CN102977171A - 一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物及在抗病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域,具体涉及一类由4′,5′-双键核苷与含多官能团的1,3-偶极体经1,3-偶极环加成反应合成的结构多样化的五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物,由于该类化合物具有特殊的生理活性及生物功能,因而可以在抗病毒中得到应用。
背景技术
病毒感染引起多种疾病,严重危害人类的健康和生命。据统计,约60%~65%流行性传染病是由病毒感染引起的,如乙/丙型肝炎、艾滋病、手足口病、巨细胞病毒感染和疱疹病毒感染等已严重威胁着人们的健康和生命。
核苷类化合物在抗病毒药物中占有相当重要的地位。在目前已上市的以及应用于临床的抗病毒药物中,核苷类化合物占了相当大的比例。核苷类抗病毒药物的作用机制是阻断病毒核酸的合成。对核苷(酸)的糖环部分或者碱基进行修饰所得到的核苷(酸)类似物能够代替病毒正常的核酸前体或者抑制核酸合成酶,使病毒无法合成核酸,从而终止病毒DNA链的延长,对病毒产生抑制的作用。
核苷的构象是被酶系所识别的关键因素。通过在核苷中引入不同的环状结构,利用空间位阻和电子效应,将核苷“锁定”于某个特定构象或者某些优势构象,合成构象限制核苷。研究已表明,通过构象限制策略合成酶系所需的核苷类似物是发现新的抗病毒药物的有效方法。目前,已有数百个构象限制核苷被合成出来,其中很多显示出了不同的抗病毒活性[C.Zhou,J.Chattopadhyaya,Curr.Opin.Drug.Discov.Devel.2009,12,876]。通常这种特殊结构的核苷对其本身的构象有一定的限定和调节作用,因而在与各种生物酶之间的相互作用具有较高的特异选择性。
4′-螺环核苷是一类新型构象限制核苷,4′-位的螺环可以通过空阻效应及对核苷糖基的C4′-C5′键旋转的控制对核苷糖环构象限制,同时用体积较大螺环占领DNA/RNA结构中核苷4′-位下面的空穴,避免DNA和RNA片段非键合作用的立体叠加和自由基引发的核苷降解,因而4′-螺环核苷在研究构象限制核苷的代谢及与靶酶相互作用中具有十分重要的意义。[(a)Dong,S.;Paquette,L.A.J.Org.Chem.2005,70,1580.(b)Hortung,R.;Paquette,L.A.J.Org.Chem.2005,70,1597-1604.(c)Paquette,L.A.;Dong,S.J.Org.Chem.2005,70,5655.(d)Paquette,L.A.Aust.J.Chem.2004,57,7,and references cited therein;]。同时,4′-位取代的核苷已被证明能够通过其电子效应降低3′-羟基的亲核性和改变呋喃糖环构象使得其3′-羟基不能够与聚合酶的活性位点结合,从而阻止病毒DNA链增长[Smith,D.B.;Kalaynov,G.;Sund,C.;Winqvist,A.;Pinho,P.;Maltseva,T.;Morisson,V.;Rajyaguru,S.;LePogam,S.;Najera,I.;Benkenstock,K.;Zhou,X-X.;Maag,H.;Cammack,N.;Martin,J.A.;Swallow,S.;Gunnar Johansson,N.;Klumpp,K.;Smith,M.J.Med.Chem.2009,52,219.]。本课题组曾运用1,5-自由基转移反应也成功地合成出了结构新颖的4′-螺环修饰核苷(S.F.Dang,J.B.Sun,X.X.Xu,P.Wang and J.C.Wu Chem.Res.Chinese Universitiy,2008,24473.)。此外,Paquette课题组通过先合成含有螺环的糖环,再与不同的碱基偶联的方法,得到了三种类型的4′-螺环核苷:4′-O-4′螺环修饰核苷、4′-C取代O的螺环修饰核苷、4′-S取代O的螺环修饰核苷。但是已报道的4′-螺环核苷的合成方法存在路线长,立体选择性差以及不易多样化等缺点,因而开发一个可以快速高选择性并可以多样化合成4′-螺环核苷的方法对于新型构象限制核苷的进一步发展和应用具有重要意义。
柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是多种人类疾病的致病病原(金奇主编.医学分子病毒学科学出版社,2001.),致病谱广,可引起呼吸道感染、结膜炎、心肌炎、心肌病及神经系统的疾病。(Steven O,Silvia P,Kaija M,et al General Virology,2004,85,1597.)。它是单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科(Picornavi ri dae),肠道病毒属(Enterovirus)。柯萨奇病毒分为A、B两组,A组共24型,B组有6型。柯萨奇病毒A组16型(Cox1A16)和肠道病毒71型(EV71)是引起儿童手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)的主要病原。但通常情况下,Cox1A16感染一般不引起无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、脑干脑炎(brainstem encephalitis)和脊髓灰质炎样麻痹(poliomyelitis2like paralysis)等多种中枢神经系统相关的疾病。由于肠道病毒血清型过多(有近70个型)因此未能制成有效可行的疫苗对其感染进行预防。同时目前也缺乏特效治疗,具有广谱抗病毒作用的核苷类药物利巴韦林以及干扰素可被用于一般性治疗。因此,开发出针对包括柯萨奇病毒的肠道病毒治疗剂对人类特别是对儿童的的健康具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物及其制备方法。本发明所述的五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物,其结构式如下所示:
其中反应可得到*处两种构型的产物,即反应可能生成一对非对映异构体,也可通过反应条件的控制仅得到一个构型的产物。
本发明所述的五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物是以各种类型的4′,5′-双键核苷与多官能团的1,3-偶极体在有机溶剂中经[3+2]环加成反应制备,可用如下反应式表示:
其中4′,5′-双键核苷的结构式为:其中B任意选自天然核苷中的各种碱基,例如:胸腺嘧啶胞嘧啶尿嘧啶腺嘌呤和鸟嘌呤R1和R2可以是相同的基团也可以是不相同的基团,为叔丁基二甲基硅氧基三苯甲氧基苯甲酰氧基苄氧基羟基或是H原子。
多官能团的1,3-偶极体的结构式为:其中a、b、c可以是N、O、CH2、CH等原子,b、c之间可以是双键或单键,a、b之间是单键;取代基R3选自烷基、芳基(包括苯基、取代苯基、萘基或芳杂环基,推荐为苯基或取代苯基,取代苯基为烷基、卤素、酰基、酯基、羧基、氨基、醛基等邻、间、对位的单取代、双取代、三取代或多取代的苯基),酯基、烷氧基、烯基、炔基、醛基、酮基、酰胺基等。
本发明所提到的烷基,烷氧基等,除非另外说明,均推荐为碳数为1~16的基团,优选碳数为1~10的基团,更优选碳数为1~4的基团。本发明所提到的芳杂环基,除非另外说明,均推荐C5~C10的含N、O或S的杂环基,尤其推荐噻吩、呋喃、吡咯、吡啶、喹啉、苯并噻吩等基团。除非另外说明,本发明所酯基均指甲酯基或乙酯基,酮均指苯甲酰基。
本发明所得到的产物在不同情况下可以得到不同的立体选择性:偶极体上取代基(前面所述的R3)的位阻、核苷3′-取代基的位阻及构型都可能影响环合反应的立体和区域选择性。偶极体和核苷3′-取代基是位阻小的取代基(R1为碳原子个数小于2的取代基)时,环合反应生成核苷4′-两种构型的产物,偶极体和核苷3′-取代基是位阻大的取代基(R1为碳原子个数大于5的取代基)时,仅生成一种构型产物。
本发明提供了一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物的制备方法:将1,3-偶极体(氰氧化物、硝酮、甲亚胺叶立德、叠氮化物、偶氮化合物、羰基氧化物等)溶解在有机溶剂中、然后滴加到4′,5′-双键核苷的有机溶液中,再加入有机碱的有机溶液,室温或冰水浴中反应2~12小时;其中4′,5′-双键核苷、1,3-偶极体和碱的摩尔比为1:1.6~6∶1.6~6;反应完成后,柱层析分离得到纯的五元杂环修饰的4′-螺环核苷;柱层析分离所用的洗脱剂为极性溶剂和非极性溶剂的混合溶剂,二者体积比为1~30∶100,推荐溶剂为石油醚和乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇或氯仿和丙酮等的混合溶剂体系。
本发明所述的有机溶剂可以是极性溶剂或非极性溶剂,如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、甲苯、间二甲苯、均三甲苯、三氟甲苯、1,4-二氧六环、四氢吠喃等。反应中所用到的碱可以是三乙胺、DBU、DBACO、二异丙基乙基胺等有机碱。
