CN102988462A - 一种防治水产动物寄生虫的中药制剂及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治水产动物寄生虫的中药制剂及制备方法和应用，一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，其制备步骤是：1）狼毒大戟用80%乙醇进行索氏提取，收集提取液；2）用石油醚萃取；3）用乙酸乙酯萃取，得固体残渣；4）固体残渣用乙醇洗脱，挥发溶剂得到狼毒大戟乙酸乙酯提取物；5）称取3-10g步骤4）中得到的提取物，用丙酮完全溶解后，加5-10g的乳化剂和1-2g的稳定剂，丙酮定容100ml。该方法将狼毒大戟杀虫活性成分分离出来，方法易行，操作方便，狼毒大戟提取物对鲫鱼和草鱼的安全浓度分别为2.61ppm和2.38ppm，对鱼类是比较安全的，可以应用于水产养殖生产中水产动物体外寄生虫病，适用于集约化、规模化水产养殖的需要。

Description

一种防治水产动物寄生虫的中药制剂及制备方法和应用

技术领域

本发明属于水产动物疾病防治（渔药）技术领域，更具体涉及一种防治水产动物体外寄生虫的中药制剂，同时还涉及一种防治水产动物体外寄生虫的中药溶液剂的制备方法，还涉及一种防治水产动物寄生虫的中药制剂的应用。

背景技术

鱼类寄生虫是水产养殖中的常见病、多发病，鱼体被寄生虫感染发病后，轻者体质消瘦，饵料系数上升，重者摄食、行动困难，甚至引起大面积死亡，给渔业生产造成重大损失，近年来，随着养殖密度的增加，养殖水环境的恶化，鱼类寄生虫也呈多发、频发、多样及不易根治的趋势。由于鱼类寄生虫疾病的危害日趋严重，化学合成药物的大量应用，造成抗药性、安全性、特种水产养殖动物的药敏性以及对养殖生态环境条件的破坏等问题日益突出，而使得应用植物源杀虫剂的呼声越来越高。目前，作为经验性的配方，利用天然植物防治鱼类寄生虫疾病，在水产养殖生产实践中已得到一定程度的应用，如利用苦楝防治鱼类棘头虫病；利用苦楝、毛莨合剂防治鱼类指环虫病；利用槟榔、贯众防治鱼类吸虫、线虫病等。但长期以来，植物源杀虫剂在水产上的应用更多体现在口头流传和水产养殖习惯用法上，实际生产中由于对寄生虫的生活史了解不够，导致许多错误配方长期使用；同时由于对杀虫植物的了解不够，许多经验性配方尚未真正发挥其优势，因此，需寻找新的对环境无污染易降解的天然植物杀虫药以及从天然植物中分离杀虫活性成分，进而进行仿生合成，更符合人类对健康的要求。同时，也有利于植物资源的合理利用和开发。经过多年研究发现，狼毒素对指环虫等鱼类寄生虫具有很好的杀灭作用。

狼毒大戟又名“东北狼毒”、“猫眼花根”、“狼毒”，为大戟科植物，主要分布于黑龙江、内蒙古、吉林、辽宁、河北等地，其全株有毒，用药部分主要为根。狼毒大戟为多年生草本，高达40cm，有白色乳液。其昧辛，性平，有毒。入肺、肝、脾，具有逐水祛痰、散结杀虫的功效。最新研究还发现，其具抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等活作用。

徐德昌等研究表明，0.3%狼毒大戟水剂对甘蓝夜盗进行室内杀虫实验，杀虫率达100%，用0.3%狼毒大戟水剂500-650倍防治蔬菜桃蚜，效果为90%-97%，利用大戟狼毒浸提残渣对蛴螬进行室内喂养杀虫实验，杀虫率为100%。王彬等探讨了植物狼毒大戟对钉螺及血吸虫毛蚴的影响，狼毒大戟狼毒大戟根水煮液在浓度为2.5g/L时经过24h，48h，72h浸杀钉螺的死亡率分别为：36.7%，66.7%，93.3%。而以70%乙醇提取液经过相同时间浸杀钉螺的死亡率分别为：43.3%，86.7%，96.7%。同时被狼毒大戟水煮液浸杀的钉螺体内糖原含量明显下降，减少幅度从9.61%到33.60%，表明狼毒大戟通过影响钉螺的能量代谢而抑制其生长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防治水产动物体外寄生虫的中药制剂，性价比高，效果显著，为植物源性药物，能够减少耐药性发生几率，解决化学杀虫药容易引起高耐药性的问题，避免因高耐药性而不断增加药物用量，降低对环境的污染。

