CN102994535B - 一种基因定向克隆用tc载体及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因定向克隆用TC载体及其制备和使用方法，该载体两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。其制备方法包括：a.填充序列的引物设计，由此得到引物1和引物2；b.在引物1和引物2引发下，以供体载体作DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，即填充序列；c.将该填充序列克隆到目标载体，从而形成前TC载体；d.内切酶酶切该前TC载体并回收载体片段就可得到TC载体。其使用方法包括：a.制备TC载体；b.设计一对待定向克隆基因的PCR引物；c.用这对引物和Taq酶扩增待定向克隆基因并将产物连接于TC载体即可获得定向克隆重组载体。本发明提高了从通用目的载体出发进行的重组载体的构建的工作效率，可减低实验成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说是一种便于基因定向克隆的基因工程载体TC载体及其制备以及基因定向克隆的方法。
背景技术
目前定向克隆技术主要有以下几种方法：（1）通过一种限制性核酸内切酶消化载体，也用这种酶（或同尾酶）消化外源基因片段，然后将载体与外源基因片段通过T4 DNA连接酶催化连接，重组克隆包含方向不定（两种方向）的外源基因片段。借助于限制性核酸内切酶消化或其他方法从无定向克隆中筛选外源片段方向符合目的要求的克隆。这种方法缺点是：载体两个末端自我连接严重，后期筛选过程工作量大，并且存在较大不确定性，很可能会得不到所需方向克隆；（2）通过两种不同的限制性核酸内切酶消化载体，也用这两种酶消化外源基因片段，然后将载体与外源基因片段通过T4 DNA连接酶催化连接，重组载体即为定向克隆。该方法缺点是：步骤繁琐，工作量大，有时会很难找到合适的限性核酸内切酶位点而确定实验方案；（3）在（1）的基础上，增加外源基因片段与载体之间连接处的特殊序列，使正反向克隆中某向克隆具有或不具有某稀有限制性核酸内切酶的识别、切割位点，因而可以借助于该稀有限制性核酸内切酶筛选方向克隆的筛选。这种改进只是在一定程度上减少了（1）方法后期筛选工作量，而对其他缺点（存在较大不确定性，很可能会得不到所需方向克隆）无任何改进。总之，现有技术存在步骤繁琐、结果不确定或者难于制定实验方案等缺点。
发明内容
本发明提出一种基因定向克隆的载体（可以为质粒、噬菌体、病毒及其衍生载体等）及其制备和使用方法，从而大大方便外源基因片段定向克隆于目标载体（如细菌、酵母、植物以及动物表达载体等），克服了现有技术存在的缺陷。
本发明先将目的载体制备成具有“载体的两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基”特征的TC载体，然后只要把目的基因按照本发明所提出的PCR方法进行扩增，即可将该扩增产物直接定向连接于TC载体。对于从通用目的载体出发进行的重组载体的构建工作而言，该方法由于减少了操作步骤和实验试剂的消耗，使效率得到提高的同时，实验成本也大大降低。
本发明所提供的基因定向克隆用的TC载体是：
在该线状载体的两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基（称之为“TC载体”）。
本发明所提供的TC载体的制备方法，它包括以下步骤：
a、填充序列的引物设计
选择一段序列已知DNA序列，该DNA片段长度范围100～2000bp（该DNA频段用作目标载体改造的“填充序列”，所存在于的载体称为供体载体），针对该序列设计一对PCR扩增引物，该引物一方面与供体载体模板具有特异结合的序列，同时各有一个Xcm I或各有一个Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种的识别位点；由此得到引物1和引物2；
b、在引物1和引物2引发下，以供体载体作DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，即填充序列；
c、将该填充序列克隆到目标载体，形成前TC载体（TC载体的前体）。由于引物1和引物2两端的内切酶识别位点的简并碱基经过选择，使之被克隆于目标载体形成前TC载体后，用与a）相应的Xcm I或者Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种酶切该前TC载体，所得到的载体片段即为符合TC载体特征的载体分子：两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。
一种基因定向克隆用TC载体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
a、填充序列的引物设计
选择一段序列已知DNA片段，该DNA片段长度范围100～2000bp（该DNA片段用作改造目标载体的“填充序列”，该DNA片段序列所存在的载体称为供体载体。）；针对该序列设计一对PCR扩增引物，该引物一方面与作为模板的供体载体具有特异结合的序列，同时各有一个Xcm I或各有一个Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种内切酶的识别位点；由此得到引物1和引物2；
b、在引物1和引物2引发下，以供体载体作DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，即填充序列；
c、将该填充序列克隆到目标载体，从而形成前TC载体，即TC载体的前体分子；
通过对引物1和引物2两端的Xcm I或Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种的识别位点的简并碱基的选择，使得前TC载体经Xcm I或Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种内切酶酶切后，回收载体片段即可得到一个线性载体，其两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基，即权利要求1所述TC载体。
本发明所提供的基于上述TC载体进行的定向克隆基因的方法，它包括以下步骤：
a、填充序列的引物设计
选择一段序列已知DNA片段，该DNA片段长度范围100～2000bp，用作改造目标载体的“填充序列”。针对该序列设计一对引物，该引物一方面与目标载体的DNA模板具有特异结合的构造，同时两条引物两5’端各有一个Xcm I或各有一个Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种的识别位点；由此得到引物1和引物2；
b、用引物1和引物2对供体载体进行扩增，得到PCR产物充当填充序列；
c、将该填充序列克隆到目标载体，形成前TC载体，即TC载体的前体分子；通过对引物1和引物2两端的Xcm I或Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种的识别位点的简并碱基的选择，使得前TC载体经Xcm I或Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种内切酶酶切后，再回收载体片段即可得到一个线性载体，其两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基，即权利要求1所述TC载体；
