ES2865339T3 - Procedimiento de evaluación del riesgo de complicaciones en los pacientes que presentan un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) - Google Patents

Abstract

Procedimiento de evaluación in vitro o ex vivo del riesgo de complicación en un paciente que ha sufrido una agresión o una infección, generando dicha agresión o infección un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, caracterizado por que comprende la detección, preferentemente la cuantificación, en una muestra biológica procedente de dicho paciente, de por lo menos un transcrito del gen IL7R correspondiente al transcrito IL7R-001 de SEC ID nº 2 o a una de sus variantes, presentando la secuencia de una variante por lo menos el 99% de identidad con dicha secuencia, y correspondiendo preferentemente al transcrito IL7R-001 de SEC ID nº 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de evaluación del riesgo de complicaciones en los pacientes que presentan un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS)

La presente invención se refiere al campo médico en general, y en particular al campo de la predicción de riesgos. Más precisamente, la invención se refiere a un procedimiento de evaluación del riesgo de complicación en un paciente que ha sufrido una agresión, tal como cirugía, quemadura, traumatismo, etc., que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica o SIRS o en un paciente que ha sufrido una infección que provoca un SIRS, y en particular en un paciente en estado séptico, es decir, un paciente que presenta una sepsis, en particular una sepsis severa, también denominada sepsis grave, y preferentemente en un paciente en choque séptico o que ha sufrido un choque séptico.

En el caso de un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica o SIRS, los riesgos de complicaciones, del tipo infección secundaria o infección nosocomial en caso de una hospitalización, y el riesgo de muerte son importantes.

Las infecciones nosocomiales, en particular, son un problema de salud pública importante. Los pacientes hospitalizados suelen tener, por naturaleza, las defensas inmunitarias disminuidas o alteradas, debido a patologías que afectan directamente a sus competencias inmunitarias, o debido a su estado general. Estos pacientes, y en particular las personas desnutridas o de edades extremas de la vida (personas mayores, lactantes) son especialmente sensibles a las infecciones en general, y en particular a la aparición de infecciones nosocomiales. La prevalencia de las infecciones nosocomiales es claramente más elevada en las unidades de reanimación que en otros sectores hospitalarios.

Por otro lado, entre los síndromes de respuestas inflamatorias sistémicas o SIRS, la sepsis es un síndrome de respuesta sistémica inflamatoria relacionada con una infección. Una sepsis grave es una sepsis asociada a una hipotensión arterial y/o hipoperfusión y/o a la disfunción de por lo menos un órgano. El choque séptico es una sepsis grave asociada a una hipotensión persistente a pesar de los rellenos adecuados y de los tratamientos vasopresores. La diferencia entre sepsis, sepsis grave y choque séptico, reside principalmente en la importancia de la perturbación de todas las funciones vitales.

Los pacientes que presentan SIRS, y en particular los que presentan síndromes sépticos, es decir, los pacientes en estado séptico que van desde la sepsis, sepsis grave, choque séptico, presentan un gran riesgo de complicaciones, en particular de infecciones nosocomiales. Además, los estados sépticos corresponden a una de las principales causas de mortalidad en las unidades de reanimación.

Estimar el riesgo de complicación de un paciente ingresado en el servicio de reanimación o en otros servicios, por ejemplo en caso de la cirugía, en particular una cirugía mayor o trasplante, que presenta un SIRS, y en particular, una sepsis, una sepsis grave o en estado de choque séptico, es por lo tanto esencial para poder ofrecer una atención personalizada, e intentar así reducir los riesgos de complicación, y en particular de muerte.

La gravedad del estado de un paciente ingresado en el servicio de reanimación se estima generalmente con la ayuda de diferentes parámetros clínicos y fisiológicos. Estos permiten definir en particular unas puntuaciones predictivas en términos de supervivencia/mortalidad, entre las cuales se pueden citar las puntuaciones de gravedad SOFA por Sequential Organ Failure Assessment o Sepsis-related Organ Failure Assessment (Vincent et al., 1996) y SAPSII por Simplified Acute Physiology Score II), denominada también en francés IGS II por Indice de Gravité Simplifié II (Le Gall et al., 1993). Estas puntuaciones compuestas, definidas sobre unas cohortes consecuentes de pacientes de reanimación, incluyen varios parámetros clínico-biológicos, tales como el número de plaquetas circulantes, la bilirrubinemia, la diuresis, la edad o la temperatura corporal. Estas puntuaciones permiten evaluar por el cálculo de un valor numérico el grado de afección de la función de uno o de varios sistemas fisiológicos (por ejemplo: cardiovascular, renal, cerebral). Se calculan durante los primeros días de ingreso en reanimación. En el caso de la puntuación SAPSII, solo se tiene en cuenta el valor más deletéreo de los parámetros incluidos en la puntuación, medido durante las 24 primeras horas de estancia en reanimación.

Estas puntuaciones son sin embargo poco prácticas en rutina clínica ya que necesitan, por parte del médico, un enfoque activo de búsqueda de los parámetros clínicos en el informe del paciente.

Así, existe una necesidad real de disponer de otras herramientas, y en particular de marcadores medibles, que permitan evaluar fácil y rápidamente el riesgo de complicación, y en particular de mortalidad de un paciente ingresado en el servicio de reanimación que por definición está en un estado grave, y en el que el pronóstico vital se puede eventualmente iniciar rápidamente. En efecto, poder identificar a los sujetos cuyo riesgo de complicación, incluso de mortalidad, está incrementado permitiría reservarles un tratamiento, un seguimiento, así como unas terapias, más adaptados.

La solicitud WO 2013/140103 propone un procedimiento de determinación de la susceptibilidad a las infecciones nosocomiales en un paciente, que comprende las etapas siguientes:

- medir la expresión de sCD127 a nivel proteico en una muestra biológica procedente de dicho paciente o muestra a analizar,

- concluir en una susceptibilidad incrementada a las infecciones nosocomiales tras la comparación de la expresión de sCD127 con respecto a un valor de referencia.

La solicitud WO 2015/040328 describe, por su parte, un procedimiento de evaluación del riesgo de mortalidad en un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera una respuesta inflamatoria sistémica, que comprende las etapas siguientes:

- medir la expresión de sCD127 a nivel proteico en una muestra biológica procedente de dicho paciente, denominada asimismo muestra a analizar,

- concluir en un riesgo incrementado de mortalidad tras la comparación de la expresión de sCD127 con respecto a un valor de referencia.

El sCD127 es la forma soluble o plasmática del CD127, también denominado cadena alfa del receptor de la IL-7 o IL-7R-ALPHAo IL-7RA o CDw127 (UniProtKB P16871). El CD127 es una glicoproteína de 75 kDa miembro de la superfamilia de los receptores de los factores de crecimiento hematopoyéticos. Se expresa a nivel membranario y se asocia con el CD132 (cadena Yc común) para formar el receptor de la IL-7. Este receptor desempeña un papel importante en la diferenciación, la supervivencia y la proliferación linfocitaria. El CD127 está constituido por una parte extracelular de 219 aminoácidos (aa), por una parte transmembrana de 25 aa y por una parte intracitoplasmática de 195 aa (Jiang et al., 2005). Como para muchos receptores de citocinas, se ha demostrado que el CD127 puede estar presente en el plasma o el suero en forma soluble, denominada "sCD127" (Carini et al., 1994; Vranjkovic et al., 2007). Por "sCD127" se entiende la forma soluble o forma circulante (también denominada forma plasmática o sérica) del receptor de la IL-7. Los mecanismos en el origen de la liberación de la forma soluble están poco descritos y los resultados de la bibliografía son contradictorios. De esta manera, los trabajos de Vranjkovic et al., 2007 conducen a la conclusión de que la forma soluble procedería de una escisión de la forma membranaria. Por el contrario, Goodwin et al., 1990 así como Rose et al., 2009, concluyen en una regulación de la transcripción, a través de un corte y empalme alternativo del ARN del gen IL7R que codifica para CD127.

La solicitud WO 2009/115478 describe, por su parte, un procedimiento de detección y de diferenciación in vitro de diferentes estados fisiopatológicos. El procedimiento de detección descrito en este documento se define en particular en la reivindicación 1 y utiliza la detección de varios marcadores polinucleotídicos. Se citan diferentes estados fisiopatológicos, incluido el SIRS, la sepsis, el choque séptico. Pero se trata de detección in vitro, de diferenciación o de observación de un progreso y no de la evaluación de un riesgo que se refiere, por lo tanto, a un estado futuro. El gen de la IL7R se cita entre 669 polinucleótidos. En los ejemplos (véanse las tablas 10, 11, 13b, 15, 17, 18a y 18b), los marcadores se utilizan como marcadores de identificación de sujetos en estado de SIRS o sepsis, como se desprende del título del ejemplo 3 en particular. Estos ejemplos no se refieren de ninguna manera a un procedimiento de evaluación in vitro o ex vivo del riesgo de complicación en un paciente que ha sufrido una agresión o infección, sino al diagnóstico de SIRS o sepsis.

El gen IL7R está compuesto por 8 exones, codificando el exón 6 para el dominio transmembranario. En particular, la secuencia nucleica de referencia para el gen IL7R es la SEC ID n° 1 (Ensembl: ENSG00000168685).

Existen varios transcritos del gen IL7R, censados en la base Ensembl (GRCh38.p3), representados en la figura 1 y listados en la tabla 1. El transcrito IL7R-001 comprende el exón 6 y corresponde por lo tanto a la forma proteica membranaria de CD127. Todos los demás transcritos que teóricamente pueden desembocar en la traducción de una proteína no comprenden el exón 6 y corresponden por lo tanto potencialmente a unas formas solubles de CD127.

Tabla 1. Los diferentes transcritos del gen IL7R según la base Ensembl (GRCh38.p3)

Nombre del Número de SEC ID n° Tamaño teórico Observación experimental transcrito identificación de proteína de la proteína

IL7R-001 ENST00000303115 SEC ID n° 2 459 aa Sí (Goodwin et al., 1990;

NM 002185 Park et al., 1990)

IL7R-002 ENST00000514217 SEC ID n° 3 180 aa No (Rose et al., 2009) IL7R-003 ENST00000506850 SEC ID n° 4 261 aa Sí (Rose et al., 2009) IL7R-004 ENST00000508941 SEC ID n° 5 59 aa No

IL7R-005 ENST00000511031 SEC ID n° 6 No codificante No

IL7R-006 ENST00000515665 SEC ID n° 7 52 aa No

IL7R-007 ENST00000511982 SEC ID n° 8 150 aa No

IL7R-008 ENST00000509668 SEC ID n° 9 No codificante No

IL7R-009 ENST00000505875 SEC ID n° 10 No codificante No

IL7R-010 ENST00000505093 SEC ID n° 11 65 aa No

El estudio de Rose et al., 2009 permitió demostrar en particular que la secuencia de la forma proteica soluble sCD127 purificada a partir de plasma correspondía a la forma obtenida tras la traducción del transcrito IL7R-003. Según este estudio, la proteína soluble no procedía de la traducción del transcrito IL7R-002, ni de una escisión de la forma proteica membranaria.

Hasta la actualidad, no se han observado experimentalmente unas formas proteicas solubles correspondientes a los transcritos que pueden ser potencialmente traducidos, IL7R-002, IL7R-004, IL7R-006, IL7R-007 e IL7R-010.

En el marco de la invención, los inventores de la presente solicitud de patente proponen un procedimiento para la evaluación in vitro o ex vivo del riesgo de complicación en un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que adopta otra solución distinta a la detección de proteínas solubles, que se basa en la evaluación de uno o varios transcritos del gen IL7R. Los inventores han demostrado que, en el caso de los transcritos, no era útil ni preferido limitarse a los transcritos que codifican para la parte soluble sCD127 del CD127.

Es en este contexto donde la presente invención propone proporcionar un nuevo biomarcador predictivo de un riesgo de complicación, y en particular de mortalidad, en un paciente que ha sufrido una agresión grave (cirugía, quemadura, traumatismo, etc.) o infección, generando dicha agresión o infección un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS). El estudio de la cantidad de uno o varios transcritos del gen IL7R permite evaluar así, fácil y rápidamente, el riesgo de complicación y, en particular, de mortalidad del paciente y adoptar todas las disposiciones preventivas posibles. La invención se refiere a un procedimiento de evaluación in vitro o ex vivo del riesgo de complicación en un paciente que ha sufrido una agresión o una infección, generando la agresión o infección un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, en el que se realiza la detección, preferentemente la cuantificación, en una muestra biológica procedente de dicho paciente, de por lo menos un transcrito del gen IL7R.