该方法不仅原料易得,反应条件温和,操作简单,底物适用范围广,产物易多样化,产率也较好(50~98%),同时具有高效率高区域选择性和高立体选择性的优点。所合成的化合物可用于抗病毒治疗,所述病毒是引起手足口病的柯萨奇病毒。因此本发明还涉及4′-螺环核苷系列化合物在抗病毒治疗中的应用。
本发明所述4′-螺环核苷系列化合物在抗病毒治疗中的应用包括,其在抗HIV(Human Immunodeficiency Virus,人类免疫缺陷病毒)、HBV(Hepatitis B Virus,乙型肝炎病毒)、人类肠道病毒(Human Enterovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)和HCV(Hepatitis C Virus,丙型肝炎病毒)等的应用。
附图说明
图1:实施例1中的核磁氢谱;
图2:实施例1中的核磁碳谱;
图3:实施例5中的核磁氢谱;
图4:实施例5中的核磁碳谱;
图5:实施例8中的核磁氢谱;
图6:实施例8中的核磁碳谱;
图7:实施例3中的核磁氢谱;
图8:实施例3中的核磁碳谱;
图9:实施例10中的核磁氢谱;
图10:实施例10中的核磁碳谱;
图11:实施例19中的核磁氢谱;
图12:实施例19中的核磁碳谱;
图13:实施例20中的核磁氢谱;
图14:实施例20中的核磁碳谱;
图15(a):不感染的细胞的荧光图;
图15(b):不感染的细胞明视野图;
图16(a)病毒感染(感染病毒不加药物)细胞荧光图,表示正常细胞的情况,对照图;
图16(b):病毒感染(感染病毒不加药物)细胞明视野图,表示受病毒感染后的细胞情况,对照图;
图17(a):病毒感染细胞加入实施例3化合物荧光图,与图16(a)对照可表示加入实施例3化合物后,其对病毒的抑制情况;
图17(b):病毒感染细胞加入实施例3化合物明视野图,与图16(b)对照表示加入实施例3化合物后,其毒性对细胞的破坏情况;
图18(a):病毒感染细胞加入实施例4化合物荧光图,与图16(a)对照表示加入实施例4化合物后,其对病毒的抑制情况;
图18(b):病毒感染细胞加入实施例4化合物明视野图,与图16(b)对照表示加入实施例4化合物后,其毒性对细胞的破坏情况;
图19(a):病毒感染细胞加入实施例9化合物荧光图,与图16(a)对照表示加入实施例9化合物后,其对病毒的抑制情况;
图19(b):病毒感染细胞加入实施例9化合物明视野图,与图16(b)对照表示加入实施例9化合物后,其毒性对细胞的破坏情况;
荧光图和明视野于同一视野下拍摄,荧光表示病毒复制情况,明视野表示细胞生长和病变状况。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明,但并不限制本发明的内容。
实施例所述的1,3-偶极体的合成方法均按照文献的合成方法制备,其中氰氧化物(Liu K.C.,Shelton,B.R.,Howe,R.K.,J.Org.Chem.,1980,45,3916-3918.)、甲亚胺叶立德(M.Poornachandran and R.Raghunathan Tetrahedron,2006,62,11274-1128)在制备同时原位与4′,5′-双键核苷在上述条件下发生1,3-环加成,硝酮(S.Yavuz,H.Ozkan,N.Colak,Y.Yildirir,Molecules,2011,16,6677-6683)和叠氮(N.De Kimpe,M.Boeykens,J.Org.Chem.1994,59,5189-5191)化物依文献方法制备纯化后与4′,5′-双键核苷在上述条件下发生1,3-环加成。
用30mL水溶解盐羟胺(1.53g,22mmol),加入到250mL的三颈瓶。用50mL乙醇溶解苯甲醛(2.12g,20mmol),加入到上述体系中。室温搅拌下向体系内滴加22mL 1N的NaOH溶液。滴加在半小时内完成,滴加完毕后TLC检测,原料消失。旋转蒸发蒸出乙醇和水,得到淡黄色固体,加入20mL水溶解白色固体,每次用10mL乙酸乙酯萃取水溶液,萃取三次,合并有机相用无水硫酸钠干燥后蒸出溶剂,得到粗产物苯甲醛肟淡黄色固体2.18g。称取上步所得的粗产物苯甲醛肟(1.21g,10mmol),溶解于30mL的DMF中,测量初始温度为28℃,加入NCS(267mg,2mmol)后搅拌,观察温度变化,发现下降到27℃,15分钟后温度上升至29。左右,用乙醇和液氮的冷浴条件将体系温度控制在-45℃至-50℃之间,在此条件下加入NCS(1.068g,8mmol),继续冷浴10min后撤去。待温度上升至室温左右,插入温度计观察温度,最终温度上升至31℃,再继续搅拌温度逐渐下降,说明反应已经完成。将反应混合物倒入100mL冰水中,用乙酸乙酯萃取(30mL×3),合并有机相后用无水硫酸钠干燥,旋蒸出溶剂得粗产物氯代苯甲醛肟为淡黄色油状物1.24g。
