩增方法，取表1中所述的ALK-1基因的第1到第10外显子区，3’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上对ALK-1基因进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应包括30个扩增循环反应，其条件为：
变性：温度98~94°C，
退火：温度为55~60°C，
延伸：温度72°C。
本发明中所述的PCR扩增反应中每20μl的反应体系中使用0.2~1μl的各引物和10-100ng模板DNA。
本发明PCR扩增方法还包括PCR产物纯化步骤，所述产物纯化的条件为37°C孵育60min，70°C10min。
本发明的有益效果：
(1)本发明根据ALK-1基因的第1到第10外显子区、3’UTR和启动子，共12个区域序列设计特异性引物组，可以专一性鉴别ALK-1基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性。
(2)本发明提供的引物组及试剂盒用检测HHT和（或）PAH致病基因ALK-1基因的突变体，可以快速的检测患者的基因是否突变，可以用于疾病诊断。同时还可以用于ALK-1SNP位点与基因功能之间关系的科学研究，以及两种疾病关联方面的研究。
(3)本发明扩增的方法简单，不到两个小时可以完成PCR扩增，每个引物扩增的条件类似，可以同时进行扩增。并且扩增的条带为单一目的条带，不需要回收目的片段直接进行测序反应。
附图说明
图1是血液基因组DNA的1%的Agarose电泳图；
M：DNA DL1500maker，1、2：血基因组DNA。
图2是本发明实施例五中的血液样本中的ALK-1基因的测序峰图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例一
依据NCBI Gene Bank（NC-000012）公开的ALK-1的1~10个外显子区、3’UTR和启动子序列，设计出用于检测ALK-1基因是否发生突变的引物组，该引物组包括以上各区域的PCR扩增引物组和PCR测序引物组，结果见表1和表2。
实施例二
一种用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，包括以下成分：
ALK-1基因的第1到第10外显子区、3’UTR和启动子序列分别对应的PCR扩增引物组与PCR测序引物组，共15对，每条引物1OD，各对引物序列参见表1和表2。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例三
一种用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，包括以下成分：
（1）ALK-1基因第1到第10外显子区、3’UTR和启动子序列分别对应的PCR扩增引物组与PCR测序引物组，共15对，每条引物1OD，各对引物序列参见表1和表2。
（2）PCR扩增试剂：2.5mM dNTP混合液40μl、5×扩增缓冲液(含Mg2+)100μl、5Units/ul Taq DNA聚合酶5μl。
(3)PCR产物纯化试剂：1U/ul SAP酶20μl、10U/ul ExoI酶10μl。
（4）PCR测序试剂：BigDye3.1mix50μl、EDTA溶液（0.125M）50μl、无水乙醇1ml、乙醇溶液（75%）1.5mL、HIDI溶液500μl。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例四
一人份检测ALK-1基因突变的试剂盒的使用步骤：
（1）一份病人的血液1mL，提取血液基因组DNA，使用QIAamp DNA Blood MiniKit(250)Cat.no.51104提取基因组DNA，该基因组DNA为模板DNA。1%Agarose凝胶电泳，结果见附图1。
（2）PCR扩增：15对引物共进行15个PCR反应，每个反应体系总体积为20ul，其中，
PCR循环的反应条件为：
（3）PCR产物纯化：共进行15个PCR纯化反应，每个反应体系总体积20μl，包括
（4）DNA测序反应：共进行15个测序反应。每个反应的体系包括
PCR纯化产物 1~2μl
BigDye3.1mix 2μl
DNA测序引物(0.4μM) 2μl
反应条件为：
（5）反应结束后纯化测序产物，即分别在每个反应体系加入1μl 0.125M的EDTA和15μl的乙醇，常温放置15min，4°C1000g/min离心30min，小心倒去上清，加入75%乙醇溶液，4°C1000g/min离心15min，小心倒去上清；室温放置20min。晾干后在管中加入Hi-Di去离子甲酰胺10μl，放入测序仪中。测序产物上ABI3130XL测序仪，测序文件用Polyphred软件分析，并结合人工校对记录后整理出结果。如果所得测序结果中，ALK-1基因第1到第10外显子区、3’UTR和启动子序列中任一区域的结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，认为ALK-1基因发生了突变，反之则没有发生突变。
实施例五
与实施例四不同的是：
（2）PCR扩增：15对引物共进行15个PCR反应，每个反应体系总体积为20ul，包含基因组DNA（10ng/μl）1μl、dNTP混合液（2.5mM each）1μl、5×扩增缓冲液(含Mg2+)4μl、上下游引物（10μM）各0.5μl，Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，去离子水12.8μl。反应条件为反应条件为：98°C反应5s；98°C反应15s，60°C反应40s，72°C反应1mins，共30个循环反应；最后72°C延伸反应2min。
测序结果如图2所示，箭头指出的位置及两旁有明显双峰，说明是此样本在外显子9的这三个位点有突变，即突变碱基为c.1365G>A c.1366G>A c.1367C>A氨基酸突变为p.Ala456Asn。
本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制，本发明的试剂盒还可以是ALK-1基因第1到第10外显子区、3’UTR和启动子中任一序列对应的PCR扩增引物组和PCR测序引物组，每条引物1OD；或者是上述引物组中的两组以上的组合。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.用于检测ALK-1基因突变的引物组，其特征在于，包括ALK-1基因的第1到第10外显子区，3’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组包括:
所述启动子的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物PF1和具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的引物PR1的引物组、具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的引物PF2和具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的引物PR2的引物组；
所述Exon1的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物PF3和具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的引物PR3的引物组；
所述Exon2的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的引物PF4和具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的引物PR4的引物组；