En el sentido de la invención, se entiende por "síndrome de respuesta inflamatoria sistémica" o "SIRS" una respuesta que asocia por lo menos dos de los criterios siguientes: Temperatura > 38°C o < 36°C, Frecuencia cardíaca > 90/minuto, Frecuencia respiratoria > 20/minuto o paCO2 < 32 mmHg, Leucocitos > 12000/mm3 o < 4000/mm3 (Bone et al., 1992). Un SlRS puede deberse a una infección o a otro tipo de agresión del tipo quemadura, cirugía o traumatismo, en particular. Las sepsis, las sepsis graves y los choques sépticos corresponden todos a un SIRS debido a una infección. En estos pacientes en estado séptico (sepsis, sepsis grave y choque séptico), que presentan por lo tanto un SIRS tras una infección, dicha infección que ha provocado el SIRS puede ser de diversos orígenes, y en particular de origen bacteriano, viral o fúngico. En el caso de las sepsis graves y choques sépticos, el SIRS está acompañado de por lo menos otra manifestación, que es en el caso de las sepsis graves, una hipotensión arterial y/o una hipoperfusión y/o una disfunción de por lo menos un órgano, al que (a los que) se añade, en el caso de un choque séptico, una hipotensión persistente a pesar de los llenados adecuados y que requiere la utilización de tratamientos vasopresores.

Un paciente que presenta un SIRS es ingresado generalmente en reanimación cuando su estado implica un seguimiento continuo de las funciones vitales y, llegado el caso, recurrir a unos procedimientos de suplencia (transfusión de derivados sanguíneos, relleno vascular, ventilación mecánica, catecolaminas, hemodiálisis, circulación extracorporal, etc.). El objetivo final de la reanimación es la restauración de la homeostasis.

Por "complicación" se entiende una infección, distinta de la que ha podido causar el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, siendo dicha infección denominada entonces secundaria, o bien una infección primaria cuando el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica es causado por una agresión distinta de una infección, o también se entiende por "complicación", la muerte del paciente. Dicha infección primaria o secundaria puede ser nosocomial o no. Las infecciones nosocomiales se contraen exclusivamente en el caso de una hospitalización y aparecen por lo menos 48 horas después de dicha hospitalización.

Por "riesgo de complicación" se entiende la susceptibilidad de un paciente de generar una infección primaria o secundaria, o la susceptibilidad que tiene el paciente de morir. La presencia de un riesgo de complicación corresponde al riesgo de que aparezca la complicación, por ejemplo en los 60 días, en particular en los 40 días, en particular en los 30 días, siguientes al ingreso en reanimación de un paciente que padece un SIRS o al inicio del choque séptico en el caso de un paciente en estado de choque séptico o que ha pasado por un estado de choque séptico, y en particular o también, corresponde al riesgo de que la complicación aparezca durante todo el tiempo de la estancia en reanimación, o incluso de hospitalización.

El procedimiento según la invención puede ser por lo tanto un procedimiento de evaluación de la susceptibilidad del paciente de generar una infección (que será primaria en el caso de un paciente que ha sufrido una agresión, y no una infección, que ha generado el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica y que será secundaria en el caso de un paciente que ha sufrido una primera infección origen del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica). En este caso, el procedimiento según la invención permitirá llegar a una conclusión en cuanto a la presencia o no de un riesgo para el paciente de generar dicha infección.

El procedimiento según la invención es un procedimiento realizado in vitro o ex vivo. Tiene la ventaja de poder evaluar fácilmente el riesgo de complicación, y en particular de mortalidad, en particular de un paciente que es ingresado en el servicio de reanimación, disponiendo de un marcador directamente medible, contrariamente a las puntuaciones de gravedad SOFA y SAPSII, por ejemplo, y cuya medición se puede realizar en un laboratorio cercano o en la cama del paciente. La medición de la cantidad de uno o varios transcritos del gen IL7R está perfectamente adaptada para ser realizada por unos autómatas de análisis o por unas pruebas rápidas.

De manera preferida, dicho paciente está en estado séptico, en particular en sepsis grave o en choque séptico. Este estado corresponde al estado del paciente en el momento de la extracción de la muestra a analizar o aun estado en el que ha estado el paciente, de manera cercana en el tiempo, con respecto a la extracción de la muestra a analizar, en particular en los 6 días previos a la extracción de la muestra a analizar. En el caso de una sepsis, sepsis grave o choque séptico en particular, es posible que el paciente esté en este estado, en particular cuando tiene lugar su ingreso en el servicio de reanimación y que la sepsis, sepsis grave o choque séptico haya cesado en el momento de la extracción de la muestra a analizar. En la continuación de la descripción, se dirá entonces que en este caso, el paciente ha sufrido o ha estado en un estado de choque séptico, sepsis o sepsis grave según el caso. En particular, en el procedimiento según la invención, la muestra biológica a analizar procede de un paciente que presenta una sepsis, en particular una sepsis grave o que ha presentado una sepsis, en particular una sepsis grave en los 6 días previos a la extracción de la muestra biológica a analizar, o bien la muestra biológica a analizar procede de un paciente en estado de choque séptico o que ha pasado por un estado de choque séptico en los 6 días previos a la extracción de la muestra biológica a analizar.

El procedimiento según la invención está adaptado asimismo perfectamente para unos pacientes con un SIRS, debido a una agresión distinta de una infección, en particular una cirugía, una quemadura o un traumatismo.

Preferentemente, el riesgo de complicación evaluado en el marco de la invención es el riesgo de muerte del paciente. Por lo tanto, el procedimiento según la invención puede ser un procedimiento de evaluación de la susceptibilidad del paciente de morir. En este caso, el procedimiento según la invención permitirá llegar a una conclusión en cuanto a la presencia o no de un riesgo de muerte para el paciente. En el caso de la predicción del riesgo de muerte, este riesgo será evaluado para una muerte que ocurra en los 60 días, en particular en los 40 días, en particular en los 30 días, en particular en los 28 días siguientes al ingreso del paciente en el servicio de reanimación y en particular, para una muerte susceptible de ocurrir durante todo el tiempo de estancia en reanimación, incluso de hospitalización. Como se ha indicado anteriormente, la presente invención tiene una aplicación preferida en los pacientes que presentan una sepsis, en particular una sepsis grave, o también en los pacientes en choque séptico o que han sufrido un choque séptico. Preferentemente, el procedimiento según la presente invención se utiliza para evaluar el riesgo de mortalidad en dichos pacientes. De manera particularmente preferida, el procedimiento según la presente invención es ventajoso muy particularmente para evaluar el riesgo de mortalidad en un paciente que está o ha pasado por un estado de choque séptico. En este caso, el riesgo de muerte se evaluará para una muerte que ocurra en los 60 días, en particular en los 40 días, en particular en los 30 días, en particular en los 28 días siguientes al inicio del choque séptico, y en particular, para una muerte susceptible de ocurrir durante todo el tiempo de la estancia en reanimación, incluso de hospitalización.

Preferentemente en el marco de la invención, dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que es detectado, y preferentemente cuantificado, se selecciona de entre los transcritos IL7R-001 de SEC ID n° 2, IL7R-002 de SEC ID n° 3, IL7R-003 de SEC ID n° 4, IL7R-005 de SEC ID n° 6 e IL7R-007 de SEC ID n° 8 y sus variantes, presentando la secuencia de una variante por lo menos el 99% de identidad con una de dichas secuencias. El porcentaje de identidad se determina gracias a un programa de alineación de secuencias, tal como CLUSTALW (Nucleic Acid Res. 11 de noviembre de 1994; 22(22):4673-80. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Una variante corresponderá, en particular, a un polimorfismo de la secuencia del gen IL7R. En particular, dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R se selecciona de entre los transcritos que comprenden por lo menos una parte del dominio transmembranario, incluso todo el dominio transmembranario, de CD127, y corresponde preferentemente al transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2 o a una de sus variantes que presentan por lo menos el 99% de identidad con dicha secuencia. El transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2 tiene la ventaja de ser detectado en gran cantidad, con respecto a otros transcritos, lo cual facilita la realización del procedimiento según la invención, en el caso de la detección de por lo menos este transcrito.

Por "transcrito" se entiende los ARN, y en particular los ARN mensajeros resultantes de la transcripción del gen IL7R. Más precisamente, los transcritos son los ARN producidos por el corte y empalme el gen. En el marco de la invención, el o los transcritos del gen IL7R detectados y/o cuantificados son por lo tanto, preferentemente, un ARNm.

En particular, un procedimiento según la invención realiza las etapas que consisten en:

i) determinar la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R en dicha muestra biológica del paciente, denominada muestra a analizar,

ii) comparar la cantidad de dicho por lo menos un transcrito determinada para dicha muestra biológica o un valor derivado de esta cantidad, con un valor de referencia predeterminado, y

iii) llegar a una conclusión en cuanto a la presencia eventual de un riesgo de complicación, a partir del resultado de la comparación.

Es posible, en el marco de la invención, detectar y cuantificar varios transcritos del gen IL7R, y en particular detectar y cuantificar los transcritos IL7R-001 de SEC ID n° 2, IL7R-002 de SEC ID n° 3, IL7R-003 de SEC ID n° 4, IL7R-005 de SEC ID n ° 6e IL7R-007 de SEC ID n° 8.

Si en el marco de la invención se detectan varios transcritos del gen IL7R, el procedimiento realizará, en particular, las etapas que consisten en:

i) determinar la cantidad total de varios transcritos del gen IL7R en dicha muestra biológica del paciente,

ii) comparar la cantidad total de dichos transcritos determinada para dicha muestra biológica o un valor derivado de esta cantidad, con un valor de referencia predeterminado, y

iii) llegar a una conclusión en cuanto a la presencia eventual de un riesgo de complicación, a partir del resultado de la comparación.

En el marco de la invención, se detecta por lo menos un transcrito del gen IL7R, en una muestra biológica procedente de un paciente, para el que se desea evaluar un riesgo de complicación, denominada muestra a analizar. El resultado de esta detección se comparará con un valor de referencia, con el fin de evaluar los riesgos de complicación.

Así, en todos los casos, además de la medición de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R propiamente dicha, en la muestra a analizar, el procedimiento de la invención puede comprender la obtención previa del valor de referencia, con el que se podrá comparar la cantidad de dicho por lo menos un transcrito determinada que será detectada en la muestra a analizar o un valor derivado de esta cantidad, con el fin de llegar a una conclusión en cuanto al riesgo de complicación, en el paciente del que procede la muestra a analizar. Asimismo, es posible que este valor de referencia esté disponible, en el futuro, cuando tiene lugar la realización del procedimiento de la invención.

El valor de referencia se determinará a partir del o de los mismos transcritos del gen IL7R, que el o los detectados o cuantificados en la muestra biológica a analizar. Sin embargo, se podrá determinar en una muestra biológica diferente pero del mismo tipo, procedente del mismo paciente o de otro paciente o acervo de pacientes. Cuando se utilizan una o unas muestras procedentes de un paciente de referencia o acervo de pacientes de referencia para determinar el valor de referencia, tendrán, preferentemente, el mismo tipo de SIRS (en particular sepsis, sepsis grave o choque séptico) que el paciente para el que se desea realizar el procedimiento.

La muestra a analizar en el marco del procedimiento de la invención es una muestra biológica procedente del paciente en el que se desea evaluar el riesgo de complicación. En particular, dicha muestra biológica se selecciona de entre las susceptibles de contener unos transcritos del gen IL7R. Por ejemplo, la muestra a analizar procede de una extracción obtenida en los 6 días o 6 días (D6) siguientes al ingreso en el servicio de reanimación de un paciente con un SIRS, preferentemente en los 5 días o 5 días (D5) siguientes al ingreso en el servicio de reanimación, preferentemente en los 4 días o 4 días (D4) siguientes al ingreso en el servicio de reanimación, más preferentemente en los 3 días o 3 días (D3) siguientes al ingreso en el servicio de reanimación, o en los dos días o 2 días (D2) siguientes al ingreso en el servicio de reanimación, o incluso en las 24 horas o 24 h (D1) siguientes al ingreso en el servicio de reanimación. En el caso de que el SIRS corresponda a un choque séptico, estos plazos se calcularán más bien a contar desde el inicio del choque séptico, que puede estar definido por el inicio de la administración al paciente de catecolaminas. Por eso, en el caso de pacientes en estado de choque séptico o que han presentado un choque séptico, la muestra a analizar procede preferentemente de una extracción obtenida en los 6 días o 6 días (D6) siguientes al inicio del choque séptico, preferentemente en los 5 días o 5 días (D5) siguientes al inicio del choque séptico, preferentemente en los 4 días o 4 días (D4) siguientes al inicio del choque séptico, más preferentemente dentro de 3 días o 3 días (D3) siguientes al inicio del choque séptico, o de manera más preferida en los dos días o 2 días (D2) siguientes al inicio del choque séptico, o también en las 24 h o 24 h (D1) siguientes al inicio del choque séptico. Dicho de otra manera, la muestra a analizar procede, preferentemente, de una extracción efectuada en el paciente para el cual se desea evaluar un riesgo de complicación, en los 6 días, en los 5 días, en los 4 días, en los 3 días, en los 2 días, o en las 24 h, en particular 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días o 24 horas, siguientes al ingreso en el servicio de reanimación o a la aparición del choque séptico, respectivamente.

