CN102993161B - 双环醇-亮氨酰胺及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双环醇-亮氨酰胺及其制备方法和应用。该化合物能够增加双环醇的水溶性，提高其生物利用率度，按本发明方法制备的双环醇-亮氨酰胺及其盐可用于肝病的临床治疗。本发明提供的双环醇-亮氨酰胺的制备方法先将双环醇的羟基保护，再将羟基保护双环醇的酯基水解，然后与羧基保护的亮氨酸酯化缩合，最后脱除保护基得双环醇-亮氨酰胺，该化合物结构如下：

Description

双环醇-亮氨酰胺及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物化学和有机化学领域，涉及双环醇-亮氨酰胺及其制备方法与应用。

背景技术

双环醇，化学名为4，4′-二甲氧基-5，6，5′，6′-二次甲二氧基-2-羟甲基-2′-甲氧羰基联苯，其结构式如下(Me表示甲基)：

双环醇为人工合成一种多功能多靶点的药物，具有显著的保肝降酶活性。对该药作用机制进行多方面的研究表明，双环醇的保肝降酶机制主要是通过清除自由基，从而维持细胞的完整性，使肝细胞核DNA免受损伤及减少细胞凋亡的发生，从而起到保肝作用。主要用于各种肝损伤，例如急性肝损伤。经国家食品药品监督管理局批准，双环醇片(商品名：百赛诺)于2001年上市，现已列入《国家基本医疗保险和工伤保险药品目录》乙类。

双环醇水溶性较差(以蒸馏水为介质，2小时内仅能溶出60-70％)、不能制成注射剂，口服生物利用率较低，因此应用不广。因此，有必要对双环醇的分子结构进行优化，以改善其药物性质。已有报道，通过对双环醇苯环上的2-羟甲基进行改造，来改善其分子特性。但是，没有对其苯环上的酯键位点进行过相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种双环醇-亮氨酰胺，具有与双环醇类似的药物活性，但水溶性更好，因而生物利用率更高。同时，本发明还提供该双环醇-亮氨酰胺的制备方法和应用。

本发明提供的双环醇-亮氨酰胺，其结构式如下：

[结构式中Me表示甲基]

本发明双环醇-亮氨酰胺还包括各种盐的形式例如钠盐、钾盐、钙盐等。

本发明还提供了双环醇-亮氨酰胺的制备方法，包括以下步骤：

(1)使用羟基保护基对双环醇的羟基进行保护，得羟基被保护的双环醇；

(2)将羟基被保护的双环醇酯基水解，得羟基被保护的双环醇酸；

(3)羧基保护的亮氨酸与羟基保护的双环醇酸酰胺化反应，得羟基保护的双环醇-亮氨酰胺。

(4)羟基保护的双环醇-亮氨酰胺脱保护基，得双环醇-亮氨酰胺；

其中，作为制备双环醇-亮氨酰胺方法的一种优选，双环醇羟基保护基和所用亮氨酸羧基保护基均为苄基(Bzl/Bn)苄基保护的壳氨酸的结构：

本发明还优化了制备双环醇-亮氨酰胺的反应条件：

步骤(1)中，羟基保护反应温度为5-40℃，反应时间为2-24h；羟基保护基与双环醇的摩尔比为：(1-2)∶1。

步骤(2)中，水解反应温度为50-100℃，反应时间为2-6h；所用的碱为氢氧化钠或者氢氧化钾；所用的溶剂为水、体积比1∶(0.5～2)的水-甲醇、体积比1∶(0.5～2)的水-乙醇、体积比1∶(0.5～2)的水-异丙醇或者稀丙酮水溶液。

步骤(3)中，酰胺化反应温度为5-40℃；反应时间为2-10h；酰胺化反应体系中还包括二甲氨基吡啶(DMAP)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)；保护的双环醇与保护的氨基酸的摩尔比为1∶(1-1.2)。

步骤(4)中，脱保护基反应温度为5-40℃；反应时间为2-6h；所述脱保护基反应体系为钯碳(Pd/C)；所用溶剂为甲醇。

本发明提供的双环醇-亮氨酰胺的制备方法操作简便、成本低、收率高。

本发明还提供一种药物组合物，含有双环醇-亮氨酰胺或其药用盐。本发明双环醇-亮氨酰胺或其药用盐，可以与一种或多种药用辅料，制成各种液体或固体剂型，例如片剂、粉针剂、悬浮剂、颗粒剂等。