本发明的另一目的是在于提供一种防治水产动物体外寄生虫的中药制剂的制备方法，该方法将狼毒大戟杀虫活性成分分离出来，提高疗效，且该方法易行，操作方便，尤其适用于当前水产养殖的集约化、规模化生产的需要。

本发明还有一个目的是在于提供了一种防治水产动物寄生虫的中药制剂的应用。狼毒大戟提取物对鲫鱼和草鱼的安全浓度分别为2.61ppm和2.38ppm，高于最佳有效浓度2倍多，说明该狼毒大戟提取物对鱼类是比较安全的，可以应用于水产养殖生产中指环虫的防治。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种防治水产动物体外寄生虫的中药溶液制剂，由下列组分按比例构成（g/ml）：狼毒大戟乙酸乙酯分步提取物3-10g，乳化剂(OP-10或656-A)5-10g，稳定剂（丙二醇）1-3g，丙酮定容至100ml，所述试剂均为工业纯。

一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，由下列组分按比例构成（最佳配比）：

狼毒大戟乙酸乙酯提取物5g，乳化剂(OP-10或656-A)5g，稳定剂（丙二醇）1g，溶剂（丙酮）定容至100ml。

一种防治水产动物体外寄生虫中药溶液剂的制备方法，其步骤是：

1、称取50g干燥的狼毒大戟（中药饮片）粉碎至20目，用80%乙醇(v/v)进行索氏提取，收集提取液，回收乙醇，得到浓缩原液100ml；

2、浓缩原液用石油醚萃取四次，每次200ml，分离石油醚层，留水相；

3、水相用乙酸乙酯萃取五次，每次300ml，合并萃取液，于旋转蒸发仪上蒸发乙酸乙酯，得到固体残渣；

4、步骤3）中的固体残渣用少量80%乙醇(v/v)洗脱，于水浴锅上挥发溶剂，得到褐色固形物，即狼毒大戟乙酸乙酯提取物；

5、称取3-10g提取物，用60ml丙酮完全溶解后，加5-10g的乳化剂和1-2g的稳定剂，最后用丙酮定容到100ml。

一种狼毒大戟提取物在制备防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂的应用，实验证明：

狼毒大戟提取物在0.25ppm没有杀虫效果，在0.5ppm显示杀虫效果；当浓度达到1ppm时，其杀虫率可达到90%以上；当达到2ppm时，杀虫率达到100%。甲苯咪唑在0.1ppm、0.2ppm、0.4ppm时均未见明显杀虫效果，当浓度为0.8ppm时，显示有一定杀虫效果但杀虫率只有50％左右，且在第5天开始出现草鱼、鲫鱼死亡；甲苯咪唑1.6ppm组，显示有效果，但杀虫率也不高，且随着时间延长实验鱼死亡严重，未到第6d已全部死亡。从狼毒大戟和甲苯咪唑作用时间与效果看，二者在96h时杀虫效果要好于48h时的杀虫效果，说明，延长药物作用时间可提高其杀虫效果，但对于二者作用时间达到96h后，再延长时间，效果提高不明显。

狼毒大戟提取物对鲫鱼和草鱼的安全浓度分别为2.61ppm和2.38ppm，高于最佳有效浓度2倍多，说明该狼毒大戟提取物对鱼类是比较安全的，可以应用于水产养殖生产中指环虫的防治。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

A、首次将狼毒大戟应用于水产动物寄生虫的防治中；

B、采用分步提取法，将狼毒大戟中杀虫有效成分分离出来，使效果更加显著；

C、为植物源性杀虫剂，能够解决化学杀虫药造成高耐药性的问题；

D、避免了化学药物因耐药性不断增加用量的问题，从而减少对水域环境的污染。

具体实施方式：

本发明所述试剂或原料，如未特别说明，市售均可使用。

实施例1：

一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，其组成如下：

狼毒大戟乙酸乙酯提取物5g，乳化剂(OP-10或656-A)5g，稳定剂（丙二醇）1g，丙酮定容至100ml。

其制备方法如下：

1）称取50g狼毒大戟粉碎至20目，用80%乙醇（v/v）进行索氏提取(中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典一部［S］．北京：化学工业出版社，2005．)，收集提取液，回收乙醇，得到浓缩原液约100ml；