En el caso de que se aplique el procedimiento según la invención, no a un paciente ingresado en el servicio de reanimación, sino a un paciente que ha sufrido una cirugía, en particular cirugía mayor (de tipo cardíaco o abdominal por ejemplo) o trasplante, cuyo seguimiento está asegurado en un servicio diferente a un servicio de reanimación, los tiempos indicados en el marco de la descripción de la invención para las extracciones en cuestión serán calculados, no a partir del ingreso en el servicio de reanimación, sino a partir del inicio de la cirugía.

En el marco de la invención, es posible asimismo para la comparación realizada en la etapa Ni) utilizar una relación entre la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica de dicho paciente que corresponde a una extracción en un momento t (en particular en los 3 días o a los 3 días (D3)) y la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica de dicho paciente que corresponde a una muestra en un momento t' (en particular en las 24 horas o a las 24 horas (D1)).

Las muestras sobre las que se realiza el procedimiento de la invención, también denominadas muestras a analizar, serán de origen humano.

La muestra a analizar puede ser un fluido biológico, por ejemplo seleccionado de entre la sangre, sangre completa, en particular tal como la recogida de la vía venosa, es decir que contiene los glóbulos blancos y rojos, las plaquetas y el plasma, o también una muestra de suero o de plasma, así como unos componentes de dichos fluidos, como las células mononucleares de la sangre periférica o PBMC ("Peripheral Blood Mononuclear Cells"), o unas vesículas excretadas tales como unas células o unos cuerpos apoptóticos, unas vesículas excretadas, que comprenden en particular unos exosomas y unas microvesículas. Las muestras biológicas preferidas, ya se trate de las muestras biológicas a analizar o unas muestras utilizadas para determinar el valor de referencia, son, preferentemente, unas muestras de sangre completa o de PBMC.

Las muestras a partir de las cuales se pueden determinar los valores de referencia, también denominadas "muestras de referencia", pueden ser de diferentes naturalezas, y en particular de naturaleza biológica tal como se ha mencionado anteriormente cuando se trataba de la muestra a analizar (fluidos biológicos), o no, en particular unas muestras sintéticas que contienen una cantidad calibrada de transcritos seleccionados. Ventajosamente, si estas muestras de referencia son unas muestras biológicas, serán de la misma naturaleza que la de la muestra biológica a analizar o por lo menos de una naturaleza compatible para constituir una referencia en cuanto a la detección y/o la cuantificación del o de los transcritos del gen IL7R seleccionados. En particular, en el caso de una realización del procedimiento en sujetos humanos, una muestra biológica de referencia será una muestra biológica humana. Se utilizarán asimismo, preferentemente, unas muestras biológicas correspondientes al mismo fluido biológico o mismos componentes, por ejemplo, unas muestras de sangre completa, a la vez para la muestra a analizar y para la muestra de referencia.

Cualquier procedimiento de detección y/o de cuantificación de un transcrito bien conocido por el experto en la materia se puede utilizar para la realización de la invención. En particular, dichos procedimientos utilizan uno o varios socios de enlace para el o los transcritos seleccionados.

Se sabe que, de manera general, los resultados de las pruebas de detección de analitos dependen en gran medida de las características del o de los socios de enlace utilizados. Así, en el caso de la detección de ARN por hibridación con unas sondas nucleotídicas, los resultados dependen en particular de las características de tamaño, de composición y de porcentaje de complementariedad de las sondas, y que estas características influyen en los valores medidos con estas sondas. Se concibe por lo tanto que no es posible proporcionar unos valores de referencia precisos y que el o los valores de referencia adaptados para cada socio de enlace utilizado se pueden determinar en cada caso mediante simples experimentos de rutina.

En particular, se elegirá el valor de referencia, en función del procedimiento utilizado para determinar la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R y será representativo de la población de la que procede el paciente para el que se desea evaluar el riesgo.

El experto en la materia sabrá determinar el valor de referencia con el que se debe comparar la cantidad de dicho por lo menos un transcrito determinada para dicha muestra biológica o el valor derivado de esta cantidad utilizada para la comparación, en función de la comparación a efectuar. En particular, para determinar este valor de referencia se podría utilizar una prueba estadística adaptada. Por ejemplo, es posible efectuar la comparación entre unas poblaciones o tipos de muestras diferentes, a partir de la evolución en el tiempo de una misma población o de un mismo tipo de muestra. Es preciso comprender que en la presente memoria se denomina valor de referencia o bien a un valor discreto, o bien a un intervalo de valores correspondientes a una zona de indeterminación. Evidentemente, cuando el valor medido está incluido en el intervalo de indeterminación, o está muy cerca del valor de referencia en el caso de un valor discreto, no se puede concluir definitivamente y es conveniente realizar unas investigaciones suplementarias.

En el marco de la invención, el valor de referencia se puede determinar de diferentes maneras: en particular, o bien se obtiene el valor de referencia a partir de una muestra de referencia procedente del mismo paciente y obtenida en una extracción anterior, o bien se obtiene el valor de referencia a partir de una muestra de referencia de un individuo de referencia o de muestras de referencia de una población de referencia.

Un valor de referencia obtenido a partir de una muestra de referencia procedente del mismo paciente obtenida en una extracción anterior se denominará valor de referencia interno. Un valor de referencia obtenido a partir de una muestra de referencia de un individuo de referencia o de muestras de referencia de una población de referencia se denominará valor de referencia externo.

Un valor de referencia interno puede corresponder a, o derivarse de, dicha cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R medida en una muestra biológica procedente del mismo dicho paciente en una extracción anterior, es decir en una muestra biológica procedente del paciente en el que se desea evaluar el riesgo de complicación y obtenida anteriormente con respecto a la muestra a analizar. Por "anterior" o "anteriormente" se entiende de manera más temprana en el tiempo.

Preferentemente, un valor de referencia interno se obtiene a partir de una muestra biológica que es directamente anterior con respecto a la muestra a analizar, es decir el que precede a la muestra a analizar en el orden de las extracciones efectuadas en el paciente.

Según una forma de realización particularmente ventajosa, la muestra de referencia interna procede de una extracción obtenida en los 2 días o en el día, o incluso 2 días o 1 día después del ingreso en reanimación del paciente, lo cual permite determinar de manera muy temprana el riesgo de complicación del paciente analizado. En el caso de que el paciente esté en estado de choque séptico o haya estado en choque séptico, estos tiempos se calcularán a contar desde el inicio del choque séptico.

A título de ejemplo, la extracción anterior se efectúa en las o 48 horas después del ingreso en reanimación del paciente y, preferentemente, por lo menos 24 horas antes de la extracción de la muestra a analizar. Preferentemente, la extracción anterior se realiza 24 horas después del ingreso en reanimación y la extracción correspondiente a la muestra a analizar se efectúa 72 horas después del ingreso en reanimación. En el caso de un paciente en estado de choque séptico o que ha pasado por un estado de choque séptico, la extracción anterior se efectuará, preferentemente, en las o 48 horas después del inicio del choque séptico y, preferentemente, por lo menos 24 horas antes de la extracción de la muestra a analizar. Preferentemente, la extracción anterior se efectúa 24 horas después del inicio del choque séptico y la extracción correspondiente a la muestra a analizar se efectúa 72 horas después del inicio del choque séptico.

Preferentemente, el procedimiento de la invención permite concluir en un riesgo de complicación, y en particular de mortalidad en el paciente, cuando se determina la cantidad de dicho por lo menos un transcrito para dicha muestra biológica a analizar o un valor derivado de esta cantidad que se mide en la muestra a analizar no ha aumentado significativamente con respecto al valor de referencia interno. Está al alcance del experto en la materia determinar el porcentaje de aumento significativo que dependerá, en particular, del tipo de muestra a analizar (por ejemplo sangre completa, PBMC, subpoblaciones celulares), del tipo de análisis, incluso del aparato en el que se efectúa el análisis, en función de si desea favorecer la especificidad en el caso de una prueba de exclusión o la sensibilidad en el caso de una prueba de inclusión, según el tratamiento a aplicar o también la patología que padece el paciente.

En el caso ahora de la utilización de un valor de referencia externo, este puede corresponder a, o ser obtenido a partir de, la cantidad de dicho por lo menos un transcrito, medida en una muestra biológica procedente de un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica del que se sabe que no ha experimentado ninguna complicación, en particular de un paciente que presenta una sepsis de la que se sabe que no ha experimentado ninguna complicación, y preferentemente, de un paciente en choque séptico del que se sabe que no ha experimentado ninguna complicación.

En particular, cuando el riesgo de complicación a evaluar es un riesgo de mortalidad, el valor de referencia externo puede corresponder a, o ser obtenido a partir de, la cantidad de dicho por lo menos un transcrito, medida en una muestra biológica de referencia procedente de un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica a las que se sabe que ha sobrevivido, en particular de un paciente con sepsis a la que se sabe que ha sobrevivido, y preferentemente, de un paciente en choque séptico al que se sabe que ha sobrevivido.

En este caso, la medición de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito determinada que sirve para determinar el valor de referencia externo se efectúa preferentemente en paralelo, es decir, al mismo tiempo que la medición de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que se realiza en la muestra procedente del paciente en el que se desea evaluar el riesgo de complicación, aunque la extracción de la muestra biológica de referencia se haya realizado anteriormente a la de la muestra a analizar.

El valor de referencia puede corresponder asimismo a, o ser obtenido a partir de, un valor medio de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito medida en un acervo de muestras procedentes de pacientes que han sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) de los que se sabe que no han experimentado ninguna complicación, en particular de pacientes con sepsis de la que se sabe que no han experimentado ninguna complicación, y preferentemente, de pacientes en estado de choque séptico del que se sabe que no han experimentado ninguna complicación.

En particular, cuando el riesgo de complicación a evaluar es un riesgo de mortalidad, el valor de referencia puede corresponder asimismo a, o ser obtenido, a partir de un valor medio de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito medida en un acervo de muestras procedentes de pacientes que han sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) a las que se sabe que han sobrevivido, en particular de pacientes que presentan una sepsis a la que se sabe que han sobrevivido, y preferentemente, de pacientes en estado de choque séptico al que se sabe que han sobrevivido.

En este caso, la determinación del valor de referencia externo se efectúa preferentemente con carácter previo a la medición de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que se realiza en la muestra procedente del paciente en el que se busca evaluar el riesgo de mortalidad, habiéndose efectuado la extracción de las muestras de referencia destinadas a ser "acervadas" con anterioridad a la de la muestra a analizar.

En particular, se concluye en un riesgo incrementado de complicación, y en particular de mortalidad en dicho paciente, cuando la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R en la muestra biológica del paciente ha disminuido significativamente con respecto al valor de referencia externo. Este es particularmente el caso cuando el pronóstico se basa en tener en cuenta la cantidad del transcrito IL7R-001, IL7R-002, IL7R-003, IL7R-005 o IL7R-007, o la cantidad global de varios transcritos, que comprende preferentemente 2, 3, 4 o todos los transcritos seleccionados de entre los transcritos IL7R-001, IL7R-002, IL7R-003, IL7R-005 e IL7R-007.

El experto en la materia podrá determinar cuándo se considera significativa una disminución, en función en particular del tipo de muestras analizadas (por ejemplo, sangre completa o PBMC), del tipo de detección realizada (con o sin amplificación), incluso del aparato de análisis utilizado, en función de si desea favorecer la especificidad en el caso de una prueba de exclusión o la sensibilidad en el caso de una prueba de inclusión, según el tratamiento a aplicar o también la patología que padece el paciente.