d、设计待定向克隆基因的一对特异PCR引物，该引物对中一条引物5’端为C碱基，且另一条引物5’端为G或A或T碱基（正向还是反向引物5’端加C将决定DNA序列定向克隆的方向）；
e、在d步所设计的引物引发下，用Taq酶（或其他与Taq酶具有相同末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶）PCR扩增待克隆基因。得到的扩增产物中，将有一个3’端突出一个A碱基、另一个3’端突出一个G碱基的产物，恰与上述TC载体两3’末端匹配。将该扩增产物和TC载体连接即可得到克隆方向确定的重组DNA分子。
附图说明
图1是本发明基因定向克隆用TC载体的结构示意图。
图2是前TC载体结构示意图。
图3是本发明原理图。
图4是本发明具体实施方式中的原核表达载体pET17b的质粒图谱。
图5是本发明具体实施方式中的细胞表达载体pcDNA6/V5-His A质粒图谱。
图6是本发明具体实施方式中的植物表达载体pCAMBIA1391质粒图谱。
图7是本发明具体实施方式中定向克隆质粒的鉴定图谱。
以下结合附图对本发明做进一步的说明。
一、TC载体的制备
① 填充序列的引物设计
选择一段已知DNA序列（长度范围100～2000bp，此处用作目标载体改造用的“填充序列”的模板，所存在于的载体称为供体载体），针对该序列设计一对PCR扩增引物，该引物一方面与供体载体模板具有特异结合的序列，同时5’各有一个Xcm I或各有一个Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种的识别位点；由此得到引物1和引物2。
用该对引物PCR扩增供体载体，将所得到的PCR产物克隆于目标载体形成TC载体的前体（即前TC载体）。经Xcm I或者Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种内切酶酶切，通过对识别碱基序列中的简并的选择，使酶切后得到的载体片段符合本发明所述TC载体特征的3’端突出碱基：该线状TC载体两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。
为方便克隆，可在引物5’端添加内切酶识别位点及其末端酶切保护碱基，这对引物能扩增出的DNA序列要求一般不小于100bp、不大于2000bp。
上述引物1、引物2的设计可按本领域通用方法进行。引物中Xcm I（或Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种）识别位点的简并碱基的选择可参考下面例子（以Xcm I为例）：
1为Xcm I识别切割位点的一般形式，2、3针对简并碱基进行了碱基选择，使之酶切之后产生特殊的3’端突出碱基（序列中，“N”代表A、T、G、C碱基中的任意一种， “|”代表酶切断磷酸二酯键处），非酶切突出位置简并碱基可选择任意碱基。
②将填充序列克隆到目标载体
用经上述设计的引物1、引物2扩增出填充序列，之后利用通常的克隆技术克隆到目标载体。具体涉及的实验技术有：PCR扩增、限制内切酶酶切、连接、DNA凝胶电泳产物回收及细菌转化方法等（可参照《分子克隆实验指南》分子生物学实验手册进行）。以下给出部分可参考的实验程序：
（A）PCR反应
| DNA模板 | x 微升（10 ~100纳克） |
| 10×PCR buffer | 2微升 |
| 引物1（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| 引物2（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| dNTP（2.5微升） | 0.8微升 |
| TaKaRa LA Taq(5 U/微升) | 0. 4微升 |
| dd H2O | （16-x）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
PCR循环设定：95℃预变性3分钟；变性95℃，40秒，退火45~65℃，延伸1分钟，循环次数30~35；72℃再延伸10分钟。
（B）限制酶酶切体系及方法
| 酶切底物 | X微升（0.5~1微克） |
| 内切酶 | Y微升（2~5U） |
| RNAse A | 0.5微升（20微克/微升） |
| 10×buffer | 2微升 |
| dd H2O | （17.5-X-Y）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
37℃（或说明书推荐最适温度）保温5 ~12小时。
（C）DNA凝胶回收方法
DNA凝胶回收步骤（参考北京康为世纪公司Gel Extraction Kit，目录号：CW0525）：用对目的条带进行回收。回收方法为：①向离心管加入3倍体积溶胶液（buffer PG），50~65 ℃水浴10 分钟至胶全部溶化；②将所得溶液吸附柱中（安装在收集管上），室温静置2 分钟，12000转/分离心1分钟，倒掉收集管中废液；③向吸附柱中加650微升的漂洗液（Buffer PW），12000转/分离心1 分钟，倒掉收集管中废液；④12000转/分离心2分钟，使吸附柱中的漂洗液充分甩干，并置于室温数分钟以进一步挥发漂洗液；⑤将吸附柱置于一新离心管，并向吸附柱中滴加50 微升的洗脱液（或无菌蒸馏水），室温放置2分钟，12000 转/分 离心2分钟，收集洗脱液，电泳检查并保存于-20℃备用。
（D）连接体系
| 载体 | X微升（50~100纳克） |
| DNA片段 | Y微升（载体摩尔数的1/2~1/10） |
| 10×T4 连接酶buffer | 1微升 |
| T4 ligase（TaKaRa） | 0.5微升 |
| ddH20 | (8.5-X-Y)微升 |
| 总和 | 10微升 |
混匀后，16℃保温2~16小时。
由此得到如图2所示的前TC载体。将前TC载体经上述内切酶酶切、PCR扩增、测序等手段确定所得前TC载体的正确性。
③ 酶切前TC载体制备TC载体。
把鉴定正确的前TC载体质粒用Xcm I（或者Eam1105 I、Mbo II、Hph I、Bmr I、Hpy AV和Ahd I中的一种）酶切，回收载体片段即得到本发明的TC载体，其结构如图1所示：在线状载体的两个末端的3’端突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。
具体实验技术可参照前述“②”部分。
二、基于TC载体的定向克隆方法（TC载体的使用方法），包括以下步骤：
①设计待定向克隆基因的一对特异引物。
为使用本发明TC载体进行定向克隆，要求待定向克隆基因引物符合以下要求：一条引物5’端为C碱基，另一条引物5’端为G或A或T碱基（优选为G碱基，其次为A碱基，再次为T碱基）。
除此之外，引物设计还要尽量符合分子生物学实验所要求的其他一般原则，具体参见相关分子生物学实验手册（如前述《分子克隆实验指南》等）。这些原则包括（A）长度：一般为15~30碱基；（B）GC含量：应在45%~55%之间，PCR扩增中的复性温度（Ta）一般是较低融解温度（Tm值）引物的Tm值减去5~10℃；其他还有：C）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C。（D）引物自身不含有自身互补序列，以避免形成发夹样二级结构；（E）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；等等。