将2′-脱氧4′,5′-双键胸腺嘧啶核苷(224mg,1mmol,各类4′,5′-双键核苷可以参考文献Lamberth,C.Org.Prep.Proced.Int.1999,31,379,由核苷经5′-碘代和碱性条件下消除两步反应制备)溶解于30mL干燥的四氢呋喃中,向其中加入10mL干燥的四氢呋喃溶解氯代苯甲醛肟(248mg,1.6mmol)的溶液,搅拌5min后滴加20mLEt3N(162mg,1.6mmol)的干燥四氢呋喃溶液。室温搅拌2h左右,TLC检测原料消失后反应完成。旋蒸出溶剂,粗产物进行柱分离(二氯甲烷∶甲醇=90∶1)。得产物247mg。产率为72%。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.38(s,1H),7.72(dd,J=7.2,2.3,3H),7.54(d,J=1.0,1H),7.51-7.42(m,4H),6.52(t,J=7.3,1H),5.99(s,1H),4.33(s,1H),3.80,3.46(dd,J=100.2,18.8,2H),2.40-2.32(m,2H),1.81(s,3H);13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=168.71,163.36,155.77,140.46,135.73,134.06,133.87,131.85,123.55,115.34,89.76,78.92,45.20,44.93,44.65,44.38,44.37,44.09,43.17,17.64.
高分辨质谱计算值:(C17H17N3O5Na[M+Na]+)m/z 366.1066,实测值:366.1060.
取1.6mmol氯代苯甲醛肟粗产物溶解在20mL二氯甲烷中,在冰浴下滴加到化合物2′,3′-叔丁基二甲基硅基保护-4′,5′-双键尿嘧啶核苷(1.0mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中。滴加完成后继续在冰浴下滴加三乙胺(0.24mL,1.6mmol)的10mL二氯甲烷溶液。反应完成后在水泵上将其溶剂蒸出,柱层析分离。得环合产物。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.83(d,J=8.1Hz,1H,6-H),7.66(dd,J=7.2,2.3Hz,2H,aryl-),7.44(dd,J=5.1,1.8Hz,3H,aryl-),5.81(dd,J=5.2,2.9Hz,2H,5-H,1’-H),4.26(d,J=2.4Hz,1H,3′-H),4.23(d,J=3.6Hz,1H,2′-H),3.79(d,J=18.4Hz,1H,5′-H),3.30(d,J=18.4Hz,1H,5′-H),0.95(s,9H),0.88(s,9H),0.12(t,J=15.8Hz,12H);13C NMR(75MHz,CDCl3)δ163.67,158.71,150.27,139.58,130.81,128.87,126.79,117.27,102.64,89.98,89.87,75.56,73.49,41.48,25.79,25.70,-4.50,-4.69,-4.82,-4.96.
高分辨质谱计算值:(C17H17N3O5Na[M+Na]+)m/z 574.2786,实测值:574.2763.
实施例3:的合成
称取1mmol该环合产物溶解于5ml无水THF使其溶解后加入1NTBAF(四丁基氟化铵,3ml)的四氢呋喃溶液,在室温条件下搅拌3h,待反应完成后,将反映体系倒入10ml的冰水中,此时会有白色固体析出。将白色固体过滤,依次用水,乙醇,甲醇洗涤。得出纯的产物。两步产率:62%,1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=7.70(t,J=8.0Hz,3H,),7.55-7.40(m,3H),6.10(dd,J=9.6,5.8Hz,2H),5.82(d,J=8.3Hz,1H),5.79(d,J=6.2Hz,1H,),4.34(d,J=4.1Hz,1H,),4.08(t,J=4.5Hz,1H),3.81(d,J=18.9Hz,1H),3.45(d,J=18.8Hz,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.00,158.03,150.95,139.91,130.70,128.97,128.57,126.80,117.00,103.04,87.40,73.86,73.79,40.70.