2）用石油醚萃取四次，每次200ml，分离石油醚层，留水相；

3）水相用乙酸乙酯萃取五次，每次300ml，合并萃取液，于旋转蒸发仪上回收乙酸乙酯得到固体残渣；

4）步骤3）中的固体残渣用80%v/v乙醇洗脱，于水浴锅上挥发溶剂，得到褐色固形物，即狼毒大戟乙酸乙酯提取物；

6）先将5g的狼毒大戟乙酸乙酯提取物，用60ml丙酮完全溶解；

7）溶解之后加入5g的乳化剂和1g的稳定剂；

8）混匀后用丙酮定容至100ml，混合均匀，最终制得防治水产动物寄生虫中药溶液剂。

实施例2：

一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，其组成如下：

狼毒大戟乙酸乙酯提取物3g，乳化剂(656-A)5g，稳定剂（丙二醇）1g，丙酮定容至100ml。

其制备方法除原料重量不同外，同实施例1。

实施例3：

一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，其组成如下：

狼毒大戟乙酸乙酯提取物10g，乳化剂(OP-10)10g，稳定剂（丙二醇）3g，丙酮定容至100ml。

其制备方法除原料重量不同外，同实施例1。

实施例4：

一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，其组成如下：

狼毒大戟乙酸乙酯提取物6.5g，乳化剂(OP-10)7.5g，稳定剂（丙二醇）2g，丙酮定容至100ml。

其制备方法除原料重量不同外，同实施例1。

实施例5：

狼毒大戟乙酸乙酯提取物对鱼类指环虫的杀灭效果实验

1材料与方法

1.1实验药物

狼毒大戟乙酸乙酯提取物，见实施例1。

1.2实验鱼

实验用草鱼、鲫鱼均购自武汉市水产科学研究所汉南养殖基地，规格均一、健壮，草鱼平均25g左右，鲫鱼平均体重15g左右。按照指环虫模型建立方法（王高学，徐钰，王建华等．29种天然植物提取物对指环虫杀灭作用的研究．淡水渔业，2006，36(3)：3-8．）感染本地中型指环虫，当实验鱼鳃部中型指环虫感染数量平均20～40个/尾时进行药效实验。

1.3浓度设定及杀虫活性测定

使用体积为50cm×40cm×40cm玻璃水族缸，盛人充分曝气自来水，pH6.5～7.2，控制水温（20±1）℃，分别投放感染有中型指环虫的实验鱼40尾。根据狼毒大戟提取物预试结果，从0.25ppm浓度开始按等倍关系设置5个浓度梯度（分别为：0.25ppm、0.5ppm、1ppm、2ppm、4ppm），甲苯咪唑从0.1ppm浓度开始按等倍关系设置5个浓度梯度（0.1ppm、0.2ppm、0.4ppm、0.8ppm、1.6ppm）分别加入并搅拌均匀，然后在48h、96h、144h分别在每个实验组及空白对照组随机抽检10尾实验鱼全鳃制片、镜检，观察样品在各实验浓度及实验时间下对指环虫的杀灭效果，并统计计算杀虫率，以及96h最低有效浓度、最佳有效浓度、最高杀虫率等。实验重复3次，并设对照组。

杀虫率（%）=（对照组的指环虫平均存活数量-实验组的指环虫平均存活数量）／对照组的指环虫平均存活数量×100%

杀虫率在20%～30%的药物浓度表示为最低有效浓度；杀虫率在20%以下药物浓度的表示为无效浓度；达到最高杀虫率且鱼不中毒时为最佳杀虫浓度，药物浓度引起实验鱼侧游无力以及死亡的浓度为药物对鱼的中毒浓度。

1.4杀虫活性评价

在设定杀虫时间点取供试鱼全鳃制片、镜检观察并统计指环虫从鳃部脱落情况，如果没有脱落，观察是否死亡，虫体头腺周围口器在1～2min不发生收缩者，示为死亡，若鳃部无虫或虫已死亡均确定杀虫率为100；如果部分脱落，统计每尾鱼鳃部存活寄生虫数量，计算平均值，并与对照组进行对比，计算杀灭率，以此来评价杀虫效果。