本发明还涉及到双环醇-亮氨酰胺或其药用盐在制备治疗肝损伤药物中的应用。药理实验表明，本发明提供的双环醇-亮氨酰胺或其药用盐，能显著减轻D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤程度。而且，该类双环醇衍生物很容易成盐，水溶性好、生物利用率高，因而副作用更小。很容易制成片剂、注射剂等各种剂型，其中注射剂对治疗急性肝损伤具有特别重要的意义。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1双环醇-亮氨酰胺的制备

(1)双环醇羟基保护

将氢化纳40mg(1.6mmol)溶于20ml无水四氢呋喃(THF)中，冰浴，加入双环醇523mg(1.3mmol)搅拌10min后，滴加苄氯0.19mL(1.6mmol)，反应6h，TLC检测反应完全，加入少许水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE∶EA＝1∶1，减压浓缩得白色固体592mg。

(2)水解反应

将步骤(1)所得白色固体592mg(1.2mmol)溶于20ml10％NaOH水溶液，100℃回流反应3h，TLC检测反应完全，冷却至室温，浓盐酸调pH至2-3，产生大量白色固体，过滤，干燥残渣得白色固体546mg。

(3)酰胺化反应

将步骤(2)所得白色固体546mg(1.2mmol)溶于20mL无水二氯甲烷(DCM)中，冰浴冷却，加入16mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.12mmol)和276mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(1.44mmol)，搅拌10min。保护的亮氨酸567mg(1.44mmol)和DMAP溶于5ml二氯甲烷，搅拌10min，将该溶液加入上述溶液，反应3h。TLC检测反应完全，反应液依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE∶EA＝1∶1，减压浓缩得白色固体667mg。

(4)脱保护基反应

将步骤(3)所得固体667mg(1.0mmol)溶于5mL四氢呋喃和30mL甲醇，加入10％Pd/C150mg，氢气保护，室温反应5h，TLC检测反应完全。过滤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE∶EA＝1∶1，减压浓缩得462mg白色泡状固体，即为双环醇-亮氨酰胺。

ESI-MS：m/z[M-H]-＝488.1。四步总产率59.4％。

实施例2双环醇-亮氨酰胺对大鼠D-氨基半乳糖胺肝损伤模型的影响

1.实验材料

1.1动物

SPF级SD大鼠，体重180g～220g，雌雄各半，由南京军区总医院比较医学中心提供。随机分为4组，每组10只，即(1)空白对照组，(2)模型对照组，(3)双环醇组，(4)双环醇-亮氨酰胺组。

1.2药物

实施例1的双环醇-亮氨酰胺，双环醇。

1.3药物配制、剂量及分组

(1)空白对照组；

(2)模型对照组；

(3)双环醇组：给药双环醇，剂量为6.75mg/kg(按照临床人日服用量75mg按体表面积折算成大鼠给药剂量)；

(4)双环醇-亮氨酰胺组：给药双环醇-亮氨酰胺，剂量为6.75mg/kg。

空白对照组，模型组给予等容积溶媒，上述各组药物使用时用DMSO溶解，调节浓度至6.75mg/ml，用含10％β-环糊精的PBS1∶10稀释后灌胃。给药体积为1.0mL/100g体重。

1.4试剂

D-氨基半乳糖胺，南京博源医药科技有限公司。

β-cyclodextrin，中国医药集团上海化学试剂公司。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)IFCC法检测试剂盒，四川迈克科技有限责任公司。

天冬氨酸氨基转移酶(AST)IFCC法检测试剂盒，四川迈克科技有限责任公司。

1.5仪器

DK-8D型恒温水浴槽，上海精宏实验设备有限公司；

Sartorius电子天平，德国Sartorius公司；

OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪。

2实验方法

2.1实验步骤

建模：除空白对照组外，其余各组大鼠于第七次给药后24小时腹腔注射D-氨基半乳糖胺600mg/kg，注射体积为1.0mL/100g体重；空白组注射等量生理盐水。

给药：各组大鼠每天灌胃分别按剂量给药一次，连续给药七天。

检测：大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖胺24小时后，称体重，眼眶采血并分离血清，测定ALT和AST。颈椎脱臼处死大鼠后，进行尸检，取肝、脾、胸腺，称量并计算脏器系数(脏器重量/体重×100％)，并对肝脏组织进行病理组织学检查。