高分辨质谱计算值:C16H16N3O6[M+H]+:346.1039实测值::346.1034
该化合物的合成与实施例1操作相同,将实施例1中的原料苯甲醛换为4-异丙基苯甲醛,该化合物的产率:67%;1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.39(s,1H),7.64(d,J=8.1,2H),7.54(s,1H),7.34(d,J=8.1,2H),6.52(t,J=7.2,1H),5.99(d,J=4.7,1H),4.33(s,1H),3.78,3.43(dd,J=102.6,18.8,2H),2.99-2.84(m,1H),2.36(d,J=6.9,2H),1.81(s,3H),1.21(d,J=6.9,7H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.55,158.05,151.13,151.12,150.60,135.33,126.83,126.32,118.24,110.15,84.56,73.75,40.32,40.05,39.77,39.49,39.36,39.22,38.94,38.67,38.06,33.34,23.58,12.50.
高分辨质谱计算值:(C20H24N3O5[M+H]+)m/z 386.1716,实测值:386.1710.
该化合物的合成与实施例1操作相同,将实施例1中的原料苯甲醛换为4-甲氧基苯甲醛,该化合物的产率:71%;1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.37(s,1H),7.66(d,J=8.7,2H),7.54(s,1H),7.02(d,J=8.7,2H),6.51(t,J=7.3,1H),5.96(d,J=4.6,1H),4.32(s,1H),3.81(s,3H),3.75,3.43(dd,J=98.5,18.7,2H),2.35(d,J=7.7,2H),1.81(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.53,160.96,157.68,150.58,135.33,128.33,121.08,118.14,114.30,110.11,84.52,73.72,55.29,40.05,39.77,39.54,39.50,39.22,38.94,38.08,12.47.
高分辨质谱计算值:(C18H20N3O6[M+H]+)m/z:374.1352,实测值:374.1347.
该化合物的合成与实施例1操作相同,将实施例1中的原料苯甲醛换为2-氯苯甲醛,该化合物的产率:73%;1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.39(s,1H),7.63(dd,J=25.6,7.6,2H),7.53(s,1H),7.51-7.39(m,2H),6.52(t,J=7.2,1H),6.01(d,J=4.7,1H),4.37(s,1H),3.94,3.45(dd,J=146.1,18.9,2H),2.37(d,J=5.0,2H),1.81(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.61,157.45,150.59,135.28,131.66,130.71,130.54,127.75,127.52,118.28,110.27,84.67,73.67,41.57,39.77,39.49,39.21,38.94,38.66,37.89,12.39.
高分辨质谱计算值:(C17H17ClN3O5[M+H]+)m/z:378.0857,实测值:378.0851.
该化合物的合成与实施例1操作相同,将实施例1中的原料苯甲醛换为2-甲氧基苯甲醛,该化合物的产率:69%1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.38(s,1H),7.63(dd,J=7.7,1.6,1H),7.54(s,1H),7.51-7.43(m,1H),7.15(d,J=8.3,1H),7.01(t,J=7.5,1H),6.49(t,J=7.3,1H),5.97(t,J=5.7,1H),4.32(s,1H),3.84,3.38(dd,J=136.1,19.2,2H),2.35(d,J=7.9,2H),1.81(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.57,157.35,157.09,150.61,135.37,132.01,128.72,120.68,117.97,117.49,112.29,110.14,84.54,73.76,55.75,42.03,40.04,39.77,39.49,39.21,38.93,38.12,12.50.
高分辨质谱计算值:(C18H20N3O6[M+H]+)m/z:374.1352,实测值:374.1347.
该化合物的合成与实施例1操作相同,将实施例1中的原料苯甲醛换为4-氟苯甲醛,该化合物的产率:70%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.38(s,1H),7.78(dd,J=8.6,5.6,2H),7.53(s,1H),7.31(t,J=8.7,2H),6.52(t,J=7.4,1H),5.99(d,J=4.7,1H),4.33(s,1H),3.79,3.47(dd,J=94.9,18.9,2H),2.36(d,J=7.3,2H),1.81(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=165.04,163.69,161.75,157.49,150.72,135.42,129.28,129.17,125.40,118.57,116.23,115.94,110.32,84.70,73.83,40.32,40.04,39.76,39.48,39.38,39.21,38.93,38.65,38.06,12.58.
高分辨质谱计算值:(C17H17FN3O5[M+H]+)m/z:362.1159,实测值:362.1147.