②按照①所述方法设计并合成的待定向克隆基因引物对，用Taq酶和这对引物PCR扩增待定向克隆目的基因，将扩增产物和TC载体连接即可得到克隆方向确定的重组DNA分子。
所得到的PCR产物中，一个3’端突出一个A碱基、另一个3’端突出一个G碱基的PCR扩增产物（原理如下所述）恰与上述TC载体两3’末端特异匹配，从而可以定向连接克隆于TC载体，其克隆方向取决于两条引物中的哪一条5’端是C碱基。
本发明的原理归纳总结成附图3所示概况：制备TC载体（借助于识别简并碱基的限制性内切酶进行，如前所述，Xcm I等）和PCR产物（正向引物5’端为C，反向引物5’端为G、T或A碱基），将二者按分子生物学常规连接转化筛选技术进行，得到的重组体即为定向克隆。
本发明所提供的TC载体及其制备和使用方法，其方便性在于，一旦制备了某通用载体的TC载体，后续的定向克隆工作将和常规的PCR产物的T-A克隆一样简单高效，可大大减少酶切、连接、转化、回收、提取、鉴定等步骤，其定向克隆效率可达到100%，同时也将大大降低实验成本。
以下通过具体实施例对本发明做进一步的说明。下列实施例是用于阐明本发明，而不应该被视为本发明范围。本实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得常规产品。以下三个实施例选取原核生物、动物及植物表达载体TC载体的制备及使用方法。本专业技术人员可以据此重现实验流程，或结合有关专业知识将其移植到其他载体系统。
实施例一、以大肠杆菌表达载体pET17b为例阐述该发明的实施过程
下述实施过程可以为本专业一般技术人员参考并重现或移植。
（一）TC载体制备所用出发材料
原核表达载体pET17b质粒及供体载体pUCm-T（连接有“棉铃虫精氨酸激酶1”编码基因，由此可获得将目标载体改造成TC载体实验的填充序列，GenBank登录号：EF600057，其构建图如图4所示。该序列可以用长度为100～2000bp的其他适当DNA序列代替），含有的棉铃虫精氨酸激酶1基因序列如下
（阴影处为引物结合位点）。
（二）TC载体制备用填充序列引物设计。
设计 “棉铃虫精氨酸激酶1基因”的一对特异PCR引物。该引物对5’端各加一个Xcm I识别位点；引物设计还应尽量遵循其他一般原则（可参考书籍如：《分子克隆实验指南》，萨姆布鲁克著，黄培堂译，科学出版社，2005）：（A）长度：一般为15~30碱基；（B）GC含量：应在45%~55%之间，PCR扩增中的复性温度（Ta）一般取较低融解温度（Tm值）引物的Tm值减5~10℃；（C）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C；（D）引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；（E）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；等等。为方便实验，在引物的5’端加限制酶识别位点（本实施例中为Nde I和Hind III，这是依据出发载体pET17b和填充序列来确定的；具体到不同实施情况，所用内切酶种类可按基本实验技术原理加以确定）及其保护碱基。
引物1和引物2中的阴影部分序列为长度为1kbp的基因序列的特异性引物；……部分
为Xcm I识别位点；——部分分别为Nde I和Hind III识别位点。
（三）用引物1和引物2对模板进行扩增得到PCR产物，即填充序列。
反应方法
| DNA模板 | x 微升（10 ~100纳克） |
| 10×PCR buffer | 2微升 |
| 引物1（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| 引物2（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| dNTP（2.5微升） | 0.8微升 |
| TaKaRa LA Taq(5 U/微升) | 0. 4微升 |
| dd H2O | （16-x）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
PCR循环设定：95℃预变性3分钟；变性95℃，40秒，退火50℃，延伸1分钟，循环次数30~35；72℃再延伸10分钟。
（四）用Nde I和Hind III酶切“（三）”所得到的PCR产物（酶切之前需按照常规进行纯化）和pET17b质粒，之后经过电泳分离凝胶回收PCR产物和质粒载体骨架；将上述两部分连接。
）PCR产物纯化方法：①将PCR产物（反应液，经电泳检查应为单一条带）加入蒸馏水至200微升体系（1.5毫升塑料离心管中）；②加入200微升Tris-平衡酚（pH>7.8），混匀后，4℃ 12000转/分钟离心5分钟；③小心将上层水相转移到一只新1.5毫升离心管中，加入200微升氯仿混匀后4℃ 12000转/分钟离心5分钟；④再将上层水相转移到一只新1.5毫升离心管中，加入水相体积2.5倍的无水乙醇及水相体积1/10的3摩尔/升醋酸钠缓冲液（pH5.2）；⑤混匀后置于冰箱冷冻（-20℃）10分钟；⑥ 4℃ 12000转/分钟离心10分钟，小心弃上清，加入500微升70%乙醇，4℃ 12000转/分钟离心5分钟，小心弃上清后室温下晾干；⑦最后加入适量（10~20微升）无菌去离子水溶解。
）限制酶酶切体系及方法（大连TaKaRa公司）
37℃保温5 ~12小时。
）DNA凝胶回收方法
DNA凝胶回收步骤（参考北京康为世纪公司Gel Extraction Kit使用说明书）：用对目的条带进行回收。回收方法为：①向离心管加入3倍体积溶胶液（buffer PG），50~65 ℃水浴10 分钟至胶全部溶化；②将所得溶液吸附柱中（安装在收集管上），室温静置2 分钟，12000转/分钟离心1分钟，倒掉收集管中废液；③向吸附柱中加650微升的漂洗液（Buffer PW），12000 转/分钟 离心1 分钟，倒掉收集管中废液；④12000 转/分钟离心2分钟，使吸附柱中的漂洗液充分甩干，并置于室温数分钟以进一步挥发漂洗液；⑤将吸附柱置于一新离心管，并向吸附柱中滴加50 微升的洗脱液（或无菌蒸馏水），室温放置2分钟，12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱液，电泳检查并保存于-20℃备用。
）DNA连接方法
连接体系
| 载体 | X微升（50~100纳克） |
| DNA片段 | Y微升（载体摩尔数的1/2~1/10） |
| 10×T4 连接酶buffer | 1微升 |
| T4 ligase（TaKaRa） | 0.5微升 |
| ddH20 | (8.5-X-Y)微升 |
| 总和 | 10微升 |
混匀后，16℃保温2~16小时。
（五）将上述两部分用T4 DNA连接酶连接后，经转化筛选重组克隆。
该重组克隆（即为pET17b 前TC载体）经Xcm I酶切，即可得到一个3’端突出T另一个3’端突出C的双链线状双链DNA载体分子（命名为TC载体）。
重组克隆方法可参照本领域中常规方法，如：
1）大肠杆菌感受态细胞的制备：
① 取大肠杆菌DH5α单菌落接种于5毫升 LB液体培养基（不含抗生素），37℃、220转/分钟振荡培养过夜；