En particular, la muestra biológica a analizar procede de un paciente en estado de choque séptico en el momento de la extracción de la muestra biológica a analizar o que ha pasado por un estado de choque séptico y se dice que el valor de referencia es externo y corresponde a, o se deriva de, la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R medida en una muestra biológica de referencia procedente de un paciente en estado de choque séptico en el momento de la extracción de la muestra de referencia o que ha pasado por un estado de choque séptico, del que se sabe que no ha experimentado ninguna complicación, y en particular al que se sabe que ha sobrevivido, o bien corresponde a un valor medio de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que se ha medido en un acervo de muestras de referencia procedente de pacientes en estado de choque séptico en el momento de la extracción de las muestras de referencia o que ha pasado por un estado de choque séptico, del que se sabe que no han experimentado ninguna complicación, y en particular al que se sabe que han sobrevivido.

Para obtener un valor de referencia externo, la o las muestras de referencia utilizadas proceden, preferentemente, de personas que tienen las mismas características o una mayoría de las características comunes, en particular del mismo sexo y/o de una edad similar o idéntica y/o del mismo origen étnico, a las del sujeto o paciente en el que se desea valorar el riesgo de complicación, y en particular de mortalidad. La muestra de referencia puede estar constituida asimismo en este caso por cualquier muestra, biológica o no biológica, que ha sido previamente calibrada para contener la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que corresponde a la cantidad media medida en un acervo de muestras de pacientes que han sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (y en particular de pacientes que presentan una sepsis, y preferentemente de pacientes en estado de choque séptico), de los que se sabe que no han experimentado ninguna complicación, y preferentemente a las que se sabe que han sobrevivido, o que se ha calibrado previamente para contener la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que corresponde a la cantidad media medida en un acervo de muestras de pacientes que han sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (y en particular de pacientes que presentan una sepsis, y preferentemente de pacientes en estado de choque séptico), de los que se sabe que no han experimentado ninguna complicación y, preferentemente, a las que se sabe que han sobrevivido.

Asimismo, para la determinación del valor de referencia externo y la detección o la cuantificación de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R en la muestra a analizar, se utilizarán preferentemente unas muestras extraídas en el mismo momento, en particular con respecto al ingreso en el servicio de reanimación o con respecto al inicio del choque séptico según sea el caso.

En particular, la muestra biológica a analizar procede de un paciente en estado de choque séptico en el momento de la extracción de la muestra biológica a analizar o que ha pasado por un estado de choque séptico y la medición de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R se realiza en una muestra a analizar y, llegado el caso, en la o las muestras biológicas utilizadas para obtener el valor de referencia externo, que corresponden a una extracción efectuada en los 6 días después del inicio del choque séptico, preferentemente el 3er día siguiente al inicio del choque séptico, y en particular 72 h después del inicio del choque séptico.

Más generalmente, cuando la muestra biológica a analizar procede de un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica que ha sido ingresado en el servicio de reanimación, la medición de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R se realiza en una muestra a analizar y, llegado el caso, en la o las muestras biológicas utilizadas para obtener el valor de referencia externo, procedentes de una extracción efectuada, preferentemente, en los 6 días siguientes al ingreso en reanimación del paciente, preferentemente el 3er día siguiente al ingreso, y en particular 72 h después del ingreso.

En particular, para un paciente en estado de choque séptico en el momento de la extracción de la muestra biológica a analizar o que ha pasado por un estado de choque séptico, en la etapa ii) de los procedimientos según la invención, se podrá realizar la comparación directamente a partir de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R medida, a la vez para la muestra a analizar y para la determinación del valor de referencia externo, en una muestra biológica de una muestra procedente de una extracción realizada el 3er día después del inicio del choque séptico, y en particular 72 h después, o a partir de la relación entre la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R medida, a la vez para la muestra a analizar y para la determinación del valor de referencia externo, en una muestra biológica procedente de una extracción realizada el 3er día después del inicio del choque séptico, y en particular 72 h después, y la cantidad, a la vez para la muestra a analizar y para la determinación del valor de referencia, en una muestra biológica procedente de una extracción realizada en las 24 h, y en particular 24 h después del choque séptico. En este caso, la comparación se realiza en la etapa iii) entre:

- la relación entre la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica del paciente del cual se desea obtener el diagnóstico correspondiente a una extracción en un instante t (en particular en los 3 días o 3 días (D3) después del inicio del choque séptico) y la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica de dicho paciente correspondiente a una extracción en un instante t' (en particular en las 24 horas o 24 horas (D1) después del inicio del choque séptico), y

- la relación entre la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica del paciente o de la población de referencia correspondiente a una extracción en un instante t (en particular en los 3 días o 3 días (D3) después del inicio del choque séptico) y la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica de dicho paciente o población de referencia correspondiente a una extracción en un instante t' (en particular en las 24 horas o 24 horas (D1) después del inicio del choque séptico).

Más generalmente, cuando la muestra biológica a analizar procede de un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica que ha sido ingresado en el servicio de reanimación, la comparación se efectúa, preferentemente, directamente a partir de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R medida, para la muestra a analizar y para la determinación del valor de referencia externo, en una muestra biológica procedente de una extracción realizada el 3er día después del inicio del ingreso del paciente en el servicio de reanimación (y en particular 72 horas después) o a partir de la relación entre la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R medida, para la muestra a analizar y para la determinación del valor de referencia externo, en una muestra biológica procedente de una extracción realizada el 3er día después del ingreso (y en particular 72 horas después) y la cantidad medida, para la muestra a analizar y para la determinación del valor de referencia, en una muestra biológica procedente de una extracción realizada en las 24 horas, y en particular 24 horas después del choque séptico.

En este caso, la comparación se realiza en la etapa iii) entre:

- la relación entre la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica del paciente del cual se desea obtener el diagnóstico correspondiente a una extracción en un instante t (en particular en los 3 días o 3 días (D3) después del inicio el ingreso en reanimación) y la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica de dicho paciente correspondiente a una extracción en un instante t' (en particular en las 24 horas o 24 horas (D1) después del ingreso en reanimación), y

- la relación entre la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica del paciente o de la población de referencia correspondiente a una extracción en un instante t (en particular en los 3 días o 3 días (D3) después del inicio del choque séptico) y la cantidad de transcritos determinada para una muestra biológica de dicho paciente o población de referencia correspondiente a una extracción en un instante t' (en particular en las 24 horas o 24 horas (D1) después del inicio del choque séptico).

En el marco de la invención, se entiende por detección de un transcrito, la identificación del propio transcrito en la muestra biológica, por detección directa de dicho transcrito, mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia que permita determinar la presencia de dicho transcrito en una muestra, o por detección indirecta del transcrito después de la transformación de este último en ADN, o después de la amplificación de dicho transcrito, o después de la amplificación del ADN obtenido después de la transformación de dicho transcrito en ADN. En el marco de la invención, la detección estará acompañada por una cuantificación del o de los transcritos seleccionados, es decir que la concentración de un transcrito o de varios transcritos, en este caso de manera global o individual, será determinada directa o indirectamente.

La detección directa de un transcrito en la muestra biológica se puede realizar por cualquier medio conocido por el experto en la materia, como por ejemplo por hibridación con un socio de enlace específico o no del transcrito a detectar, llegado el caso, después de la amplificación mediante la técnica PCR, con o sin sonda, o NASBA, o como por ejemplo por secuenciación (Cloonan et al., 2008; Emrich et al., 2007; Mortazavi et al., 2008).

Por hibridación, se entiende el proceso durante el cual, en unas condiciones apropiadas, dos fragmentos de nucleótidos se unen con unos enlaces hidrógenos estables y específicos para formar un complejo bicatenario.

Los socios de enlace de un transcrito a detectar son cualquier socio susceptible de unirse a dicho transcrito, y en particular unos socios de enlace específicos. A título de ejemplo de socios de enlace específicos, se pueden citar las sondas de hibridación y los cebadores de amplificación, y cualquier otra molécula capaz de unirse al transcrito a detectar. Es posible utilizar unos socios de enlace específicos, es decir, que se unen esencialmente, incluso exclusivamente, a un único transcrito o que se unen a varios transcritos del gen IL7R, como se ilustra en los ejemplos siguientes.

Por sonda de hibridación, se entiende un fragmento nucleotídico que comprende entre 5 y 100 unidades nucleicas, en particular entre 10 y 35 unidades nucleicas, que poseen una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para formar un complejo de hibridación con uno o varios transcritos del gen IL7R. La sonda de hibridación puede comprender un marcador que permite su detección y se denomina entonces sonda de detección.

En el sentido de la presente invención, se entiende por cebador de amplificación, un fragmento nucleotídico que comprende entre 5 y 100 unidades nucleicas, preferentemente entre 15 y 30 unidades nucleicas que permiten el inicio de una polimerización enzimática, tal como en particular una reacción de amplificación enzimática. Por reacción de amplificación enzimática, se entiende un proceso que genera múltiples copias de un fragmento nucleotídico mediante la acción de por lo menos una enzima. Dichas reacciones de amplificación son bien conocidas por el experto en la materia y se pueden citar en particular las técnicas siguientes:

- PCR (Polymerase Chain Reaction), tal como la descrita en las patentes US 4,683,195, US 4,683,202 y US 4,800,159,

- LCR (Ligase Chain Reaction), descrita por ejemplo en la solicitud de patente EP 0201 184,

- RCR (Repair Chain Reaction), descrita en la solicitud de patente WO 90/01069,

- 3SR (Self Sustained Sequence Replication) con la solicitud de patente WO 90/06995,

- NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) con la solicitud de patente WO 91/02818,

- TMA (Transcription Mediated Amplification) con la patente US 5,399,491 y

- LAMP (Loop mediated isothermal amplification) con la patente US6410278.

Cuando la amplificación enzimática es una PCR, se realiza después de una reacción de transcripción inversa, llevada a cabo en una o dos etapas, y se denomina habitualmente RT-PCR (RT por "reverse transcription"). En la RT-PCR, el reactivo específico para uno o varios transcritos comprende por lo menos 2 cebadores de amplificación, que son o bien específicos del o de los transcritos diana en el caso de la RT-PCR en una etapa (EP 0569272), o bien específicos del o de los ADN que corresponden al o a los transcritos diana en el caso de una RT-PCR en dos etapas (Goblet et al., 1989).

Por detección, se entiende o bien un procedimiento físico, o bien un procedimiento químico con un agente colorante intercalante tal como el SYBR® Green I o el bromuro de etidio, o bien un procedimiento de detección con la ayuda de un marcador. Existen numerosos procedimientos de detección para la detección de los ácidos nucleicos (Keller G.H., 1993; Kricka, 1999).

Por marcador se entiende un trazador capaz de generar una señal que se puede detectar. Una lista no limitativa de estos trazadores comprende las enzimas que producen una señal detectable por ejemplo por colorimetría, fluorescencia o luminiscencia, como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; los cromóforos como los compuestos fluorescentes, luminiscentes o colorantes; los grupos de densidad electrónica detectables por microscopía electrónica o por sus propiedades eléctricas como la conductividad, mediante los procedimientos de amperometría o de voltametría, o mediante unas mediciones de impedancia; los grupos detectables mediante unos procedimientos ópticos como la difracción, la resonancia del plasmón de superficie, la variación de ángulo de contacto o mediante unos procedimientos físicos como la espectroscopia de fuerza atómica, el efecto túnel, etc.; las moléculas radiactivas como 32P, 35S o 125I.

En el sentido de la presente invención, la sonda de hibridación puede ser una sonda denominada de detección. En este caso, la sonda denominada de detección se marca por medio de un marcador tal como el definido anteriormente. Gracias a la presencia de este marcador, se puede detectar la presencia de una reacción de hibridación entre una sonda de detección determinada y el transcrito a detectar.

En cuanto a la PCR cuantitativa en tiempo real (Real Time quantitative PCR), para unas aplicaciones de diagnóstico se utilizan generalmente dos tipos de marcado para una hibridación específica:

- En primer lugar, es posible utilizar unos procedimientos que utilizan una sonda entre dos cebadores. En particular, se podrán utilizar unas sondas TaqMan®, tales como las descritas por Espy et al., 2006; Heid et al., 1996; Holland et al., 1991; unas balizas moleculares denominadas asimismo Molecular beacons, tales como las descritas por Espy et al., 2006; Mhlanga y Malmberg, 2001; Sigma, 2008; unas sondas de hibridación adyacentes, denominadas HybProbes (FRET); o también unas CPT (por "Cycling probe technology"), tales como las descritas por Duck et al., 1990.

- Asimismo, es posible utilizar unos procedimientos que utilizan unos cebadores marcados. Dichos cebadores pueden ser unos cebadores escorpión o Scorpion®, tales como los descritos en Sigma, 2008; unos cebadores Plexor, tales como los descritos por Buh Gasparic et al, 2010; unos cebadores utilizados en la técnica AmpliFluor®, tal como la descrita por Bio-Rad Laboratories, 2006; Nazarenko et al., 1997; unos cebadores LUX (light upon extension), tales como los descritos por Bio-Rad Laboratories, 2006; Buh Gasparic et al., 2010; Nazarenko et al., 2002; o también unos cebadores BD Qzyme™ tales como los descritos en Bio-Rad Laboratories, 2006; Clontech, 2003.