该化合物的合成与实施例1相同,将实施例1中的原料2′-脱氧4′,5′-双键胸腺嘧啶核苷换为:2′-脱氧-3′--羟基-4′,5′-双键胸腺嘧啶核苷。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.39(s,1H),7.71(dd,J=6.8,2.7,2H),7.65(s,1H),7.51-7.44(m,3H),6.32(dd,J=8.5,6.5,1H),5.71(d,J=7.2,1H),4.40(dt,J=11.3,7.2,1H),3.55(dd,J=36.4,18.6,2H),2.65-2.55(m,1H),2.08(td,J=11.7,8.7,1H),1.82(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.41,157.53,150.46,135.33,130.40,128.81,128.73,126.53,113.29,110.10,80.70,70.69,39.69,35.63,12.40.
高分辨质谱计算值:(C17H17N3O5Na[M+Na]+)m/z 366.1066,实测值:366.1063.
实施例10:的合成
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为2-氯苯甲醛,该化合物的两步产率:65%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=(s,1H),7.71-7.63(m,2H,),7.59(dd,J=7.9,1.3Hz,1H),7.51(t d,J=7.7,1.8Hz,1H),7.44(td,J=7.5,1.5Hz,1H),6.10(d,J=5.1Hz,2H),5.82(dd,J=12.5,4.1Hz,2H),4.34(dd,J=10.5,6.3Hz,1H),4.18-4.07(m,1H),3.95(d,J=19.0Hz,1H),3.42(d,J=19.0Hz,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.03,157.29,150.97,139.92,131.84,130.94,130.71,127.68,116.98,103.10,87.52,73.70,42.99.
高分辨质谱计算值:C16H15N3O6[M+H]+:345.0961;实测值:346.1034
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为4-甲氧基苯甲醛,该化合物的两步产率:63%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.41(s,1H),7.67(t,J=8.8Hz,3H,6-H),7.01(d,J=8.8Hz,2H),6.10(d,J=6.6Hz,1H),6.07(d,J=4.9Hz,1H),5.85-5.75(m,2H,5),4.32(dd,J=10.5,6.4Hz,1H),4.06(t,J=4.4Hz,1H),3.80(s,3H),3.76(d,J=18.6Hz,1H),3.41(d,J=18.6Hz,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.04,161.08,157.54,150.97,139.97,128.48,120.97,116.81,114.41,103.03,87.39,73.98,73.83,55.39.
高分辨质谱计算值:C17H18N3O7[M+H]+376.1145,实测值:376.1139
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为4-异丙基苯甲醛,该化合物的两步产率:65%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.40(s,1H),7.66(dd,J=16.2,8.2Hz,3H,6-H),7.34(d,J=8.2Hz,2H),6.09(dd,J=9.8,5.7Hz,2H),5.81(dd,J=11.7,7.2Hz,2H),4.41-4.27(m,1H),4.07(t,J=4.5Hz,1H),3.78(d,J=19.0Hz,1H),3.42(d,J=18.8Hz,1H),2.92(dd,J=12.7,5.7Hz,1H),1.21(d,J=6.9Hz,6H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.03,157.91,151.28,150.97,139.95,126.94,126.21,116.90,103.06,87.41,73.94,73.82,33.42,23.67.
高分辨质谱计算值:C19H21N3O6[M+H]+:387.1430;实测值:388.1503
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为糠醛(1-呋喃甲醛),该化合物的两步产率:59%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.41(s,1H,N3-H),7.64(d,J=8.2Hz,1H,6-H),7.14(d,J=3.5Hz,1H),6.72(d,J=3.6Hz,1H),6.09(t,J=5.3Hz,2H),5.81(dd,J=6.4,3.6Hz,2H),4.33(dd,J=10.4,6.2Hz,1H),4.07(t,J=4.4Hz,1H),3.72(d,J=18.7Hz,1H),3.316(d,J=18.7Hz,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.01,150.94,149.13,143.26,139.89,138.10,117.04,116.68,109.48,103.04,87.49,73.71,73.54.
高分辨质谱计算值:C19H21N3O6[M+H]+:336.0824;实测值:336.0826
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为:2-甲氧基苯甲醛,该化合物的两步产率:68%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.41(s,1H),7.68(d,J=8.1Hz,1H),7.61(dd,J=7.7,1.6Hz,1H),7.51-7.43(m,1H),7.15(d,J=8.4Hz,1H),7.00(t,J=7.5Hz,1H),6.10-6.05(m,2H),5.82(dd,J=8.0,1.9Hz,1H),5.78(d,J=6.1Hz,1H),4.32(d,J=4.2Hz,1H),4.10-4.04(m,1H),3.849(d,J=1.9Hz,1H),3.353(d,J=1.9Hz,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.06,162.39,157.42,156.90,150.97,139.98,132.16,128.79,120.75,117.34,116.62,112.36,103.01,87.43,73.92,73.78,55.82,43.42,35.86.