②取1毫升过夜培养物加入到100毫升（接菌比例1:100） LB液体培养基中，37℃振荡培养120~150分钟，待细菌达到对数生长期（菌液OD600为0.2～0.5）；
③将培养液转移到两只预冷的50毫升无菌离心管中，置冰上10分钟，使菌液冷却到0℃， 4℃、5000转/分钟离心5分钟，弃上清；
④每只离心管加入10毫升冰冷的0.1摩尔/升无菌CaCl2将菌体重悬，冰浴放置30分钟， 4℃、5000转/分钟离心5分钟，去上清；
⑤每只离心管各加入1.5毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl2（含15%甘油）重悬沉淀，按每管100微升分装于无菌1.5毫升微量离心管中，置-80℃保存备用。
）转化方法：
将DNA 连接产物加到100微升DH5α的CaCl2感受态细胞中（或其他常用大肠杆菌克隆宿主），轻轻混匀，碎冰上放置30分钟；将离心管放到42℃水浴中热激90秒；随后立即将离心管置于碎冰冰浴2-3分钟；之后加入500微升Luria Broth 液体培养基，37℃、100~150转/分震荡培养45~60分钟；分别取上述培养物涂到含氨苄青霉素（50微克/毫升）的Luria-Bertani（LB）固体培养基上。37℃倒置培养过夜。
）碱裂解法制备质粒DNA（参见《分子克隆实验指南》）。
①挑平板上的单菌落接种于5毫升LB液体培养基（即LB培养基，含50微克/毫升氨苄青霉素）中，37℃、150转/分钟震荡培养10~16小时（菌液浑浊），取1.5毫升到1.5毫升塑料离心管中，12000转/分钟离心1分钟，倒掉液体培养基。
④取1.5毫升菌液于1.5毫升离心管，室温10000转/分钟离心1分钟，弃上清。
③加100微升溶液Ⅰ[其中含：50毫摩尔/升 葡萄糖；25毫摩尔/升 Tris-HCl（pH8.0）；10毫摩尔/升 EDTA（pH8.0）]悬浮菌体；
④加入200微升溶液Ⅱ（用前将0.4摩尔/升 NaOH和2% SDS等体积混合即可使用），轻轻颠倒充分混匀，冰浴5分钟；
⑤加入150微升冷溶液Ⅲ（其中含3摩尔/升 KAc-HAc pH 4.8），颠倒混匀，冰浴5分钟；
⑥12000 转/分钟 4℃离心5分钟，取上清，加等体积的Tis-饱和酚：氯仿/异戊醇（25：24：1）溶液，上下颠倒混匀，12000转/分钟 4℃离心5分钟，取上清；
⑦加入2倍体积冰冷的无水乙醇，冰浴15 分钟，12000 转/分钟离心5分钟，弃上清；
⑧加入500微升70%乙醇，12000 转/分钟 4℃离心5分钟，弃上清，将管倒置于滤纸上以流净残液，自然干燥。取适量用于琼脂糖电泳检查提取质粒。
）通过限制内切酶酶切鉴定重组克隆：
①限制酶酶切体系及方法（大连TaKaRa公司）
| 质粒 | X微升（0.5~1微克） |
| TaKaRa Hind III | 0.5微升（7U） |
| TaKaRa Nde I | 0.5微升（5U） |
| RNAse A | 0.5微升（20微克/微升） |
| 10×K buffer | 2微升 |
| dd H2O | （16.5-X）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
37℃保温5 ~12小时，电泳检查。符合要求的重组质粒应能切出大约1000bp片段，而pET17b质粒（空载体）切不出电泳可见DNA片段。
将酶切正确质粒送生物技术公司（例如北京六合华大公司）测序分析（可用T7启动子或T7终止子引物）。
②用Xcm I（美国NEB公司）酶切pET17b前TC载体获得本发明的TC载体。
| 质粒 | X微升（0.5~1微克） |
| Xcm I | 1微升（15U） |
| 10×NEB buffer 2 | 2微升 |
| RNAse A | 0.5微升（20微克/微升） |
| dd H2O | （16.5-X）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
本步实验得到的前TC载体可以作为生产用原材料，经大量扩繁后提取质粒，用Xcm I酶切电泳回收即可生产商品化TC载体，用于基因原核表达的定向克隆工作。
（六）原核表达载体的基因定向克隆
为欲定向克隆的基因（在本例中，选用马铃薯非共生血红蛋白编码基因stHB1，GenBank登录号：AY151389.1，已经克隆于T-easy 质粒载体）设计一对引物。
本发明要求定向克隆引物需要在正向引物5’端额外加一个G碱基，或者T、A碱基，反向引物5’端末端额外加一个C碱基。除此之外，引物设计还要符合一般的设计原则（可参见《分子克隆实验指南》等分子生物学实验手册）。这些原则包括（A）长度：一般为15~30碱基；（B）GC含量：应在45%~55%之间，PCR扩增中的复性温度（Ta）一般是较低融解温度（Tm值）引物的Tm值减去5~10℃；（C）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C；（D）引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；（E）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；等等。具体操作可借助于引物设计软件（如Primer Premier 5.0）进行。
委托生物技术公司合成引物后，在Taq酶催化下，用该引物对扩增目的基因，产物经纯化后与步骤3）所得TC载体连接即可得到的重组分子即为定向克隆重组载体。
（马铃薯非共生血红蛋白编码基因stHB1，阴影所示为引物序列的模板对应部分）
正向引物：5’-GATGAGTAGC TTTAGTGAAG-3’
反向引物：5’-CTACTTCATCTCAGTCTTGA-3’
用正向引物和反向引物对模板进行扩增得到的产物：
PCR反应方法
| DNA模板 | X 微升（10 ~100纳克） |
| 10×PCR buffer | 2微升 |
| 正向（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| 反向（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| dNTP（2.5微摩尔/升） | 0.8微升 |
| TaKaRa rTaq(5 U/微升) | 0. 2微升 |
| dd H2O | （16.2-X）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
PCR循环设定：95℃预变性3分钟；变性95℃，40秒，退火50℃，延伸30秒，循环次数30；72℃再延伸10分钟。
PCR产物按照前述电泳回收方法回收目的产物；经前述方法连接转化，之后挑取单菌落提取质粒，并用PCR方法鉴定是否为重组克隆(用“正向引物”和“反向引物”)。原核表达载体的正确性可经测序公司测序确认。
对马铃薯stHB1基因定向克隆得到的质粒进行Nde I和Hind III双酶切鉴定，其鉴定结果如图7所示， 图中“1-10”号为待鉴定定向克隆质粒，“-”为非重组的pET17b空质粒。结果表明1-10号全部切出了大小约为650bp（DNA Marker为TaKaRa公司DL2000）的外源基因片段，全为定向重组质粒，达到了100%。
实施例二、以哺乳细胞表达载体pcDNA6/V5-His A（美国Invitrogen公司，产品目录号V220-01）为例阐述该发明的实施过程。