所述Exon3的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的引物PF5和具有SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列的引物PR5的引物组；
所述Exon4的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的引物PF6和具有SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列的引物PR6；
所述Exon5的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的引物PF7和具有SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列的引物PR7的引物组；
所述Exon6的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的引物PF8和具有SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列的引物PR8的引物组；
所述Exon7的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的引物PF9和具有SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列的引物PR9的引物组；
所述Exon8的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列的引物PF10和具有SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列的引物PR10的引物组；
所述Exon9的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列的引物PF11和具有SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的引物PR11的引物组；
所述Exon10的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物PF12和具有SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物PR12的引物组；
所述3’UTR的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列的引物PF13和具有SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列的引物PR13的引物组、具有SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的引物PF14和具有SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的引物PR14的引物组、具有SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的引物PF15和具有SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的引物PR15的引物组。
2.根据权利要求1所述的用于检测ALK-1基因突变的引物组，其特征在于，还包括ALK-1基因的第1到第10外显子区，3’UTR和启动子中任一区域对应的PCR测序引物组，所述的PCR测序引物组包括：
所述启动子的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物PF1和具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的引物PF2；
所述Exon1的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物PF3；
所述Exon2的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的引物PF4；
所述Exon3的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的引物PF5；
所述Exon4的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的引物PF6；
所述Exon5的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的引物PF7；
所述Exon6的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的引物PF8；
所述Exon7的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的引物PF9；
所述Exon8的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列的引物PF10；
所述Exon9的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列的引物PF11；
所述Exon10的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物PF12；
所述3’UTR的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列的引物PF13、具有SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的引物PF14和具有SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的引物PF15。
3.权利要求1所述的PCR扩增引物组在制备通过PCR扩增自生物样品获得核酸样品检测ALK-1基因是否突变的试剂中的用途。
4.包含权利要求1的引物组的用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，其特征在于，包括ALK-1基因的第1到第10外显子区，3’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组如权利要求1所示。
5.根据权利要求4所述的用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，其特征在于，还包含有权利要求2所述的PCR测序引物组。
6.根据权利要求4或5所述的用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂。
7.一种使用权利要求1或2所述的引物组或者权利要求4或5所述的试剂盒对ALK-1基因的PCR扩增方法，其特征在于，取所述的ALK-1基因的第1到第10外显子区，3’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组对ALK-1基因进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应包括30个扩增循环反应，其条件为：
变性：温度98~94°C，
退火：温度为55~60°C，
延伸：温度72°C。
8.根据权利要求7所述的ALK-1基因的PCR扩增方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应中每20μl的反应体系中使用0.2~1μl的各引物和10-100ng模板DNA。
9.根据权利要求7或8所述的ALK-1基因的PCR扩增方法，其特征在于，还包括PCR产物纯化步骤，所述产物纯化的条件为37°C孵育60min，70°C10min。
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