高分辨质谱计算值:C17H18N3O7[M+H]+:376.1145,实测值::376.1139。
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为4-氟苯甲醛,该化合物的两步产率:65%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.42(s,1H),7.78(dd,J=8.6,5.5Hz,2H),7.68(d,J=8.1Hz,1H),7.31(t,J=8.9Hz,2H),6.17-6.05(m,2H),5.82(t,J=6.7Hz,2H),4.34(d,J=4.6Hz,1H),4.08(t,J=4.3Hz,1H),3.80(d,J=18.8Hz,1H),3.46(d,J=18.8Hz,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.03,157.25,150.99,139.94,129.33,125.26,117.16,116.24,115.95,103.08,87.42,73.87.
高分辨质谱计算值:C16H15FN3O6[M+H]+,364.0945,实测值:364.0939。
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为4-二甲氨基苯甲醛,该化合物的两步产率:66%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.40(s,1H),7.67(t,J=8.9Hz,3H),7.01(d,J=8.8Hz,2H),6.10(d,J=6.6Hz,1H),6.06(d,J=5.0Hz,1H),5.82(d,J=8.2Hz,1H,5-H),5.78(d,J=6.1Hz,1H),4.32(d,J=4.2Hz,1H),4.06(t,J=4.4Hz,1H),3.73(d,J=18.8Hz,1H),3.41(d,J=18.8Hz,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.05,159.21,150.97,139.94,138.67,135.59,129.24,128.91,127.38,116.79,114.41,103.01,87.46,73.86,73.69,55.39.
高分辨质谱计算值:C18H21N4O6[M+H]+,389.1461实测值:389.1456
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为:2,6-二氯苯甲醛,该化合物的两步产率:57%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.39(s,1H),7.68(s,1H),7.51(d,J=7.3Hz,1H),6.73(d,J=8.2Hz,1H),6.05(d,J=18.7Hz,2H),5.77(d,J=18.9Hz,2H),4.31(s,1H),4.05(s,1H),3.71(d,J=16.5Hz,1H),3.36(d,J=19.0Hz,1H),2.93(d,J=21.4Hz,6H),2.77(d,J=19.0Hz,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.05,157.70,151.61,150.97,140.04,127.97,116.45,115.40,111.71,102.99,87.39,74.13,73.86,42.91.
高分辨质谱计算值:C16H14Cl2N3O6[M+H]+:414.0260,实测值::414.0254
该化合物的合成与实施例1操作相同,将实施例1中的原料苯甲醛换为肉桂醛,该化合物的产率:72%,1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.39(s,1H),7.63(d,J=7.1,2H),7.53(s,1H),7.44-7.30(m,3H),7.11(s,2H),6.51(t,J=7.2,1H),5.98(d,J=4.8,1H),4.30(s,1H),3.62,3.30(dd,J=96.7,18.5,2H),2.34(dd,J=7.4,3.6,2H),1.80(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.98,158.15,150.84,137.07,130.81,129.20,126.95,119.00,109.81,83.39,71.77,38.25,12.74.
高分辨质谱计算值:C18H18N3O6[M+H]+:372.1196,实测值:372.1190.
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为异丁醛,该化合物的产率:68%,1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.20(s,1H),7.44(d,J=8.1,1H),5.85(d,J=6.6Hz,1H),5.78(d,J=5.1Hz,1H),5.61(d,J=8.1,1H),4.05(q,J=5.7,J=10.5Hz,1H),3.76(t,J=4.5Hz,1H),3.20(d,J=18.6,1H),2.74(d,J=18.6,1H),2.32(s,1H),0.92(d,J=6.6Hz,6H);13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=164.94,162.99,139.84,115.99,102.91,87.23,74.00,73.71,41.12,27.37,19.83,19.65.