La sonda de hibridación puede ser asimismo una sonda denominada de captura. En este caso, la sonda denominada de captura está inmovilizada o se puede inmovilizar sobre un soporte sólido por cualquier medio apropiado, es decir directa o indirectamente, por ejemplo por covalencia o adsorción. Como soporte sólido, se pueden utilizar unos materiales sintéticos o unos materiales naturales, eventualmente modificados químicamente, en particular los polisacáridos tales como los materiales a base de celulosa, por ejemplo papel, unos derivados de celulosa tales como el acetato de celulosa y la nitrocelulosa o el dextrano, unos polímeros, unos copolímeros, en particular a base de monómeros del tipo estireno, unas fibras naturales tales como el algodón y unas fibras sintéticas tales como el nailon; unos materiales minerales tales como la sílice, el cuarzo, unos vidrios, unas cerámicas; unos látex; unas partículas magnéticas; unos derivados metálicos; unos geles, etc. El soporte sólido puede estar en forma de placa de microtitulación, de una membrana como se describe en la solicitud WO-A-94/12670, de una partícula.

Se pueden inmovilizar asimismo sobre el soporte varias sondas de captura diferentes, siendo cada una específica de un transcrito diana. En particular, se puede utilizar como soporte un biochip en el que se puede inmovilizar un gran número de sondas. Por biochip, se entiende un soporte sólido de tamaño reducido en el que se está fijada una multitud de sondas de captura en unas posiciones predeterminadas. El concepto de biochip, o chip de ADN, data de principios de los años 1990. Se basa en una tecnología multidisciplinar que integra la microelectrónica, la química de los ácidos nucleicos, el análisis de imágenes y la informática. El principio de funcionamiento se basa en un fundamento de la biología molecular: el fenómeno de la hibridación, es decir, el apareamiento por complementariedad de las bases de dos secuencias de ADN y/o ARN. El procedimiento de los biochips se basa en la utilización de sondas de captura fijadas sobre un soporte sólido sobre el que se hace que una muestra de fragmentos nucleotídicos diana marcados directa o indirectamente actúe con unos fluorocromos. Las sondas de captura están posicionadas de manera específica sobre el soporte o chip y cada hibridación proporciona una información particular, en relación con el fragmento nucleotídico diana. Las informaciones obtenidas son acumulativas, y permiten por ejemplo cuantificar un transcrito o varios transcritos diana. Tras la hibridación, se lava el soporte o chip, y los complejos transcrito/sondas de captura se revelan mediante un ligando de alta afinidad unido por ejemplo a un marcador de tipo fluorocromo. La fluorescencia se lee, por ejemplo, mediante un escáner y se procesa el análisis de la fluorescencia por ordenador. A título indicativo, se pueden citar los chips de ADN desarrollados por la compañía Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays") (Chee et al., 1996; Pease et al., 1994) para los diagnósticos moleculares. En esta tecnología, las sondas de captura son generalmente de tamaños reducidos, alrededor de 25 nucleótidos. Otros ejemplos de biochips se proporcionan en numerosas publicaciones (Cheng et al., 1998, 1996; Ginot, 1997; Livache et al., 1994; Ramsay, 1998) o en las patentes US-A-4,981,783, US-A-5,700,637, US-A-5,445,934, US-A-5,744,305 y US-A-5,807,522. La característica principal del soporte sólido debe ser conservar las características de hibridación de las sondas de captura en los fragmentos nucleotídicos diana generando al mismo tiempo un ruido de fondo mínimo para el procedimiento de detección.

Las técnicas para la inmovilización de las sondas sobre un soporte son bien conocidas por el experto en la materia, como por ejemplo el depósito de sondas pre-sintetizadas por impresión o microdeposición (solicitudes de patente WO-A-00/71750, FR 00/14896, FR00/14691), o también la síntesis in situ (solicitudes de patentes WO 89/10977 y WO 90/03382).

Para detectar el transcrito de la muestra biológica, puede ser necesaria una etapa de extracción. La extracción se realiza mediante cualquier protocolo de extracción y de purificación de ácidos nucleicos bien conocidos por el experto en la materia. A título indicativo, la extracción de ácidos nucleicos se puede realizar mediante:

■ una etapa de lisis de las células presentes en la muestra biológica, con el fin de liberar los ácidos nucleicos contenidos en las células del paciente. A título de ejemplo, se pueden utilizar los procedimientos de lisis tales como los descritos en las solicitudes de patente:

- WO 00/05338 sobre la lisis mixta magnética y mecánica,

- WO 99/53304 sobre la lisis eléctrica,

- WO 99/15321 sobre la lisis mecánica.

El experto en la materia podrá utilizar otros procedimientos de lisis bien conocidos, tales como los choques térmicos u osmóticos o las lisis químicas mediante unos agentes caotrópicos tales como las sales de guanidio (US 5,234,809).

■ una etapa de purificación, que permite la separación entre los ácidos nucleicos y los demás constituyentes celulares liberados en la etapa de lisis. Esta etapa permite concentrar generalmente los ácidos nucleicos y se puede adaptar a la purificación de ARN. A título de ejemplo, se pueden utilizar unas partículas magnéticas eventualmente revestidas con oligonucleótidos, por adsorción o covalencia (véanse a este respecto las patentes US 4,672,040 y US 5,750,338), y purificar así los ácidos nucleicos que se han fijado sobre estas partículas magnéticas, mediante una etapa de lavado. Esta etapa de purificación de los ácidos nucleicos es particularmente ventajosa si se desea amplificar posteriormente dichos ácidos nucleicos. Un modo de realización particularmente interesante de estas partículas magnéticas se describe en las solicitudes de patente: w O-A-97/45202 y WO-A-99/35500. Se puede utilizar asimismo sílice, o bien en forma de columna, o bien en forma de partículas inertes (Boom et al., 1990) o magnéticas (Merck: MagPrep® Silica, Promega: MagneSil® Paramagnetic particles). Otros procedimientos muy extendidos se basan en unas resinas intercambiadoras de iones en columna o en formato de partículas paramagnéticas (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison et al., 1998). Otro procedimiento es el de la adsorción sobre soporte de óxido metálico (compañía Xtrana: matriz Xtra-Bind®).

Cuando se desea extraer específicamente los ARN de una muestra biológica, es posible realizar en particular una extracción mediante fenol, cloroformo y alcohol para eliminar las proteínas y precipitar los ARN con etanol al 100%. Se puede entonces peletizar los ARN por centrifugación, lavar y poner de nuevo en solución.

Dichos procedimientos de detección y cuantificación permitirán determinar la cantidad de uno o varios transcritos presentes en la muestra analizada o proporcionar su valor derivado. Un valor derivado de la cantidad puede ser por ejemplo la concentración absoluta, calculada gracias a una curva de calibración obtenida a partir de diluciones sucesivas de una solución de amplicón de concentración conocida. Puede corresponder asimismo al valor de la cantidad normalizada y calibrada, como el CNRQ (Calibrated Normalized Relative Quantity, (Hellemans et al., 2007)), que integra los valores de una muestra de referencia, de un calibrador y de uno o varios genes de referencia. A título de ejemplos de gen de referencia, se pueden citar los genes PpIB, PPIA, GLYR1, RANBP3, HPRT1, 18S, GAPDH, RPLPO y ACTB.

La determinación de la cantidad de varios transcritos se puede realizar secuencial o simultáneamente, según los procedimientos conocidos normalmente por el experto en la materia, como se ha indicado anteriormente.

En el marco de la invención, la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R se medirá, preferentemente, por RT-PCR cuantitativa.

En particular, la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R se medirá con por lo menos uno de los pares de cebadores de amplificación siguientes, con o sin la sonda mencionada:

- cebador sentido de SEC ID n° 12 y cebador antisentido de SEC ID n° 13, y eventualmente sonda de SEC ID n° 14, que permiten detectar los transcritos IL7R-001, IL7R-002, IL7R-003, IL7R-005 e IL7R-007 y sus variantes,

- cebador sentido de SEC ID n° 15 y cebador antisentido de SEC ID n° 16, y eventualmente sonda de SEC ID n° 17, que permite detectar el transcrito IL7R-001 y sus variantes,

- cebador sentido de SEC ID n° 18 y cebador antisentido de SEC ID n° 19, y eventualmente sonda de SEC ID n° 20, que permite detectar el transcrito IL7R-001 y sus variantes.

Todas las indicaciones y preferencias mencionadas anteriormente que tratan de la detección o de la cuantificación del o de los transcritos del gen IL7R seleccionados se aplican indistintamente ya sea para la detección o la cuantificación en la muestra a analizar o en la muestra de referencia.

Para la realización del procedimiento de la invención, la invención tiene por objeto adicional un kit de diagnóstico que comprende las herramientas y/o reactivos necesarios para la detección de por lo menos un transcrito del gen IL7R.

A título no limitativo de los reactivos necesarios para la detección de uno o varios transcritos del gen IL7R, se pueden mencionar los socios de enlace de dicho o dichos transcritos, tales como unas sondas de hibridación o unos cebadores de amplificación.

En particular, la invención se refiere a los kits para la medición, in vitro o ex vivo, de la cantidad de por lo menos un transcrito del gen IL7R en una muestra biológica, que comprende:

- unas herramientas o reactivos específicos que permiten medir la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R en dicha muestra biológica, y

- una muestra de control que es una muestra calibrada para contener la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que corresponde a la cantidad media medida en un acervo de muestras de pacientes que han sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, de los que se sabe que no han experimentado ninguna complicación, y preferentemente a las cuales se sabe que han sobrevivido, y/o una muestra de control que es una muestra calibrada para contener la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que corresponde a la cantidad media medida en un acervo de muestras de pacientes que han sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, de los que se sabe que han experimentado una complicación, y preferentemente a las que se sabe que no han sobrevivido.

En particular, dicho kit contiene, como reactivos específicos que permiten medir la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R en dicha muestra biológica, por lo menos uno de los siguientes pares de cebadores de amplificación, con o sin la sonda mencionada:

- cebador sentido de SEC ID n° 12 y cebador antisentido de SEC ID n° 13, y eventualmente sonda de SEC ID n° 14,

- cebador sentido de SEC ID n° 15 y cebador antisentido de SEC ID n° 16, y eventualmente sonda de SEC ID n° 17,

- cebador sentido de SEC ID n° 18 y cebador antisentido de SEC ID n° 19, y eventualmente sonda de SEC ID n° 20.

Una muestra de control puede ser una muestra que contiene una concentración dada de transcrito(s) diana(s) o de ADN complementario correspondiente, que puede ser o bien una muestra sintética que contiene una concentración calibrada de transcritos diana o de ADN complementario correspondiente, o una muestra biológica. Una muestra de control puede ser en particular una muestra biológica procedente de por lo menos un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, de los que se sabe que no ha experimentado ninguna complicación, y en particular que ha sobrevivido, o también una muestra biológica procedente de por lo menos un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica de los que se sabe que ha experimentado una complicación, y en particular que no ha sobrevivido. Este tipo de muestra de control procede en particular de uno o varios pacientes que han sufrido una agresión, tal como cirugía, quemadura, traumatismo, etc., o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), en particular de uno o varios pacientes que presentan una sepsis, y preferentemente de uno o varios pacientes en estado de choque séptico.

La invención cubre asimismo la utilización de un kit según la invención para realizar el procedimiento de la invención, y en particular para evaluar el riesgo de complicación, y en particular de mortalidad de un paciente que ha sufrido una agresión, tal como como cirugía, quemadura, traumatismo, etc., o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), en particular en un paciente que presenta una sepsis, en particular una sepsis grave. Preferentemente, la utilización del kit según la invención permite evaluar el riesgo de mortalidad en un paciente que está en estado de choque séptico.