2结果与分析

从表1表2可以看出：狼毒大戟提取物在0.25ppm没有杀虫效果，在0.5ppm显示杀虫效果；当浓度达到1ppm时，其杀虫率可达到90%以上；当达到2ppm时，杀虫率达到100%。甲苯咪唑在0.1ppm、0.2ppm、0.4ppm时均未见明显杀虫效果，当浓度为0.8ppm时，显示有一定杀虫效果但杀虫率只有50％左右，且在第5天开始出现草鱼、鲫鱼死亡；甲苯咪唑1.6ppm组，显示有效果，但杀虫率也不高，且随着时间延长实验鱼死亡严重，未到第6d已全部死亡。从狼毒大戟和甲苯咪唑作用时间与效果看，二者在96h时杀虫效果要好于48h时的杀虫效果，说明，延长药物作用时间可提高其杀虫效果，但对于二者作用时间达到96h后，再延长时间，效果提高不明显。

表1狼毒大戟提取物对草鱼指环虫的杀灭效果实验

表2狼毒大戟提取物对鲫鱼指环虫的杀灭效果实验

3讨论

本研究结果表明，狼毒大戟乙酸乙酯提取物对鱼类中型指环虫具有显著杀灭效果，在0.5ppm就显示杀虫效果，当浓度达到1ppm时其杀虫率可达到90%以上，表明该植物提取物是一种具有较好应用前景的植物源杀虫渔药。对于甲苯咪唑，按照渔药国家标准，10％甲苯咪唑杀灭指环虫使用剂量为每亩67g～100g，即0.1ppm～0.15ppm；而本次实验其对实验鱼所感染中型指环虫作用浓度在0.4ppm以下时均未见效果，只有当浓度为0.8ppm时，才显示有一定杀虫效果，但杀虫率也只有50％左右；且随着浓度提高及药物作用时间延长，对实验鱼的毒性不断增加，并导致实验鱼不断死亡；通过我们长时间毒性观察，10％甲苯咪唑在浓度超过0.5ppm时，实验鱼很难存活至10d；通过本次效果实验可看出甲苯咪唑显效剂量远远高于国家标准，说明目前一些地区及养殖品种所感染的指环虫对甲苯咪唑已产生严重抗药性，如果再从成本及安全角度考虑甲苯咪唑对抗性指环虫基本失去作用，已没有应用价值。因此，目前渔药市场急需开发一些新的高效、长效、毒副作用小的药物，以弥补目前国标产品的抗性问题；加之人们对水产品出口贸易壁垒的重视，植物源类杀虫剂在养殖户心中已经占据很重要的地位。从目前实验结果看，狼毒大戟提取狼毒素作为植物源杀灭指环虫渔药开发应该是一个最佳选择。

实施例6：

狼毒大戟乙酸乙酯提取物对草鱼、鲫鱼急性毒性实验

1材料与方法

1.1实验药物

狼毒大戟乙酸乙酯提取物，见实施例1。

1.2实验鱼

实验用草鱼、鲫鱼均购自购自武汉市水产科学研究所汉南养殖基地，规格均一、健壮，草鱼平均12g左右，鲫鱼平均体重10g左右，在实验室暂养一定时间后进行毒性实验。

1.3实验条件

采用静水实验法，使用体积为50cm×40cm×40cm玻璃水族缸，盛入50L充分曝气自来水，pH6.5～7.2；根据狼毒大戟提取物预试结果，每组加鱼20尾，控制水温（25±1）℃，先加入实验药液混匀后再加实验实验鱼；放鱼后，要求保持水中溶氧在5ppm以上。为保持稳定的药物浓度，每隔24h换水重新加药。

1.4实验浓度的设定

首先进行预试，然后根据预试结果确定正式实验浓度范围；即实验鱼在24h全部中毒死亡的最低药物浓度（20ppm）和96h内不发生死亡的最高浓度（8ppm）之间按等差关系进行内插5个浓度组（分别为12、13、14、15、16ppm）进行正式实验，观察各浓度组实验鱼中毒死亡情况。