高分辨质谱计算值:C13H18N3O6[M+H]+:312.1190,实测值:312.1172
该化合物的合成与实施例1操作相同,将实施例1中的原料苯甲醛换为丙醛,该化合物的产率:76%,1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.36(s,1H),7.50(s,1H),6.44(m,1H),5.85(d,J=4.8Hz,1H),3.38(d,J=18.6,1H),2.91(d,J=18.6,1H),2.19-2.26(m,4H),1.78(s,3H),1.08(t,J=7.5Hz,3H);13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=168.2,167.1,155.7,140.6,122.5,115.2,89.5,78.9,46.5,43.4,25.9,17.6,15.7;
高分辨质谱计算值:C13H18N3O5[M+H]+:296.1234;实测值:296.1241
实施例21:的合成
该化合物的合成与实施例2和实施例3操作相同,将实施例2中的原料苯甲醛换为4-异丙基苯甲醛,该化合物的产率:76%,1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ=11.38(s,1H),7.63(d,J=8.1Hz,1H),6.03(d,J=6.6Hz,1H),5.93(d,J=4.8Hz,1H),5.79(dd,J1=8.1Hz,J2=2.1Hz,1H),5.70(d,J=6.0Hz,1H),13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.0,161.8,150.9,140.0,116.0,102.9,87.3,74.1,73.8,42.7,20.6,10.5;13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ=163.03,161.81,150.92,139.98,115.99,102.90,87.25,74.06,73.76,42.72,20.61,10.53.
高分辨质谱计算值:C12H16N3O6[M+H]+:298.1047;实测值:298.1034
实施例22:体外抗柯萨奇病毒活性实验
实验方法:
1.将人横纹肌肉瘤细胞(购于上海信然生物技术有限公司)接种于24孔板,至细胞90%融合成片。
2.吸去细胞培养液,加入1ml DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium,含2%小牛血清,购于gibco公司)培养基维持液,向上述培养基维持液中加入实施例的产物的溶液,药物终浓度为50uM。
3.加入100半数组织培养感染剂量(TCID50)的柯萨奇病毒A组16型病毒感染细胞(空白组不感染,感染细胞的制备参考文献:Marschall,M.;Freitag,M.;Weiler,S.;Sorg,G.;Stamminger,T.,Antimicrob.Agents and Chemother.,2000,1588-1597;Zhu,Q.C,;Wang,Y.;Liu,Y.P.;Zhang,R.Q.;Li,X.;Su,W.H.;Long,F.;Luo,X.D.Peng,T.,Eur.J.of Pharm.Sci.,2011,44,392-398.),37℃,5%CO2孵箱中放置48小时。
4.荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,拍照记录随机视野下的阳性细胞个数,并计算药物对病毒的抑制率。(每组实验作三复孔)
抑制率=(病毒组阳性细胞数-药物组阳性细胞数)/病毒组阳性细胞数×100%实验结果表明:所合成的化合物对柯萨奇病毒A组16型病毒有抑制作用,其中实施例4的化合物其结构为:能够抑制98.99%的柯萨奇病毒。
表1.实验组的药物抑制率比较
注:细胞对照——不感染的细胞;病毒对照——只感染病毒不加药物的细胞,实施例化合物溶液处理并加病毒感染。实验选取五个随机的视野进行计数取平均值。
Claims (10)
2.如权利要求1所述的一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物,其特征在于:烷基、烷氧基中的碳数为1~16。
3.如权利要求1所述的一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物,其特征在于:芳基为苯基、取代苯基、萘基或芳杂环基。
4.如权利要求3所述的一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物,其特征在于:取代苯基为烷基、卤素、酰基、酯基、羧基、氨基、醛基的邻、间、对位的单取代、双取代、三取代或多取代的苯基。
5.如权利要求3所述的一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物,其特征在于:芳杂环基为C5~C10的含N、O或S的芳杂环基。
6.如权利要求5所述的一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物,其特征在于:芳杂环基为噻吩、呋喃、吡咯、吡啶、喹啉或苯并噻吩。
7.如权利要求1所述的一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物,其特征在于:酯基为甲酯基或乙酯基,酮为苯甲酰基。
9.如权利要求8所述的一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物的制备方法,其特征在于:洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇或氯仿和丙酮的混合溶剂体系;有机碱为三乙胺、DBU、DBACO或二异丙基乙基胺;有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、甲苯、间二甲苯、均三甲苯、三氟甲苯、1,4-二氧六环或四氢吠喃。
10.如权利要求1~7任何一项所述的一种五元杂环修饰的4′-螺环核苷化合物在抗HIV、HBV、人类肠道病毒、柯萨奇病毒或HCV中的应用。
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