La presente invención tiene asimismo por objeto la utilización de la medición, in vitro o ex vivo, de la cantidad de por lo menos un transcrito del gen IL7R, de por lo menos un transcrito del gen IL7R correspondiente a un ARNm, en una muestra biológica de un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, para evaluar el riesgo de complicación, y en particular de mortalidad, en dicho paciente. En particular, dicho paciente está en estado séptico, en particular grave, o ha sufrido una cirugía, una quemadura o un traumatismo que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Según unos modos de realización particulares, la muestra biológica a analizar procede de un paciente en estado de choque séptico o que ha pasado por un estado de choque séptico en los 6 días anteriores a la extracción de la muestra biológica a analizar. Preferentemente, dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R se selecciona de entre los transcritos IL7R-001 de SEC ID n° 2, IL7R-002 de SEC ID n° 3, IL7R-003 de SEC ID n° 4, IL7R-005 de SEC ID n° 6 e IL7R-007 de SEC ID n° 8 y sus variantes, presentando la secuencia de una variante por lo menos el 99% de identidad con una de dichas secuencias. En particular, dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R se selecciona de entre los transcritos que comprenden por lo menos parte del dominio transmembranario, incluso todo el dominio transmembranario, de CD127, y corresponde preferentemente al transcrito IL7R-001 de SEC ID n ° 2 o a una de sus variantes que presenta por lo menos el 99% de identidad con dicha secuencia.

Más ampliamente, todos los modos de realización preferidos que se han mencionado anteriormente en relación con el procedimiento y sus combinaciones constituyen asimismo unos modos de realización preferidos que se refieren a la utilización. La utilización según la invención podrá comprender asimismo la detección y/o la cuantificación del o de los transcritos del gen IL7R seleccionados, combinada con la estimación de una por lo menos de las puntuaciones de gravedad SOFA y/o SAPSII para evaluar el riesgo de complicación del paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera una respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), y en particular de un paciente que está en estado de choque séptico. En este modo de realización, se calcula preferentemente la puntuación SOFA, como se describe por Vincent et al., 1996, y/o se calcula preferentemente la puntuación SAPSII como se describe por Le Gall et al., 1993.

Todos los modos de realización preferidos que se han mencionado anteriormente con referencia al procedimiento y a sus combinaciones constituyen asimismo unos modos de realización preferidos, tratándose del kit según la invención y de su utilización y de la utilización de la medición, in vitro o ex vivo, de la cantidad de por lo menos un transcrito del gen IL7R.

Otras características diversas se desprenden de los ejemplos siguientes con referencia a las figuras adjuntas que muestran, a título de ejemplos no limitativos, unas formas de realización del objeto de la invención:

- la figura 1 es una representación esquemática del corte y empalme del ARN mensajero del gen IL7R,

- la figura 2 representa los niveles de expresión de diferentes transcritos del gen IL7R en unos voluntarios sanos (n=19) y en unos pacientes en choque séptico el D1 y D3 después del inicio del choque séptico (n=30). PCR-A: transcritos IL7R-001, IL7R-002, IL7R-003, IL7R-005, IL7R-007; PCR-B: transcrito IL7R-001; PCR-C: transcrito IL7R-007. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para las comparaciones entre sujetos sanos y pacientes en choque séptico el D1 o el D3. La prueba de Wilcoxon pareada se utilizó para las comparaciones entre el D1 y el D3 en pacientes en choque séptico.

- la figura 3 representa los niveles de expresión de diferentes transcritos del gen IL7R en función de la aparición o no de complicaciones en unos pacientes en choque séptico, el D1, D3 o para la proporción D3/D1. Los niveles de expresión se expresan como "Calibrated Normalized Relative Quantity" (CNRQ) con HPRT1, como gen de referencia y se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney. PCR-A: transcritos IL7R-001, IL7R-002, IL7R-003, IL7R-005, IL7R-007; PCR-B: transcrito IL7R-001; PCR-C: transcrito IL7R-007.

- la figura 4 representa los niveles de expresión de diferentes transcritos del gen IL7R en función de la aparición o no de la muerte el D28 en unos pacientes en choque séptico, el D1, D3 o para la proporción D3/D1. Los niveles de expresión se expresan en CNRQ con HPRT1, como gen de referencia y se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney. PCR-A: transcritos IL7R-001, IL7R-002, IL7R-003, iL7R-005, IL7R-007; PCR-B: transcrito IL7R-001; PCR-C: transcrito IL7R-007.

Procedimientos

Pacientes y muestras biológicas

Se extrajeron unas muestras de sangre completa en unos tubos PAXgene (PreAnalytix) de 30 pacientes en choque séptico los días 1 (D1) y 3 (D3) tras el inicio del choque séptico, y se almacenaron después (cohorte retrospectiva).

Veintiocho días tras el ingreso en reanimación por choque séptico, 9 pacientes no sobrevivieron ("NS") es decir, el 30%, mientras que 21 pacientes sobrevivieron ("S") de los 30 pacientes.

Durante su estancia en reanimación, 4 pacientes contrajeron una infección nosocomial, es decir el 13%, mientras que 26 de los 30 pacientes no la contrajeron.

En total, 11 pacientes sufrieron complicaciones (muerte el D28 o aparición de una infección nosocomial en reanimación) es decir el 37%, mientras que en 19 de los 30 pacientes no apareció ninguna complicación.

Se extrajeron asimismo de 19 sujetos sanos voluntarios, unas muestras de sangre completa, tratadas de la misma manera que las muestras de los pacientes en choque séptico.

Técnica de detección

Extracción de ARN y transcripción inversa

La extracción de ARN se efectuó con la ayuda del kit PAXgene Blood RNA (PreAnalytix) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se controló la calidad de los ARN extraídos en un bioanalizador (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), utilizando unos chips RNA 6000 Nano. Antes de la etapa de elución del ARN, se eliminó el ADN genómico residual mediante la acción de una ADNasa. Se controló a continuación la calidad del ARN con la ayuda del kit RNA 6000 Nano en un bioanalizador (Agilent Technologies), siendo las extracciones con un RIN (RNA Integrity Number) superior a 6 consideradas de buena calidad. Por último, se determinó la concentración de ARN por fluorimetría (kit RNA assay sur Qubit, Life Technologies).

El ARN total (200 ng) sufrió a continuación una transcripción inversa en ADN complementario utilizando el kit SuperScript® VILO™ cDNA Synthesis (Life Technologies, Chicago, IL). La solución de ADNc así obtenida se diluyó a 1/20 y se almacenó a -80°C hasta la reacción de PCR cuantitativa.

Técnica de PCR cuantitativa

Las reacciones de PCR se realizaron en un LightCycler 480 (Roche Molecular Biochemicals, Bále, Suiza) con el kit Taqman Fast Advanced Master Mix PCR (Roche), en un volumen final de 20 pl que contiene 0,5 M de cebadores y 0,1 M de sonda. Las PCR se realizaron con una etapa de desnaturalización inicial de 10 min a 95°C, seguida de 45 ciclos de amplificación en "touchdown PCR" (10 seg a 95°C, 29 seg a 68°C para el primer ciclo, con una disminución de 0,5°C en cada ciclo hasta alcanzar 58°C, y extensión de 1 s a 72°C). Se utilizó el procedimiento del máximo de la derivada segunda a través del programa LightCycler para determinar automáticamente el Cp ("crossing point") para cada muestra. Se generaron unas curvas de calibración para 8 diluciones en serie a 1/10 de una solución madre de amplicón estándar de concentración conocida. Los pares de cebadores y sondas utilizados se enumeran en la tabla 2:

Tabla 2. Secuencias de los cebadores y sondas de las PCR para la detección de diferentes transcritos del gen IL7R

Secuencias Transcritos diana

IL7R-001 (NM_002185) Cebador sentido SEC ID n° 12 IL7R-002 (ENST00000514217) PCR-A ("varios transcritos") Cebador antisentido SEC ID n° 13 IL7R-003 (ENST00000506850)

Sonda SEC ID n° 14 IL7R-005 (ENST00000511031)

IL7R-007 (ENST00000511982)

Cebador sentido SEC ID n° 15

PCR-B (Forma membranaria) Cebador antisentido SEC ID n° 16 IL7R-001 (NM_002185)

Sonda SEC ID n° 17

Cebador sentido SEC ID n° 18

PCR-C (Forma soluble potencial) Cebador antisentido SEC ID n° 19 IL7R-007 (ENST00000511982)

Sonda SEC ID n° 20

Los niveles de expresión se expresaron en CNRQ ("Calibrated Normalized Relative Quantity"), según Hellemans et al., 2007, incluyendo un gen de referencia y un calibrador. El gen de referencia utilizado es HPRT1 (hipoxantina fosforribosiltransferasa 1, NM_000194), medido por PCR (cebador sentido: CCAAAGATGGTCAa Gg TCGC, cebador antisentido: GACACAAACATGATTCAAATCC, sonda CAAGTTTGTTGTAGGATATGCCC). El calibrador estaba compuesto por un acervo de ARN de voluntarios sanos. Este calibrador siguió el mismo proceso que las muestras clínicas a partir de la etapa de transcripción inversa.

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa RStudio (versión 0.98.501). Las diferencias observadas se consideraron significativas para unos valores de p inferiores a 0,05.

Análisis descriptivo de los niveles de expresión de los transcritos del gen IL7R

Las comparaciones de los niveles de expresión de los transcritos de genes IL7R se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney, excepto en el caso de las comparaciones entre D1 y D3 en los pacientes en choque séptico, realizadas mediante la prueba de Wilcoxon pareada.

Análisis de la capacidad de predecir la aparición de complicaciones o de muerte el D28

Se generaron las curvas ROC (Receiver Operating Curves) y las áreas bajo la curva, y se calcularon sus intervalos de confianza.

Resultados

Detección de los transcritos del gen IL7R en los sujetos sanos y los pacientes en choque séptico

El nivel de expresión de los transcritos del gen IL7R se midió, como se ha descrito anteriormente, en las muestras de sangre completa de 30 pacientes en choque séptico y de 19 voluntarios sanos. Los resultados se presentan en la figura 2.

El conjunto de los transcritos del gen IL7R se detecta a la vez en los sujetos sanos y en los pacientes en choque séptico, el D1 y D3 tras el inicio del choque séptico.

El nivel de expresión del transcrito que codifica para la forma membranaria de CD127 (Transcrito IL7R-001) es mayoritario con respecto al transcrito correspondiente a una forma soluble potencial (Transcrito IL7R-007), tanto en los sujetos sanos como en los pacientes en choque séptico.

Los niveles de expresión del conjunto de los transcritos medidos con la PCR-Ason inferiores en los pacientes en choque séptico el D1 y el D3 en comparación con los voluntarios sanos, y esto asimismo para el transcrito que codifica para la forma membranaria de CD127 (Transcrito IL7R-001 - PCR-B) y para el transcrito correspondiente a una forma soluble potencial de CD127 (Transcrito IL7R-007 - PCR-C).

En los pacientes en choque séptico, se observa un aumento significativo del nivel de expresión de los diferentes transcritos del gen IL7R que codifican para CD127 entre el D1 y el D3.

Comparación de los niveles de expresión de los transcritos del gen IL7R que codifican para CD127 en función de la aparición de complicación en los pacientes en choque séptico

Como se muestra en la figura 3, los niveles de expresión de los diferentes transcritos del gen IL7R, incluyendo el que codifica para la forma membranaria (Transcrito IL7R-001) y el que corresponde a una forma soluble potencial (Transcrito IL7R-007), son significativamente más bajos el D3 en los pacientes que sufrirán complicaciones (muerte o infección nosocomial constatada que corresponde a "sí" en la figura 3). Esta observación es cierta asimismo para la proporción de los niveles de expresión D3/D1.

Capacidad de los transcritos del gen IL7R para predecir el riesgo de complicación en los pacientes en choque séptico

La capacidad predictiva de la medición de los niveles de expresión de diferentes transcritos del gen IL7R se estudió en relación con el evento a estudiar, es decir, la aparición de complicaciones. Los resultados están representados en la tabla 3, que agrupa las áreas bajo la curva de ROC (Receiving Operating Curve) o AUC (Area Under Curve), así como sus intervalos de confianza al 95%.

Tabla 3. Áreas bajo la curva para la predicción del riesgo de complicación para los diferentes transcritos del gen IL7R

Transcritos Día AUC IC 95%

Todos los transcritos (PCR-A) D1 0,632 [0,425-0,840]

D3 0,813 [0,657-0,970] Proporción D3/D1 0,766 [0,571-0,960] Transcrito membranario IL7R-001 (PCR-B) D1 0,627 [0,419-0,832]

D3 0,823 [0,671-0,975] Proporción D3/D1 0,766 [0,570-0,961] Transcrito soluble IL7R-007 (PCR-C) D1 0,665 [0,464-0,866]

D3 0,837 [0,689-0,986] Proporción D3/D1 0,751 [0,549-0,953]

Los niveles de expresión de diferentes transcritos del gen IL7R medidos el D3, o la proporción de expresión D3/D1, permiten por lo tanto discriminar los pacientes que sufrirán complicaciones, de los que no las sufrirán, con unas áreas bajo la curva superiores a 0,8 para el D3 y superiores a 0,75 para la proporción de expresión D3/D1.