下述实施过程可以为本专业一般技术人员参考并重现或移植。
（一）TC载体制备所用出发材料
哺乳细胞表达载体pcDNA6/V5-His A质粒及供体载体pUCm-T（连接有棉铃虫精氨酸激酶1编码基因，GenBank登录号：EF600057，其构建图如图5所示由此序列获本实施例的填充序列。该序列可以用长度为100～2000bp的其他DNA序列代替），棉铃虫精氨酸激酶1编码基因序列如下
（棉铃虫精氨酸激酶1编码基因序列，阴影所示为引物序列的模板对应部分）
（二）TC载体制备用引物设计
设计前述“棉铃虫精氨酸激酶1基因”的一对特异引物。在引物对的5’端各加一个Xcm I识别位点。引物设计参见有关生物学实验手册（如前述《分子克隆实验指南》）。这些原则包括（A）长度：一般为15~30碱基；（B）GC含量：应在45%~55%之间，PCR扩增中的复性温度（Ta）一般是较低融解温度（Tm值）引物的Tm值减去5~10℃；（C）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C；（D）引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；（E）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；等等。为方便实验，在引物的5’端加限制酶识别位点（本实施例中，此处为Hind III和Xho I，是依据pcDNA6/V5-His A载体结构确定的；具体到不同实施情况，所用内切酶种类可按基本实验技术原理加以确定）及其保护碱基。
引物1和引物2中的阴影部分序列为长度为1kbp的基因序列的特异性引物；……部分为Xcm I识别位点；——部分分别为HindIII和Xho I识别位点。
（三）用引物1和引物2对模板进行扩增得到的产物。
反应方法
| DNA模板 | x 微升（10 ~100纳克） |
| 10×PCR buffer | 2微升 |
| 引物1（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| 引物2（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| dNTP（2.5微升） | 0.8微升 |
| TaKaRa LA Taq(5 U/微升) | 0. 4微升 |
| dd H2O | （16-x）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
PCR循环设定：95℃预变性3分钟；变性95℃，40秒，退火50℃，延伸1分钟，循环次数30~35；72℃再延伸10分钟。
（四）用HindIII和Xho I酶切“（三）”所得到的PCR产物（酶切之前需纯化）和pcDNA6/V5-His A质粒，之后经过电泳分离凝胶回收PCR产物和质粒载体骨架；将上述两部分连接。
1）PCR产物纯化方法：①将PCR产物（反应液，经电泳检查应为单一条带）加入蒸馏水至200微升体系（1.5毫升塑料离心管中）；②加入200微升Tris-平衡酚（pH>7.8），混匀后，4℃ 12000转/分钟离心5分钟；③小心将上层水相转移到一只新1.5毫升离心管中，加入200微升氯仿混匀后4℃ 12000转/分钟离心5分钟；④再将上层水相转移到一只新1.5毫升离心管中，加入水相体积2.5倍的无水乙醇及水相体积1/10的3摩尔/升醋酸钠缓冲液（pH5.2）；⑤混匀后置于冰箱冷冻（-20℃）10分钟；⑥ 4℃ 12000转/分钟离心10分钟，小心弃上清，加入500微升70%乙醇，4℃ 12000转/分钟离心5分钟，小心弃上清后室温下晾干；⑦最后加入适量（10~20微升）无菌去离子水溶解。
2）限制酶酶切体系及方法（大连TaKaRa公司产工具酶）
| pcDNA6/V5-His A | X微升（0.5~1微克） |
| TaKaRa Hind III | 0.5微升（7U） |
| TaKaRa Xho I | 0.5微升（5U） |
| RNAse A | 0.5微升（20微克/微升） |
| 10×M buffer | 2微升 |
| dd H2O | （16.5-X）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
37℃保温5 ~12小时。
3）DNA凝胶回收方法
DNA凝胶回收步骤（参考北京康为世纪公司Gel Extraction Kit使用说明书）：用对目的条带进行回收。回收方法为：①向离心管加入3倍体积溶胶液（buffer PG），50~65 ℃水浴10 分钟至胶全部溶化；②将所得溶液吸附柱中（安装在收集管上），室温静置2 分钟，12000转/分钟离心1分钟，倒掉收集管中废液；③向吸附柱中加650微升的漂洗液（Buffer PW），12000 转/分钟 离心1 分钟，倒掉收集管中废液；④12000 转/分钟离心2分钟，使吸附柱中的漂洗液充分甩干，并置于室温数分钟以进一步挥发漂洗液；⑤将吸附柱置于一新离心管，并向吸附柱中滴加50 微升的洗脱液（或无菌蒸馏水），室温放置2分钟，12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱液，电泳检查并保存于-20℃备用。
4）DNA连接方法
连接体系
| 载体 | X微升（50~100纳克） |
| DNA片段 | Y微升（载体摩尔数的1/2~1/10） |
| 10×T4 连接酶buffer | 1微升 |
| T4 ligase（TaKaRa） | 0.5微升 |
| ddH20 | (8.5-X-Y)微升 |
| 总和 | 10微升 |
混匀后，16℃保温2~16小时。
（五）将上述两部分用T4 DNA连接酶连接后，经转化筛选重组克隆。
该重组克隆（即为pcDNA6/V5-His A 前TC载体）经Xcm I酶切，即可得到一个3’端突出T、另一个3’端突出C的线状双链DNA载体分子（命名为TC载体）。
1）大肠杆菌感受态细胞的制备：
① 取大肠杆菌DH5α单菌落接种于5毫升 LB液体培养基（不含抗生素），37℃、220转/分钟振荡培养过夜；
②取1毫升过夜培养物加入到100毫升（接菌比例1:100） LB液体培养基中，37℃振荡培养120~150分钟，待细菌达到对数生长期（菌液OD600为0.2～0.5）；
③将培养液转移到两只预冷的50毫升无菌离心管中，置冰上10分钟，使菌液冷却到0℃， 4℃、5000转/分钟离心5分钟，弃上清；
④每只离心管加入10毫升冰冷的0.1摩尔/升无菌CaCl2将菌体重悬，冰浴放置30分钟， 4℃、5000转/分钟离心5分钟，去上清；
⑤每只离心管各加入1.5毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl2（含15%甘油）重悬沉淀，按每管100微升分装于无菌1.5毫升微量离心管中，置-80℃保存备用。
2）转化方法：
将DNA 连接产物加到100微升DH5α的CaCl2感受态细胞中（或其他常用大肠杆菌克隆宿主），轻轻混匀，碎冰上放置30分钟；将离心管放到42℃水浴中热激90秒；随后立即将离心管置于碎冰冰浴2-3分钟；之后加入500微升Luria Broth 液体培养基，37℃、100~150转/分震荡培养45~60分钟；分别取上述培养物涂到含氨苄青霉素（50微克/毫升）的Luria-Bertani（LB）固体培养基上。37℃倒置培养过夜。