在实验期间随时观察并记录实验鱼死亡情况，如发现鱼中毒死亡，应及时捞出，以免影响水质。

1.5鱼死亡判断标准及实验观察要求

当鱼停止呼吸后，用玻璃棒轻击鱼尾部，如果在1min内鱼体不产生任何应激反应，即可判断死亡。

实验期间统计24h、48h、96h内各药物浓度实验鱼死亡情况。实验重复三次，并设空白对照组，当对照组实验鱼死亡率大于5%时，应予以校正，校正公式采用Abbott公式；如果对照组实验鱼死亡率小于5%时，死亡率可不予校正；如果对照组实验鱼死亡率大于20%时，应查找原因，重新进行毒性实验。

Abbott公式：p＝p′-c/1-c

P：校正死亡率，即由药物引起的死亡率

P′：实验组死亡率，即自然因素和药物引起的死亡率

C：对照组死亡率，即自然因素引起的死亡率

1.6死亡率计算及毒力回归方程

根据设定的各统计时间段及各实验浓度组实验鱼死亡率的平均机率值（y）及实验浓度的对数值（x）求出毒力直线回归方程（y＝a+bx），并计算相关系数（r）、中浓度LC₅₀及LC₅₀置信区间；分析比较24h、48h、96h各统计时间段的LC₅₀值。

1.7安全浓度计算

根据Turbell公式计算安全浓度：

安全浓度＝（48h LC₅₀×0.3）/(24h LC₅₀/48h LC₅₀)²

2结果

2.1各实验浓度在不同时间内对实验鱼致毒死亡情况

各实验浓度下，24h、48h、96h内实验鱼鱼死亡情况见表3。

表3狼毒大戟提取物致鱼类中毒死亡结果

2.2各实验观察时间段的毒力回归方程、相关系数、LC₅₀及LC₅₀95％可信限

实验结果见表4，鲫鱼24h的半数致死浓度为17.38mg/L，48h半数致死浓度为13.80mgL，96h半数致死浓度为10.23mgL；草鱼24h的半数致死浓度为18.19mg/L，48h半数致死浓度为13.80mgL，96h半数致死浓度为9.33mg/L。

表4狼毒大戟提取物对鱼类毒性情况

2.3安全浓度计算

根据Turbell公式计算狼毒大戟提取物，

对鲫鱼安全浓度：（13.80×0.3）÷（17.38÷13.80）2＝2.61（mg/L）；

对草鱼安全浓度：（13.80×0.3）÷（18.19÷13.80）2＝2.38（mg/L）。

3讨论

由实施例5可知，狼毒大戟提取物对中型指环虫显效浓度为0.5ppm，最佳有效浓度为1ppm。而本实验得到其对鲫鱼和草鱼的安全浓度分别为2.61ppm和2.38ppm，高于最佳有效浓度2倍多，说明该狼毒大戟提取物对鱼类是比较安全的，可以应用于水产养殖生产中指环虫的防治。

Claims (3)

1.一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，由下列组分按比例构成：狼毒大戟乙酸乙酯提取物  3-10 g，乳化剂 5-10 g，稳定剂 1-3 g，丙酮定容至100 ml；

所述的乳化剂为：OP-10或656-A；

所述的稳定剂为：丙二醇；

所述的一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，其制备过程是：

1）称取50 g干燥的狼毒大戟粉碎至20目，用80%乙醇v/v进行索氏提取，收集提取液，回收乙醇，得到浓缩原液100 ml；

2）用石油醚萃取四次，每次200 ml，分离石油醚层，留水相；

3）水相用乙酸乙酯萃取五次，每次300 ml，合并萃取液，于旋转蒸发仪上回收乙酸乙酯，得到固体残渣；

4）步骤3）中的固体残渣用80%乙醇v/v洗脱，于水浴锅上挥发溶剂，得到褐色固形物，即狼毒大戟乙酸乙酯提取物；

5）称取3-10 g步骤4）中得到的提取物，用60 ml丙酮完全溶解后，加5-10 g的乳化剂和1-2 g的稳定剂，最后用丙酮定容到100 ml。

2.根据权利要求1所述的一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，由下列组分按比例构成：狼毒大戟乙酸乙酯提取物5g，乳化剂5 g，稳定剂1g，丙酮定容至100 ml。

3.权利要求1所述的一种防治水产动物体外寄生虫病的中药制剂，其狼毒大戟乙酸乙酯提取物在制备防治水产动物寄生虫药物中的应用。