Comparación de los niveles de expresión de los transcritos del gen IL7R en función de la aparición de la muerte en los pacientes en choque séptico

Como se muestra en la figura 4, los niveles de expresión de los diferentes transcritos del gen IL7R, incluyendo el que codifica para la forma membranaria (Transcrito IL7R-001) y el correspondiente a una forma soluble potencial (Transcrito IL7R-007), son significativamente más bajos el D3 en los pacientes que van a morir (anotados "No supervivientes" en la figura 4) en los 28 días siguientes al choque séptico, en comparación con los pacientes que sobrevivirán (anotados "Supervivientes" en la figura 4) más de 28 días. Esta observación es cierta asimismo para la relación de los niveles de expresión D3/D1.

Capacidad de los transcritos para predecir el riesgo de muerte en los pacientes en choque séptico

Se estudió la capacidad predictiva de la medición de los niveles de expresión de diferentes transcritos del gen IL7R con respecto a la aparición de la muerte en los 28 días siguientes al inicio del choque séptico. Los resultados están representados en la tabla 4, que agrupa las áreas bajo la curva de ROC y sus intervalos de confianza al 95%.

Tabla 4. Áreas bajo la curva para la predicción de la aparición de la muerte para los diferentes transcritos del gen IL7R

Transcritos Día AUC IC 95%

Todos los transcritos (PCR-A) D1 0,545 [0,327-0,763]

D3 0,794 [0,629-0,958] Proporción D3/D1 0,794 [0,633-0,954]

Transcrito membranario IL7R-001 (PCR-B) D1 0,550 [0,335-0,765]

D3 0,809 [0,653-0,966] Proporción D3/D1 0,794 [0,631-0,956] Transcrito soluble IL7R-007 (PCR-C) D1 0,603 [0,394-0,812]

D3 0,836 [0,692-0,980] Proporción D3/D1 0,783 [0,619-0,947]

Los niveles de expresión de diferentes transcritos del gen IL7R medidos el D3, o la proporción de expresión D3/D1, permiten por lo tanto discriminar los pacientes que morirán de los que sobrevivirán, con unas áreas bajo la curva superiores a 0,75.

Este estudio muestra que los niveles de expresión de diferentes transcritos del gen IL7R permiten identificar a los pacientes con mayor riesgo de sufrir complicaciones tras un choque séptico. Más precisamente, el D3, los pacientes en los que aparecerán complicaciones presentan unos niveles de expresión de los transcritos del gen IL7R más bajos que los pacientes que no sufrirán ninguna complicación. La evolución de los niveles de expresión de los diferentes transcritos del gen IL7R entre el D1 y el D3 es asimismo informativa, permaneciendo los niveles de expresión estables en los pacientes que sufrirán complicaciones, mientras que aumentan en los pacientes que no sufrirán ninguna complicación. Mientras que a nivel proteico solo la forma soluble estaba asociada con la aparición de un mal pronóstico (Venet et al., 2012), los diferentes transcritos del gen IL7R, que corresponden a la forma membranaria o a unas formas solubles, y que se dosifican simultánea o individualmente, son capaces de identificar a los pacientes con mayor riesgo de aparición de complicaciones.

Referencias

Bio-Rad Laboratories, 2006, Real-Time PCR: Applications Guide.

Bone, R.C., et al., 1992, Chest 101, 1644-1655.

Boom, R., et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28, 495-503.

Buh Gasparic, M., et al., 2010, Anal. Bioanal. Chem. 396, 2023-2029.

Carini, C., et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 2927-2934.

Chee, M., et al., 1996, Science 274, 610-614.

Cheng, J., et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16, 541-546.

Cheng, J., et al. 1996, Mol. Diagn. J. Devoted Underst. Hum. Dis. Clin. Appl. Mol. Biol. 1, 183-200.

Clontech, 2003, BD QZyme Assays for Quantitative PCR.

Cloonan, N., et al., 2008, Nat. Methods 5, 613-619.

Duck, P, et al., 1990, BioTechniques 9, 142-148.

Emrich, S.J., et al., 2007, Genome Res. 17, 69-73.

Espy, M.J., et al., 2006, Clin. Microbiol. Rev. 19, 165-256.

Ginot, F., 1997, Hum. Mutat. 10, 1-10.

Goblet, C., et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 2144.

Goodwin, R.G., et al., 1990, Cell 60, 941-951.

Heid, C.A., et al., 1996, Genome Res. 6, 986-994.

Hellemans, J., et al., 2007, Genome Biol. 8, R19.

Holland, PM., et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7276-7280.

Jiang, Q., et al., 2005, Cytokine Growth Factor Rev. 16, 513-533.

Keller G.H., et al., 1993), Stockton Press.

Kricka, L.J., 1999, Clin. Chem. 45, 453-458.

Le Gall, J.R., et al., 1993, J. Am. Med. Assoc. 270, 2957-2963.

Levison, PR., et al., 1998, J. Chromatogr. A 827, 337-344.

Livache, T., et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22, 2915-2921.

Mhlanga, M.M., y Malmberg, L., 2001, Methods San Diego Calif 25, 463-471.

Mortazavi, A., et al., 2008, Nat. Methods 5, 621-628.

Nazarenko, I., et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30, e37.

Nazarenko, I.A., et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25, 2516-2521.

Park, L.S., et a l, 1990, J. Exp. Med. 171, 1073-1089.

Pease, A.C., et a l, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 5022-5026.

Ramsay, G., 1998), Nat. Biotechnol. 16, 40-44.

Rose, T., et al., 2009, J. Immunol. 182, 7389-7397.

Sigma, 2008, qPCR Technical Guide.

Venet, F., et al., 2012, J. Immunol. 189, 5073-5081.

Vincent, J.L., et al., 1996, Intensive Care Med. 22, 707-710.

Vranjkovic, A., et al., 2007, Int. Immunol. 19, 1329-1339.

SEC ID n° 1: Secuencia del gen IL7R, GRCh38:5:35856875:35879603

ATCTMGCTTCTCTGTCTTCCTCCCTCCCTCCCTTCCTCTTACTCTCATTCATTTCATACAC ACTGGCTCACACATCTAC_1-CTCTCTCTCTATCTCTC_1-CAGAATGACAATTCTAGGTACAACT TTTGGCATGGTTTTTTCTTTACTTCAAGTCGTTTCTGGAGAAAGTGGCTATGC_1-CAAAATG GTG AGTCATTT CTAAG TTÍT CTT ATGGATTTT GG ATTATCTGTAGCAT GGTTT C AGGTTAT TCAGTTCCCrAACAGACCTGAGTCAGGCACTGGGTTTGAATGCAGTTTGAGAATTTCCCAC ATATT CAGT C A T T T T 'n T T AAT GTTTAACCACC ATG ACAGGGGGCAGG GGATC AATACTAT GGGTGGTTTATAAGACCTCAGTATTCTCAAGAAGGAATGCATTTCACTCCCAAGTGTAGAT CTTAAATGTTGAATGATTACTCTGCTCTTACAAAAAGAATGC_1-CATGTAGATGCTATGACT GTACTTGTAGG AAAATGT CCAAAGTAATTTTACCTT GTCAGG AGATCAAACTGGATT CATT TTGTTTG ACTTTTTAAGAAATCCTG AAAGC ATAACTTT CAGG ATAAGGTAATGTACAG AAG CAATAGCTTTGTCTTCAGTGACCAGTGCTATATCCTCAGCACCTAAATCAGTGGCTAGAAT ATAGTAGACATCCAATAACrTTTGAAAGTGTTTTCAAAATACTTTAGTTTTGAGAGATTTA T GTGAG ATTTTAAGTAAATAACTG ACTAG AG AAAG AT CTAAATG AGTTTACTCATTG AAAT

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A l.I.ITCI.¡'AGCTCTTCTAGAGGGGCTAAGAGACTTGGTACGGGCCAGGAAGAATATGTGG CAGAGCTCCTGGAAATGATGCAGATTAGGTGGCATTTTTGTCAGCTCTGTGGTTTATTGT TGGG ACT ATTCTTTA AAATATCCATTGTTCACTACAGT G AAG ATCíCTG ATTTAACCGTGT ACTATCCACATGCATTACAAACATTTCGCAG AGCTGCTTAGTATATAAGCGTACAATGTAT GTAATAACCATCTCATATTTAATTAAATGGTATAG AAG AACA

SEC ID n° 2: Transcrito IL7R-001

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SEC ID n° 3: Transcrito IL7R-002

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SEC ID n° 4: Transcrito IL7R-003

CTTCCTCCCTCCCTCCCTT CCTCTTACT CTC ATTCATTTCAIACACACTGGCTCACACATCT ACTCTCTCTCTCTATCTCTCTCAGAATGACAATTCTAGGTACAACTTTTGGCATGGTTmT CTTTACTT CAAGTCGTTTCTGG AG AAAGTGGCTATGCTCAAAATGGAGACTTGGAAG ATG CAGAACTGGATGACTACTCATTCTCATGCTATAGCCAGTTGGAAGTGAATGGATCGCAGC ACTCACTGACCTGTGCTTTTGAGGACCCAGATGTCAACATCACCAATCTGGAATTTGAAAT

a tg t g g g g c c c t c g t g g a g g t a a a g t g c c t g a a t t t c a g g a a a c t a c a a g a g a t a t a t t t C ATCG AG AC AAAGAAATTCTTACTG ATT GG AAAG AGC AATATATGTGTG AAGGTT GG AG A AAAGAGTCTAACCTGCAAAAAAATAGACCTAACCACTATAGTTAAACCTGAGGCTCCTTTT GACCTGAGTGTCGTCTATCGGGAAGGAGCCAATGACTTTGTGGTGACATTTAATACATCA CACTTGCAAAAGAAGTATGTAAAAGTTTTAATGCACGATGTAGCTTACCGCCAGGAAAAGG ATGAAAACAAATGGACGCATGTGAATTTATCCAGCACAAAGCTGACACTCCTGCAGAGAAA GCTCCAACCGGCAGCAATGTATGAGATTAAAGTTCGATCCATCCCTGATCACTATTTTAAA GGCTTCTGG AGTG AATGG AGT CC AAGTTATTACTTCAG AACTCCAG AG ATCAATAATAGCT CAGGATTAAGCCTATCGTATGGCCCAGTCTCCCCGATCATAAGAAGACTCTGGAACATCTT TGT AAG AAACCAAG AAAAGTGAGTGTTTTTGGTGCTTAAAAAGTGTTGTGTTGGCAACAT CCC AGTGG CCA AG AAT GATATTCC AGG AC AAG GAAC AGTTG AACCT CACCTTTTG GT ATTT GATTC ATCCTGT AACTAGGGTCCCTCCTAAG A

SEC ID n° 5: Transcrito IL7R-004

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SEC ID n° 6: Transcrito IL7R-005

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SEC ID n° 7: Transcrito IL7R-006

CTTTTAAAGTGGGCCCTTAGTCAGGAGCGGTGGCTCATGCCTGTAGTCCrAGCACnTGG GAGGCTGAGGCAGGCAGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCGAGACAAGCCTGGCCAACATGG CG AAACCCCGTCTCCACTGAAAAC ACA AAAATTAGGCTGGCATAGTGGC ATTTGCCTGTAG TCCTAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCTGGGAGGTGGAAATTGC AGTG AGCCGAG ATCATGCTATTGTACTCCAGCCTGGG CAAC AAAGCAAG ACTCT GTCTC AA AA AAATAAAA ATTA AAAAAATAAAGTAGCCTCTAGCCTAAG ATAGCTTG AGCCTAGGTGTG A ATCTACT GCCTTACTCTG ATGTA AGCAC AA ATG ACAATT CTAG GTAC AACTTTT GG C AT G

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SEC ID n° 8: Transcrito IL7R-007

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SEC ID n° 9: Transcrito IL7R-008

GTGTG GAAAGGGAG ATCCTG G G CAGT GCCTAACTCACCTGAATAAG ACCCATCATTTC AC T CT CCT CCTTG ACC ACTCAC AAC ATCCTTTAT AAG CT CAG ATTCTGT CCCTAATTTT GCTGT TGACTCCTTTACGTATCAGAGCTCCTTATTCTAACAAATACGAGACAACTTCAGAGAATGC TTATGGG ACTAAAGG AATCCCAATTG AAATG ATTTGGG AG ATTTAGGCAAC ACCTCTTTT C CCATCCTAAGAATGTAACTGCACTCTACTCTCTAGCATGTGAATTTATCCAGCACAAAGCT GACACTCCTGCAGAGAAAGCTCCAACCGGCAGCAATGTATGAGATTAAAGTTCGATCCATC CCTGATCACTATTTTAAAGGCTTCTGGAGTGAATGGAGTCCAAGTTATTACTTCAGAACTC CAGAGATCAATAATAGCTCAGGGGAGATGGATCCTATCTTACTAACCATCAGCATTTTGAG