2.2病理学检查

实验结束后剖取肝脏，经10％福尔马林溶液固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4μm厚)，HE染色，在光学显微镜下阅片，检查有无下列病变：(1)有无肝细胞脂变；(2)有无肝细胞索断裂；(3)有无肝细胞坏死，嗜酸性小体形成；(4)肝窦有无扩张、充血；(5)肝小叶内有无炎细胞浸润；(6)门管区有无炎症或纤维组织增生。根据病变由轻到重的程度标记为0.5分(轻微)，1分(轻度)，2分(中度)，3分(重度)，0分(基本正常)，累加所有分数，并计算出每组每例动物的均分结果进行两个样本比较的秩和检验。

2.3数据处理

对所有数据使用Microsoft Excel软件进行数据处理，对病理学评分采用秩和检测，并统计分析结果。

3实验结果

3.1受试双环醇-亮氨酰胺对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生化指标的影响

从表1可以看出，D-氨基半乳糖胺造模组大鼠ALT、AST显著升高(P＜0.01)，表明D-氨基半乳糖胺可造成大鼠急性肝损伤，造模成功。进行双环醇-亮氨酰胺给药后，显著降低了急性实验性肝损伤大鼠ALT和AST，具有与双环醇类似的药物活性。

表1双环醇-亮氨酰胺对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生化指标的影响(n＝10)

3.2双环醇-亮氨酰胺对D-氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤病理组织学检查的影响

组织病理组织学研究表明，实验中D-氨基半乳糖胺引起的大鼠肝损伤模型主要表现为(1)肝细胞明显脂变；(2)出现较多的嗜酸性小体；(3)肝小叶内有多灶性炎细胞浸润，肝窦淤血。

双环醇-亮氨酰胺组病变较模型组明显减轻，具体试验结果如下：

肝细胞脂变：4只肝细胞有轻度或轻微脂变，其它不明显。

细胞索断裂：2只肝小叶内肝细胞索轻度或轻微断裂，其它8只不明显。

嗜酸性小体：6只大鼠肝小叶内查见嗜酸性小体，其中1只可见，5只偶见。

肝窦扩张、淤血：8只肝窦轻微淤血。

肝小叶炎及门管炎：7只肝小叶内有轻度或轻微炎细胞浸润，其中3只伴有轻度或轻微门管炎。

各组病变评分结果见表2。病变试验结果与血清生化指标基本一致。

表2双环醇-亮氨酰胺对大鼠D-氨基半乳糖胺肝损伤影响的病变评分结果

Claims (6)

1.双环醇-亮氨酰胺或其药用盐，所述双环醇-亮氨酰胺结构如下：

2.权利要求1所述的双环醇-亮氨酰胺的制备方法，包括以下步骤：

(1)使用羟基保护基对双环醇的羟基进行保护，得羟基被保护的双环醇；

(2)将羟基被保护的双环醇酯基水解，得羟基被保护的双环醇酸；

(3)羧基保护的亮氨酸与羟基保护的双环醇酸酰胺化反应，得羟基保护的双环醇-亮氨酰胺；

(4)羟基保护的双环醇-亮氨酰胺脱保护基，得双环醇-亮氨酰胺。

3.根据权利要求2所述的双环醇-亮氨酰胺的制备方法，其中双环醇羟基保护基和亮氨酸羧基保护基均为苄基。

4.根据权利要求2或3所述的双环醇-亮氨酰胺的制备方法，其中：

步骤(1)中，羟基保护反应温度为5-40℃，反应时间为2-24h；羟基保护基与双环醇的摩尔比为：(1-2)∶1；

步骤(2)中，水解反应温度为50-100℃，反应时间为2-6h；所用的碱为 氢氧化钠或者氢氧化钾；所用的溶剂为水、体积比1∶(0.5～2)的水-甲醇、体积比1∶(0.5～2)的水-乙醇、体积比1∶(0.5～2)的水-异丙醇或者稀丙酮水溶液；

步骤(3)中，酰胺化反应温度为5-40℃；反应时间为2-10h；酰胺化反应体系中还包括二甲氨基吡啶(DMAP)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)；保护的双环醇与保护的氨基酸的摩尔比为1∶(1-1.2)；

步骤(4)中，脱保护基反应温度为5-40℃；反应时间为2-6h；所述脱保护基反应体系为钯碳(Pd/C)；所用溶剂为甲醇。

5.一种药物组合物，含有权利要求1所述的双环醇-亮氨酰胺或其药用盐。

6.权利要求1所述双环醇-亮氨酰胺或其药用盐在制备治疗肝损伤药物中的应用。