3）碱裂解法制备质粒DNA（参见《分子克隆实验指南》）。
①挑平板上的单菌落接种于5毫升LB液体培养基（即LB培养基，含50微克/毫升氨苄青霉素）中，37℃、150转/分钟震荡培养10~16小时（菌液浑浊），取1.5毫升到1.5毫升塑料离心管中，12000转/分钟离心1分钟，倒掉液体培养基。
⑤取1.5毫升菌液于1.5毫升离心管，室温10000转/分钟离心1分钟，弃上清。
③加100微升溶液Ⅰ[其中含：50毫摩尔/升 葡萄糖；25毫摩尔/升 Tris-HCl（pH8.0）；10毫摩尔/升 EDTA（pH8.0）]悬浮菌体；
④加入200微升溶液Ⅱ（用前将0.4摩尔/升 NaOH和2% SDS等体积混合即可使用），轻轻颠倒充分混匀，冰浴5分钟；
⑤加入150微升冷溶液Ⅲ（其中含：3摩尔/升 KAc-HAc pH 4.8），颠倒混匀，冰浴5分钟；
⑥12000 转/分钟 4℃离心5分钟，取上清，加等体积的Tis-饱和酚：氯仿/异戊醇（25：24：1）溶液，上下颠倒混匀，12000转/分钟 4℃离心5分钟，取上清；
⑦加入2倍体积冰冷的无水乙醇，冰浴15 分钟，12000 转/分钟离心5分钟，弃上清；
⑧加入500微升70%乙醇，12000 转/分钟 4℃离心5分钟，弃上清，将管倒置于滤纸上以流净残液，自然干燥。取适量用于琼脂糖电泳检查提取质粒。
4）通过限制内切酶酶切鉴定重组克隆：
①限制酶酶切体系及方法（大连TaKaRa公司产工具酶）
| 质粒 | X微升（0.5~1微克） |
| TaKaRa Hind III | 0.5微升（7U） |
| TaKaRa XhoI | 0.5微升（5U） |
| RNAse A | 0.5微升（20微克/微升） |
| 10×K buffer | 2微升 |
| dd H2O | （16.5-X）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
37℃保温5~12小时，电泳检查。符合要求的重组质粒应能切出大约1000bp片段，而pcDNA6/V5-His A质粒（空载体）切不出电泳可见DNA片段。
将酶切正确质粒送生物技术公司（例如北京六合华大公司）测序分析（可用T7启动子引物）。
②用Xcm I（美国NEB公司）酶切pcDNA6/V5-His A前TC载体获得本发明的TC载体。
| 质粒 | X微升（0.5~1微克） |
| Xcm I | 1微升（15U） |
| 10×NEB buffer 2 | 2微升 |
| RNAse A | 0.5微升（20微克/微升） |
| dd H2O | （16.5-X）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
本步实验得到的前TC载体可以作为生产用原材料，经大量扩繁后提取质粒，用Xcm I酶切电泳回收即可生产商品化TC载体，用于基因哺乳细胞表达的定向克隆工作。
（六）基因哺乳细胞表达载体构建中的定向克隆
为欲定向克隆的基因（在本实施例中，选用马铃薯非共生血红蛋白编码基因stHb1，GenBank登录号：AY151389.1，已经克隆于T-easy 质粒载体）设计一对引物。
引物设计原则参见一般分子生物学实验手册（如前述《分子克隆实验指南》）。这些原则包括（A）长度：一般为15~30碱基；（B）GC含量：应在45%~55%之间，PCR扩增中的复性温度（Ta）一般是较低融解温度（Tm值）引物的Tm值减去5~10℃；（C）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C；（D）引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；（E）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；等等。具体操作可借助于引物设计软件（如Primer Premier 5.0）进行。
需要注意，本发明要求定向克隆引物需要在上述常规引物对的正向引物5’端额外加一个G碱基，或者T、A碱基，反向引物5’端末端额外加一个C碱基，委托生物技术公司（例如上海生物工程供公司）合成后。在Taq酶催化下，用该引物对扩增目的基因，产物经纯化后与 步骤3）所得到的TC载体连接所得到的重组分子即为定向克隆重组载体
（马铃薯非共生血红蛋白编码基因stHb1序列，阴影所示为引物在模板上的结合位置）
正向引物：5’-GATGAGTAGC TTTAGTGAAG-3’
反向引物：5’-CTACTTCATCTCAGTCTTGA-3’
用正向引物和反向引物对模板进行扩增的反应体系及热循环程序：
PCR反应方法
| DNA模板 | x 微升（10 ~100纳克） |
| 10×PCR buffer | 2微升 |
| 正向（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| 反向（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| dNTP（2.5微摩尔/升） | 0.8微升 |
| TaKaRa rTaq(5 U/微升) | 0. 2微升 |
| dd H2O | （16.2-x）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
PCR循环设定：95℃预变性3分钟；变性95℃，40秒，退火50℃，延伸30秒，循环次数30；72℃再延伸10分钟。
PCR产物按照前述电泳回收方法回收目的产物；经前述方法连接转化，之后挑取单菌落提取质粒，并用PCR方法鉴定是否为重组克隆。最后经测序公司测序确认。
实施例三、以植物表达载体pCAMBIA1391（农杆菌介导遗传转化二元Ti质粒载体）为例阐述该发明的实施过程。
下述实施过程可以为本专业一般技术人员参考并重现。
（一）TC载体制备所用出发材料
植物表达载体pCAMBIA1391（GenBank 登录号：AF234308，在植物基因工程或分子生物学研究中用于启动子活性分析）质粒如图6所示及pUCm-T（连接有棉铃虫精氨酸激酶1编码基因，充当填充序列，GenBank登录号：EF600057。该序列可以用长度为100～2000bp的其他DNA序列代替）。
棉铃虫精氨酸激酶1编码基因序列如下
（阴影处为引物在模板上的结合位点）。
（二）pCAMBIA1391 TC载体制备用引物设计
设计前述“棉铃虫精氨酸激酶1基因”的一对特异引物。引物设计原则参见一般分子生物学实验手册（如前述《分子克隆实验指南》）。这些原则包括（A）长度：一般为15~30碱基；（B）GC含量：应在45%~55%之间，PCR扩增中的复性温度（Ta）一般是较低融解温度（Tm值）引物的Tm值减去5~10℃；（C）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C；（D）引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；（E）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；等等。为方便实验，在引物的5’端加限制酶识别位点（此处为Hind III和EcoR I，依据pCAMBIA1391序列结构确定；具体到不同实施情况，所用内切酶种类可按照基本实验技术原理加以确定）及其保护碱基。
引物1和引物2中的阴影部分序列为长度为1kbp的基因序列的特异性引物；……部分
