CN102993268B

CN102993268B - 一种牡蛎壳抗氧化肽的制备方法

Info

Publication number: CN102993268B
Application number: CN2012105666965A
Authority: CN
Inventors: 邵江娟; 陈建伟; 王昱沣; 姚忠; 吴昊; 陈韬
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2032-12-24
Also published as: CN102993268A

Abstract

本发明公开了一种牡蛎壳抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：（1）牡蛎壳肽的提取：以牡蛎壳粉为原料，回流加热提取后滤过，浓缩，冻干得牡蛎壳肽冻干粉；（2）离子交换层析分离：将肽提取物通过SOURCE15Q强阴离子交换层析，收集主要峰，浓缩，冻干，得到初步纯化产物；（3）反向柱层析分离：将初步纯化产物经反向C8柱层析分离，收集主要峰，浓缩，冻干，得到牡蛎壳抗氧化肽。本发明所得的抗氧化肽具有较强的清除自由基的能力，应用广泛，具有显著的社会和经济效益。

Description

一种牡蛎壳抗氧化肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物分离技术领域，具体涉及一种以牡蛎壳为原料制备抗氧化肽的方法。

背景技术

牡蛎壳为牡蛎科动物长牡蛎（Ostrea gigas Thunberg）、大连湾牡蛎（Ostreatalienwhanensis Crosse）或近江牡蛎（Ostrea rivularis Gould）的贝壳，是历版《中国药典》收载的中医临床常用药。味咸，微寒，归肝、胆、肾经。生牡蛎重镇安神，潜阳补阴，软坚散结。现代临床应用集中于治疗癫痫，治疗失眠，治疗更年期综合症，治疗消化性溃疡，治疗多汗症等。

近年来，随着牡蛎养殖技术的推广和市场需求的扩大，牡蛎的养殖规模和生产加工能力得到大幅提高。但是，牡蛎生产加工过程中残留的大量牡蛎壳，若不能得到有效利用和妥善处理，将会严重污染乡村环境。牡蛎壳的主要成分是碳酸钙，并含有少量的磷酸钙、硫酸钙、氧化铁、铝、镁和硅等微量元素，是一种宝贵的无机盐资源。其资源化利用，古来有之，从先秦的煅制工艺，到后来道家的“炼丹术”和洛阳桥的“种蛎固基”，无不与之相关。目前，国内外已成功开发出一系列以牡蛎壳为原料的产品，包括作为药品原料的活性钙粉、作为化工产品的填充料碳酸钙粉或作为养殖业饲料添加剂钙粉等。但是对牡蛎壳有机质的研究鲜见报道，这无疑阻碍了牡蛎壳资源的进一步开发和利用。因此，为了能够更好的应用牡蛎动物药资源，阐明其药效的化学依据，有必要对其肽类化学成分和活性进行系统的研究。

生物体内正常有氧代谢过程中会形成许多活性氧物质，包括超氧阴离子自由基、羟基自由基等；另外，生物体也可经过传染、离子辐射、空气污染等外源性侵入而产生活性氧。体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会有破坏行为。大量研究已经证明，老化以及老化相关的疾病如癌症、心血管、自身免疫性疾病以及关节炎等的发生机理与体内自由基产生过多或清除自由基能力下降有着密切的关系。因此充分利用牡蛎壳资源，制成具有抗氧化活性且易于人体吸收的肽及附加产品具有重要意义。

目前已有从牡蛎肉中分离提取肽类物质的相关报道，由于牡蛎壳中含有较多碳酸钙成分，从牡蛎壳中提取纯度较高的抗氧化肽未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以牡蛎壳为原料的抗氧化肽的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种牡蛎壳抗氧化肽的制备方法，它包括如下步骤：

（1）牡蛎壳肽的提取：牡蛎壳粉碎，过60~100目筛，加入8~10倍重量的水90~100℃回流加热提取1小时，过滤，滤液浓缩，0.45μm水膜滤过，再经冻干，得牡蛎壳肽冻干粉；

（2）离子交换层析分离：将步骤（1）得到的牡蛎壳肽冻干粉溶于缓冲液A中进行离子交换层析，进样量为0.5mL，流速为1mL/min，SOURCE15Q强阴离子交换柱，检测波长为214nm，上样完毕后继续进100(v/v)%缓冲液A2到3个柱床体积，洗至基线平稳，再用50(v/v)%缓冲液A与50(v/v)%缓冲液B洗脱30min，流速为1mL/min，收集主要峰，然后浓缩，冻干，得到初步纯化产物；

其中，

缓冲液A为pH8.0的50mM Tris-HCl；配制方法：将500mL的0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与292mL的0.1mol/L的盐酸混匀后，加水稀释至1L，过滤，即为缓冲液A；