SEC ID n° 10: Transcrito IL7R-009

ATCTGTTCTTCTGATTCCAAGCTCAGAATAAGTGGGAAGACTCAGTGTGCCTGTGCCCTCr GCCATTCACTTC ATCTATCAAT GTTCTCTG ATTTCAGGATTAAGCCTATCGTATGGCCCAG TCTCCCCGATCATAAGAAGACTCTGGAACATCTTTGTAAGAAACCAAGAAAAAATTTAAAT GTGAGTTTCAATCCTGAAAGTTTCCTGGACTGCCAGATTCATAGGGTGGATGACATTCAA GCTAG AG ATG A AGTGG AAGGTTTT CTGC AAG ATACGTTT CCT CAGC AACTAG AAG AATCT GAGAAGCAGAGGCTTGGAGGGGATGTGCAGAGCCCCAACTGCCCATCTGAGGATGTAGTC ATCACTCCAGAAAGCTTTGGAAGAGATTCATCCC_1-CACATGCCTGGCTGGGAATGTCAGT GCATGTGACGCCCCTATTCTCTCCTCTTCCAGGTCCCTAGACTGCAGGGAGAGTGGCAAG AATGGGCCTCATGTGTACCAGG ACCTCCrGCTTAGCCTT GGG ACTACAAACAGCACGCTG

CCCCCTCC ATTTTCTCTCC AATCTG GAATCCT G AC ATTG A ACCCAGTTGCTC AG GGT CAGC CCATTCTTACTTCCCTGGGATC SEC ID n° 11: Transcrito IL7R-010

GC AGCAATGTATG AG ATTAAAGTTCG ATCC ATCCCTG ATCACTATTTTAAAGGCTTCTGG A GT G AATGGAGTCCAAGTTATTACTTCAGAACTCCAG AGATCAATAATAGCTCAGG ATTAAG CCTATCGTAT GGCCCAGT CTCCCCGATCAIAAG AAG ACTCTG G AAC AT CTTT GTAAG AAAC CAAG AAAAAATTTAAATGT G AGTTTCAATCCTG AAAGTTTCCTGG ACT GCCAG ATTCATAG GGTGG ATG ACATT C AAGCTAGAGATG A AGTGG AAGGTTTTCT G CAAG ATACGTTT CCTCA GC AACTAGAAG AATCTGAG A AGCAG AG G CTT GG AGGG G ATGTGC AG AG CCCCAACTGCCC ATCTGAGGATGTAGTCATCACTCCAGAAAGCTTTGGAAGAGATTCATCCCTCACATGCCTG GCTGGGAATGTCAGTGCATGTGACGCCCCTA'TTCTC_1-CCTCTTCCAGGTCCCTAGACTGCA

GGGAG AGTGG CAAG AATGGGCCT CATGTGTACCAGGACCTCCT GCTTAGCCTTGGG ACTA CAAACAGCACGCTGCCCCCTCCATTTTCTCTCCAATCTGGAATCCTGACATTGAACCCAGT TGCTC AGG GTCAGCCCATTCTTACTTCCCTGG GATC AAATCAAGAAG AAG CATATGT C ACC ATGTCC AGCTT CTACC AAAACC AGTG AAGTGTAAG AAACCC AG ACT GAACTTACCGTGAGC G ACAAAG ATG ATTTAAAAGGG AAGT CTAG AGTT CCTAGTCTCCCTCACAGC ACAG AG AAG A CAAAATTAGCAAAACCCCACTACACAGTCTGCAAGATTCTG AAACATT GCTTTG ACCACTC TTCCTGAGTTCAGTGGCACTCAACATGAGTCAAGAGCATCCTGCTTCTACCATGTGGATTT GGTCA SEC ID n° 12: cebador sentido PCR-A (transcritos IL7R-001, IL7R-002, IL7R-003, IL7R-005 e IL7R-007) GGAAGTGAATGGATCGCAGC SEC ID n° 13: cebador antisentido PCR-A (transcritos IL7R-001, IL7R-002, IL7R-003, IL7R-005 e IL7R-007) GGCACTTTACCTCCACGAG SEC ID n° 14: sonda PCR-A (transcritos IL7R-001, IL7R-002, IL7R-003, IL7R-005 e IL7R-007) CTGTGCTTTTGAGGACCCAGAT SEC ID n° 15: cebador sentido PCR-B (transcritos IL7R-001)

CTCTGTCGCTCTGTTGGTC SEC ID n° 16: cebador antisentido PCR-B (transcritos IL7R-001)

TCCAGAGTCTTCTTATGATCG SEC ID n° 17: sonda PCR-B (transcritos IL7R-001)

CTATCGTATGGCCCAGTCTCC SEC ID n° 18: cebador sentido PCR-C (transcritos IL7R-007)

GGAAGTGAATGGATCGCAGC SEC ID n° 19: cebador antisentido PCR-C (transcritos IL7R-007)

CAGAATGTCCAGACACAGTG

SEC ID n° 20: Sonda PCR-C (transcritos IL7R-007) CTGTGCTTTTGAGGACCCAGAT

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de evaluación in vitro o ex vivo del riesgo de complicación en un paciente que ha sufrido una agresión o una infección, generando dicha agresión o infección un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, caracterizado por que comprende la detección, preferentemente la cuantificación, en una muestra biológica procedente de dicho paciente, de por lo menos un transcrito del gen IL7R correspondiente al transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2 o a una de sus variantes, presentando la secuencia de una variante por lo menos el 99% de identidad con dicha secuencia, y correspondiendo preferentemente al transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el riesgo de complicación es el riesgo de muerte del paciente.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que cuando la detección, preferentemente la cuantificación, se refiere a varios transcritos del gen IL7R, el o los transcritos, diferentes al transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2 o a una de sus variantes, se selecciona de entre los transcritos IL7R-002 de SEC ID n° 3, IL7R-003 de SEC ID n° 4, IL7R-005 de SEC ID n° 6, e IL7R-007 de SEC ID n° 8 y sus variantes, presentando la secuencia de una variante por lo menos el 99% de identidad con una de dichas secuencias.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que realiza las etapas que consisten en:

i) determinar la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R en dicha muestra biológica del paciente;

ii) comparar la cantidad de dicho por lo menos un transcrito determinada para dicha muestra biológica o un valor derivado de esta cantidad, con un valor de referencia predeterminado; y

iii) llegar a una conclusión en cuanto a la presencia eventual de un riesgo de complicación, a partir del resultado de la comparación.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que realiza las etapas que consisten en:

i) determinar la cantidad global de varios transcritos del gen IL7R, incluido el transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2 o una de sus variantes, en dicha muestra biológica del paciente;

ii) comparar la cantidad global de dichos transcritos determinada para dicha muestra biológica o un valor derivado de esta cantidad, con un valor de referencia predeterminado; y

iii) llegar a una conclusión en cuanto a la presencia eventual de un riesgo de complicación, a partir del resultado de la comparación.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la muestra biológica a analizar procede de un paciente que presenta una sepsis, en particular una sepsis grave, o que ha presentado una sepsis, en particular una sepsis grave, en los 6 días previos a la extracción de la muestra biológica a analizar o de un paciente en estado de choque séptico o que ha pasado por un estado de choque séptico en los 6 días previos a la extracción de la muestra biológica a analizar.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado por que el valor de referencia, denominado referencia interna, se obtiene a partir de una muestra de referencia procedente del mismo paciente y obtenida en una extracción anterior.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que el paciente ha sido ingresado en el servicio de reanimación y la muestra de referencia interna procede de una extracción anterior obtenida en los 2 días o en el día, o también 2 días o 1 día después del ingreso en reanimación del paciente, y la extracción de la muestra a analizar se ha efectuado 3 días después del ingreso en reanimación.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado por que el valor de referencia, denominado referencia externa, se obtiene a partir de una muestra de referencia de un individuo de referencia o de muestras de referencia de una población de referencia.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por que la muestra biológica a analizar procede de un paciente en estado de choque séptico en el momento de la extracción de la muestra biológica a analizar o que ha pasado por un estado de choque séptico en los 6 días previos a la extracción de la muestra biológica a analizar, y el valor de referencia externo corresponde a, o se deriva de, la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R medida en una muestra biológica de referencia procedente de un paciente en estado de choque séptico en el momento de la extracción de la muestra biológica de referencia o que ha pasado por un estado de choque séptico en los 6 días previos a la extracción de la muestra biológica a analizar, del que se sabe que no ha experimentado ninguna complicación, y en particular del que se sabe que ha sobrevivido, o bien corresponde a un valor medio de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que se mide en un acervo de muestras de referencia procedente de pacientes en estado de choque séptico en el momento de la extracción de dichas muestras biológicas de referencia o que han pasado por un estado de choque séptico en los 6 días previos a la extracción de dichas muestras biológicas de referencia, del que se sabe que no han experimentado ninguna complicación y, en particular, del que se sabe que han sobrevivido.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R se mide por RT-PCR cuantitativa, y por que la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R se mide con por lo menos uno de los pares de cebadores de amplificación siguientes, con o sin la sonda de hibridación mencionada:

- cebador sentido de SEC ID n° 12 y cebador antisentido de SEC ID n° 13, y eventualmente sonda de SEC ID n° 14;

- cebador sentido de SEC ID n° 15 y cebador antisentido de SEC ID n° 16, y eventualmente sonda de SEC ID n° 17;

- cebador sentido de SEC ID n° 18 y cebador antisentido de SEC ID n° 19, y eventualmente sonda de SEC ID n° 20.

12. Utilización de la medición, in vitro o ex vivo, en una muestra biológica de un paciente que ha sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, de la cantidad de por lo menos un transcrito del gen IL7R correspondiente al transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2 o a una de sus variantes, presentando la secuencia de una variante por lo menos el 99% de identidad con dicha secuencia, que corresponde preferentemente al transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2, para evaluar el riesgo de complicación, y en particular de mortalidad, en dicho paciente.

13. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada por que la muestra biológica a analizar procede de un paciente en estado de choque séptico o que ha pasado por un estado de choque séptico en los 6 días previos a la extracción de la muestra biológica a analizar.

14. Utilización según la reivindicación 12 o 13, caracterizada por que se mide la cantidad de varios transcritos del gen IL7R, siendo el o los transcritos, diferentes del transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2 o una de sus variantes, seleccionados de entre los transcritos IL7R-002 de SEC ID n° 3, IL7R-003 de SEC ID n° 4, IL7R-005 de SEC ID n° 6, e IL7R-007 de SEC ID n° 8 y sus variantes.

15. Kit para la medición, in vitro o ex vivo, de la cantidad de por lo menos un transcrito del gen IL7R en una muestra biológica, correspondiendo dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R al transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2 o a una de sus variantes, presentando la secuencia de una variante por lo menos el 99% de identidad con dicha secuencia, y correspondiendo preferentemente al transcrito IL7R-001 de SEC ID n° 2, comprendiendo dicho kit:

- unas herramientas o reactivos específicos que permiten medir la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R en dicha muestra biológica, y

- una muestra de control que es una muestra calibrada para contener la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que corresponde a la cantidad media medida en un acervo de muestras de pacientes que han sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, de los que se sabe que no han experimentado ninguna complicación, y preferentemente a las cuales se sabe que han sobrevivido, y/o una muestra de control que es una muestra calibrada para contener la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R que corresponde a la cantidad media medida en un acervo de muestras de pacientes que han sufrido una agresión o una infección que genera un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, de los que se sabe que han experimentado una complicación, y preferentemente a las que se sabe que no han sobrevivido.

16. Kit según la reivindicación 15, caracterizado por que contiene, como reactivos específicos que permiten la medición de la cantidad de dicho por lo menos un transcrito del gen IL7R en dicha muestra biológica, por lo menos uno de los pares de cebadores de amplificación siguientes, con o sin la sonda mencionada:

- cebador sentido de SEC ID n° 12 y cebador antisentido de SEC ID n° 13, y eventualmente sonda de SEC ID n° 14; - cebador sentido de SEC ID n° 15 y cebador antisentido de SEC ID n° 16, y eventualmente sonda de SEC ID n° 17; - cebador sentido de SEC ID n° 18 y cebador antisentido de SEC ID n° 19, y eventualmente sonda de SEC ID n° 20.