为Ahd I识别位点；——部分分别为Hind III和EcoR I识别位点。
（三）用引物1和引物2对模板进行扩增得到的产物。
反应方法
| DNA模板 | x 微升（10 ~100纳克） |
| 10×PCR buffer | 2微升 |
| 引物1（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| 引物2（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| dNTP（2.5微升） | 0.8微升 |
| TaKaRa LA Taq(5 U/微升) | 0. 4微升 |
| dd H2O | （16-x）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
PCR循环设定：95℃预变性3分钟；变性95℃，40秒，退火50℃，延伸1分钟，循环次数30~35；72℃再延伸10分钟。
（四）用EcoR I和Hind III酶切“三”所得到的PCR产物（酶切之前需纯化）和pCAMBIA1391质粒，之后经过电泳分离凝胶回收PCR产物和质粒载体骨架；将上述两部分连接。
1）PCR产物纯化方法：①将PCR产物（反应液，经电泳检查应为单一条带）加入蒸馏水至200微升体系（1.5毫升塑料离心管中）；②加入200微升Tris-平衡酚（pH>7.8），混匀后，4℃ 12000转/分钟离心5分钟；③小心将上层水相转移到一只新1.5毫升离心管中，加入200微升氯仿混匀后4℃ 12000转/分钟离心5分钟；④再将上层水相转移到一只新1.5毫升离心管中，加入水相体积2.5倍的无水乙醇及水相体积1/10的3摩尔/升醋酸钠缓冲液（pH5.2）；⑤混匀后置于冰箱冷冻（-20℃）10分钟；⑥ 4℃ 12000转/分钟离心10分钟，小心弃上清，加入500微升70%乙醇，4℃ 12000转/分钟离心5分钟，小心弃上清后室温下晾干；⑦最后加入适量（10~20微升）无菌去离子水溶解。
2）限制酶酶切体系及方法（大连TaKaRa公司产工具酶）
| pCAMBIA1391质粒 | X微升（0.5~1微克） |
| TaKaRa Hind III | 0.5微升（7U） |
| TaKaRa EcoR I | 0.5微升（5U） |
| RNAse A | 0.5微升（20微克/微升） |
| 10×M buffer | 2微升 |
| dd H2O | （16.5-X）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
37℃保温5 ~12小时。
3）DNA凝胶回收方法
DNA凝胶回收步骤（参考北京康为世纪公司Gel Extraction Kit使用说明书）：用对目的条带进行回收。回收方法为：①向离心管加入3倍体积溶胶液（buffer PG），50~65 ℃水浴10 分钟至胶全部溶化；②将所得溶液吸附柱中（安装在收集管上），室温静置2 分钟，12000转/分钟离心1分钟，倒掉收集管中废液；③向吸附柱中加650微升的漂洗液（Buffer PW），12000 转/分钟 离心1 分钟，倒掉收集管中废液；④12000 转/分钟离心2分钟，使吸附柱中的漂洗液充分甩干，并置于室温数分钟以进一步挥发漂洗液；⑤将吸附柱置于一新离心管，并向吸附柱中滴加50 微升的洗脱液（或无菌蒸馏水），室温放置2分钟，12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱液，电泳检查并保存于-20℃备用。
4）DNA连接方法
连接体系
| 载体 | X微升（50~100纳克） |
| DNA片段 | Y微升（载体摩尔数的1/2~1/10） |
| 10×T4 连接酶buffer | 1微升 |
| T4 ligase（TaKaRa） | 0.5微升 |
| ddH20 | (8.5-X-Y)微升 |
| 总和 | 10微升 |
混匀后，16℃保温2~16小时。
（五）将上述两部分用T4 DNA连接酶连接后，经转化筛选重组克隆。
该重组克隆（即为pCAMBIA1391 前TC载体）经Xcm I酶切，即可得到一个3’端突出T另一个3’端突出C的双链线状双链DNA载体分子（命名为TC载体）。
1）大肠杆菌感受态细胞的制备：
① 取大肠杆菌DH5α单菌落接种于5毫升 LB液体培养基（不含抗生素），37℃、220转/分钟振荡培养过夜；
②取1毫升过夜培养物加入到100毫升（接菌比例1:100） LB液体培养基中，37℃振荡培养120~150分钟，待细菌达到对数生长期（菌液OD600为0.2～0.5）；
③将培养液转移到两只预冷的50毫升无菌离心管中，置冰上10分钟，使菌液冷却到0℃， 4℃、5000转/分钟离心5分钟，弃上清；
④每只离心管加入10毫升冰冷的0.1摩尔/升无菌CaCl2将菌体重悬，冰浴放置30分钟， 4℃、5000转/分钟离心5分钟，去上清；
⑤每只离心管各加入1.5毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl2（含15%甘油）重悬沉淀，按每管100微升分装于无菌1.5毫升微量离心管中，置-80℃保存备用。
2）转化方法：
将DNA 连接产物加到100微升DH5α的CaCl2感受态细胞中（或其他常用大肠杆菌克隆宿主），轻轻混匀，碎冰上放置30分钟；将离心管放到42℃水浴中热激90秒；随后立即将离心管置于碎冰冰浴2-3分钟；之后加入500微升Luria Broth 液体培养基，37℃、100~150转/分震荡培养45~60分钟；分别取上述培养物涂到含卡纳霉素（50微克/毫升）的Luria-Bertani（LB）固体培养基上。37℃倒置培养过夜。
3）碱裂解法制备质粒DNA（参见《分子克隆实验指南》）。
①挑平板上的单菌落接种于5毫升LB液体培养基（即LB培养基，含50微克/毫升卡纳霉素）中，37℃、150转/分钟震荡培养10~16小时（菌液浑浊），取1.5毫升到1.5毫升塑料离心管中，12000转/分钟离心1分钟，倒掉液体培养基。
⑥ 取1.5毫升菌液于1.5毫升离心管，室温10000转/分钟离心1分钟，弃上清。
③加100微升溶液Ⅰ[其中含：50毫摩尔/升 葡萄糖；25毫摩尔/升 Tris-HCl（pH8.0）；10毫摩尔/升 EDTA（pH8.0）]悬浮菌体；
④加入200微升溶液Ⅱ（用前将0.4摩尔/升 NaOH和2% SDS等体积混合即可使用），轻轻颠倒充分混匀，冰浴5分钟；
⑤加入150微升冷溶液Ⅲ（其中含：3摩尔/升 KAc-HAc pH 4.8），颠倒混匀，冰浴5分钟；
⑥12000 转/分钟 4℃离心5分钟，取上清，加等体积的Tis-饱和酚：氯仿/异戊醇（25：24：1）溶液，上下颠倒混匀，12000转/分钟 4℃离心5分钟，取上清；
⑦加入2倍体积冰冷的无水乙醇，冰浴15 分钟，12000 转/分钟离心5分钟，弃上清；
⑧加入500微升70%乙醇，12000 转/分钟 4℃离心5分钟，弃上清，将管倒置于滤纸上以流净残液，自然干燥。取适量用于琼脂糖电泳检查提取质粒。
4）通过限制内切酶酶切鉴定重组克隆：
①限制酶酶切体系及方法（大连TaKaRa公司产工具酶）
| 质粒 | X微升（0.5~1微克） |
| TaKaRa Hind III | 0.5微升（7U） |
| TaKaRa EcoR I | 0.5微升（5U） |
| RNAse A | 0.5微升（20微克/微升） |