缓冲液B为pH8.0的50mM Tris-HCl+1mol/LNaCl；配制方法：将500mL的0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与292mL的0.1mol/L的盐酸混匀后，加NaCl58.44g，加水稀释至1L，过滤，即为缓冲液B；

（3）反向C8柱层析分离：将步骤（2）得到的初步纯化产物加入8~10倍重量的水溶解，利用反向C8柱进行柱层析，检测波长为214nm，设置96(v/v)%流动相A和4(v/v)%流动相B走基线平稳后，进样量为2mL，96(v/v)%流动相A和4(v/v)%流动相B洗脱4min，然后调节流动相B的比例从4(v/v)%至60(v/v)%线性梯度洗脱10min，洗脱流速一直保持在8mL/min，收集主要峰，浓缩，冻干，得到牡蛎壳抗氧化肽产物；

其中，流动相A为1(v/v)‰CF₃COOH水溶液，流动相B为CH₃OH。

步骤（1）、（2）和（3）中的浓缩条件为60℃旋转蒸发浓缩。

按照上述制备方法所制得的牡蛎壳抗氧化肽也在本发明的保护范围内。

按照上述制备方法所制得的牡蛎壳抗氧化肽在抗氧化产品中的应用也在本发明的保护范围内。

其中，所述的抗氧化产品为抗氧化药品、抗氧化保健品、抗氧化食品或抗氧化化妆品。

其中，本发明的牡蛎壳抗氧化肽，可以和药学上可接受的载体混合制备成各种剂型。

有益效果：本发明方法制备得到的牡蛎壳肽，具有很好的抗氧化活性；本发明提供的牡蛎壳抗氧化肽的制备方法，经过大量实验筛选，所得工艺各参数设计合理，能够充分利用牡蛎壳丰富资源；本发明提供的牡蛎壳抗氧化肽可以用于制备成抗氧化抗衰老药品、保健品或食品，应用范围广泛，具有良好的经济和社会效益。

附图说明

图1为离子交换层析分离谱图。

图2为反向C8柱层析分离谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：牡蛎壳抗氧化肽的制备。

实验设备：

AKTA蛋白纯化系统，Amersham Biosciences，瑞典；反向C8柱，Hamilton HxSil，瑞士；Source15Q强阴离子交换柱，Amersham Biosciences，瑞典；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；FD-1000冻干机，东京理化株式会社；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵；上海亚荣生化仪器厂。

实验过程：

（1）牡蛎壳肽的提取：牡蛎壳粉碎，过80目筛，加入9倍重量的水100℃回流加热提取1小时，过滤，滤液60℃旋转蒸发浓缩，0.45μm水膜滤过，得牡蛎壳肽提取物冻干粉；

（2）离子交换层析分离：将步骤（1）得到的牡蛎壳肽冻干粉溶于缓冲液A中进行离子交换层析，进样量为0.5mL，流速为1mL/min，SOURCE15Q强阴离子交换柱，检测波长为214nm，上样完毕后继续进100(v/v)%缓冲液A2到3个柱床体积，洗至基线平稳，再用50(v/v)%缓冲液A与50(v/v)%缓冲液B洗脱30min，流速为1mL/min，层析谱图见图1，收集主要峰，然后60℃旋转蒸发浓缩，冻干，得到初步纯化产物；

其中，

（3）反向C8柱层析分离：将步骤（2）得到的初步纯化产物加入8~10倍重量的水溶解，利用反向C8柱进行柱层析，检测波长为214nm，设置96(v/v)%流动相A和4(v/v)%流动相B走基线平稳后，进样量为2mL，96(v/v)%流动相A和4(v/v)%流动相B洗脱4min，然后调节流动相B的比例从4(v/v)%至60(v/v)%线性梯度洗脱10min，洗脱流速一直保持在8mL/min，收集主要峰，层析谱图见图2，60℃旋转蒸发浓缩，冻干，得到牡蛎壳抗氧化肽产物；

其中，流动相A为1(v/v)‰CF₃COOH水溶液，流动相B为CH₃OH。

实施例2：抗氧化实验。

1.材料及设备

实施例1制备得到的牡蛎壳肽；Pierce BCA蛋白定量试剂盒：美国Thermo公司；二苯代苦味酰肼(DPPH)：Alfa公司。BP211D电子天平：德国Sartorious公司；SpectraMax190酶标仪：美国AD公司；恒温透视水槽，上海实验仪器总厂；UV-1700分光光度仪，日本Shimadzu公司。

2.方法

2.1供试溶液制备

取上述实施例1制备的牡蛎壳肽，精密称量，加蒸馏水配制成100μg/mL的供试溶液。

2.2DPPH自由基清除能力测定

取供试品溶液1mL分别加入到干净的10mL具塞试管中，每管中再加入0.6mmol/LDPPH甲醇溶液0.5mL，然后以甲醇补充体积至5mL，30分钟室温避光反应后于517nm处测定吸光值A，空白组以等体积甲醇溶液代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和甲醇混合液空白调零。按下式计算：

清除率SA(％)＝[1-(Ai-Aj)/A₀]×100％

式中：A₀为对照组吸光度，Ai为样品组吸光度，Aj为空白组吸光度。

2.3超氧阴离子自由基清除能力测定

采用邻苯三酚自氧化法进行测定。量取50mmol/L、pH=8.20的Tris-HCl缓冲液4.7mL，加入0.1mL的供试品溶液，置于25℃水浴保温20分钟，然后加入25℃预温的3mmol/L的邻苯三酚溶液(用10mmol/LHCl配制)0.2mL，迅速摇匀后倒入比色皿中，在319nm下每隔1分钟测定吸光值一次，共反应9分钟，用10mmol/L HCl溶液为空白调零，对照组以等体积去离子水代替供试样品。作吸光度随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按下式计算样品对超氧阴离子的清除率。

清除率SA(％)＝[1-V1/V0]×100％

式中：V1为样品组的吸光度随时间的变化率，V0为空白对照组组吸光度随时间的变化率。

2.4羟自由基清除能力测定

采用不同酶解液对Fenton体系产生的羟自由基清除率的体外实验进行测定。取0.2mL的FeSO4-EDTA混合液(10.0mmol/L)于试管中，加人0.5mL的2-脱氧核糖溶液(10.0mmol/L)和0.6mL供试品溶液，用磷酸缓冲液(pH=7.4，0.1mol/L)定容至1.8mL，再加人0.2mLH₂O₂(10.0mol/L)，混匀后置于37℃恒温水浴中反应1h。然后加入2.8%(w/w)三氯乙酸(TCA)溶液1.0mL，在4000rpm下离心20分钟，取上清液2.0mL于另一支试管中，加入1.0%(w/w)硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，混匀后置沸水浴反应15分钟，冷却后稀释5倍，在532nm波长处测吸光度值。酶解液对羟自由基的清除效果用清除率(SA/％)表示，按下式计算：

清除率SA(％)＝[(Ac-As)/(Ac-A₀)]×100％

式中：Ac为不加清除剂的吸光度，As为加入供试品后的吸光度，A₀为空白的吸光度。

3、结果与讨论

3.1具体实验结果如表1所示：

表1牡蛎壳肽的抗氧化能力（浓度100μg/mL，

n=3)

由表1实验结果表明，本发明提供的方法制备得到的牡蛎壳肽具有很好清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基及羟自由基的能力。因此，本发明提供的牡蛎壳抗氧化肽有望开发成为新一代的抗氧化抗衰老的药品或者保健食品，可用于防治老化以及老化相关的疾病如癌症、心血管和自身免疫性等疾病。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种牡蛎壳抗氧化肽的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：

（1）牡蛎壳肽的提取：牡蛎壳粉碎，过60～100目筛，加入8～10倍重量的水90～100℃回流加热提取1小时，过滤，滤液浓缩，0.45μm水膜滤过，再经冻干，得牡蛎壳肽冻干粉；

（2）离子交换层析分离：将步骤（1）得到的牡蛎壳肽冻干粉溶于缓冲液A中进行离子交换层析，进样量为0.5mL，流速为1mL/min，SOURCE15Q强阴离子交换柱，检测波长为214nm，上样完毕后继续进100(v/v)%缓冲液A 2到3个柱床体积，洗至基线平稳，再用50(v/v)%缓冲液A与50(v/v)%缓冲液B洗脱30min，流速为1mL/min，收集主要峰，然后浓缩，冻干，得到初步纯化产物；

其中，缓冲液A为pH8.0的50mM Tris-HCl；缓冲液B为pH8.0的50mM Tris-HCl+1mol/LNaCl；

（3）反向C8柱层析分离：将步骤（2）得到的初步纯化产物加入8～10倍重量的水溶解，利用反向C8柱进行柱层析，检测波长为214nm，设置96(v/v)%流动相A和4(v/v)%流动相B走基线平稳后，进样量为2mL，96(v/v)%流动相A和4(v/v)%流动相B洗脱4min，然后调节流动相B的比例从4(v/v)%至60(v/v)%线性梯度洗脱10min，洗脱流速一直保持在8mL/min，收集主要峰，浓缩，冻干，得到牡蛎壳抗氧化肽产物；

其中，流动相A为1(v/v)‰CF₃COOH水溶液，流动相B为CH₃OH。

2.根据权利要求1所述的牡蛎壳抗氧化肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）、（2）和（3）中的浓缩条件为60℃旋转蒸发浓缩。

3.权利要求1或2的制备方法所制得的牡蛎壳抗氧化肽。