| 10×K buffer | 2微升 |
| dd H2O | （16.5-X）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
37℃保温5~12小时，电泳检查。符合要求的重组质粒应能切出大约1000bp片段，而pCAMBIA1391质粒（空载体）切不出电泳可见DNA片段。
将酶切正确质粒送生物技术公司（例如北京六合华大公司）测序分析（可用引物1或引物2）。
②用Ahd I（美国NEB公司）酶切pCAMBIA1391前TC载体获得本发明的TC载体。
| 质粒 | X微升（0.5~1微克） |
| Ahd I | 1微升（15U） |
| 10×NEB buffer 2 | 2微升 |
| RNAse A | 0.5微升（20微克/微升） |
| dd H2O | （16.5-X）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
本步实验得到的前TC载体可以作为生产用原材料，经大量扩繁后提取质粒，用Ahd I酶切电泳回收即可生产商品化TC载体，用于植物基因工程等研究中的定向克隆工作。
（六）植物表达载体构建中的定向克隆
为欲定向克隆的DNA序列设计一对引物。在本例中，选用番茄果实成熟特异乙烯响应基因E8的启动子序列为例，GenBank登录号：AF515784，已经克隆于T-easy 质粒载体。
使用本发明的TC植物定向克隆载体进行定向克隆，需要先设计并合成一对基因特异引物，要求引物对中，正向引物5’端额外加一个G碱基，或者T、A碱基，反向引物5’端末端额外加一个C碱基。同时，引物的设计还要符合其他原则（可参考《分子克隆实验指南》等分子生物学实验手册）。这些原则包括（A）长度：一般为15~30碱基；（B）GC含量：应在45%~55%之间，PCR扩增中的复性温度（Ta）一般是较低融解温度（Tm值）引物的Tm值减去5~10℃；（C）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C；（D）引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；（E）两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；等等。具体操作可借助于引物设计软件（如Primer Premier 5.0）进行。
委托生物技术公司合成引物。在Taq酶催化下，用该引物对扩增目的基因，产物经纯化后与步骤3）所得到的TC载体连接即可得到的重组分子即为定向克隆重组载体。
（阴影所示为引物在模板上的结合位置）。
正向引物：5’-GTCCCTAATGA TATTGTTCAT -3’
反向引物：5’-CTCTTTTGCACTGTGAATGAT-3’
用正向引物和反向引物对模板进行扩增得到的产物：
PCR反应方法
| DNA模板 | x 微升（10 ~100纳克） |
| 10×PCR buffer | 2微升 |
| 正向（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| 反向（10微摩尔/升） | 0.4微升 |
| dNTP（2.5微摩尔/升） | 0.8微升 |
| TaKaRa rTaq(5 U/微升) | 0. 2微升 |
| dd H2O | （16.2-x）微升 |
| 总体系 | 20微升 |
PCR循环设定：95℃预变性3分钟；变性95℃，40秒，退火50℃，延伸120秒，循环次数30；72℃再延伸10分钟。
PCR产物按照前述电泳回收方法回收目的产物；经前述方法连接转化，之后挑取单菌落提取质粒，并用PCR方法鉴定是否为重组克隆。最后经测序公司测序确认，即可得到番茄E8启动子驱动的Gus报告基因植物表达载体。用于植物基因工程等研究中的启动子活性分析实验。
Claims (3)
1.一种基因定向克隆用TC载体，其特征在于，该载体两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。
2.一种基因定向克隆用TC载体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
a、填充序列的引物设计
选择一段序列已知DNA片段，该DNA片段长度范围100～2000bp，该DNA片段用作改造目标载体的“填充序列”，该DNA片段序列所存在的载体称为供体载体；针对该序列设计一对PCR扩增引物，该引物一方面与作为模板的供体载体具有特异结合的序列，同时各有一个Xcm I内切酶的识别位点；由此得到引物1和引物2；
b、在引物1和引物2引发下，以供体载体作DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，即填充序列；
c、将该填充序列克隆到目标载体，从而形成前TC载体，即TC载体的前体分子；
通过对引物1和引物2两端的Xcm I的识别位点的简并碱基的选择，使得前TC载体经Xcm I内切酶酶切后，回收载体片段即可得到一个线性载体，其两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。
3.一种基于TC载体定向克隆基因的方法，其特征在于它包括以下步骤：
a、填充序列的引物设计
选择一段序列已知DNA片段，该DNA片段长度范围100～2000bp，该DNA片段用作改造目标载体的“填充序列”，该DNA片段序列所存在的载体称为供体载体；针对该序列设计一对引物，该引物一方面与供体载体的DNA模板具有特异结合的构造，同时两条引物两5’端各有一个Xcm I识别位点；由此得到引物1和引物2；
b、用引物1和引物2对供体载体进行扩增，得到的PCR产物充当填充序列；
c、将该填充序列克隆到目标载体，形成前TC载体，即TC载体的前体分子；通过对引物1和引物2两端的Xcm I的识别位点的简并碱基的选择，使得前TC载体经Xcm I内切酶酶切后，回收载体片段即可得到一个线性载体，其两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基；
d、设计待定向克隆基因的一对特异PCR引物，该引物对中一条引物5’端为C碱基，且另一条引物5’端为G或A或T碱基；
e、在d步所设计的引物引发下，用Taq酶PCR扩增待克隆基因得到扩增产物，其中一个3’端突出一个A碱基、另一个3’端突出一个G碱基的PCR扩增产物，与上述TC载体两3’末端匹配，将该扩增产物和TC载体通过T4 DNA连接酶催化连接即可得到克隆方向确定的重组DNA分子。
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| PCR产物靶向克隆法构建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表达与纯化;王家宁 等;《郧阳医学院学报》;20080630;第27卷(第3期);193-198 * |
| 一个通用策略用于构建新型T载体及其应用;冯辉 等;《湖北农业科学》;20070930;第46卷(第5期);671-673 * |
| 冯辉 等.一个通用策略用于构建新型T载体及其应用.《湖北农业科学》.2007,第46卷(第5期),671-673. |
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