CN102973985B - 一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料及其制备方法。通过控制细菌纤维素的培养条件并在培养过程中加入缓释微球制备出一种具有类似人体皮肤“上密下疏”结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。疏松层与致密层结合紧密，无明显物理分层，结构连续性好；疏松层与致密层内存在结构的梯度变化，疏松层中具有均匀分布的多孔，最大程度模仿了人体皮肤上密下疏的渐变梯度结构。有利于细胞进入材料内部，明显缩短伤口愈合周期并有效减少愈合后瘢痕的增生；同时保持了细菌纤维素良好的透气性与持水性，能够使创面维持湿态的环境，更利于创面的愈合。成型过程简单，培养周期短，制备过程绿色环保、简便快速、制备成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种多孔细菌纤维素皮肤修复材料及其制备方法，特别是涉及一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料及其制备方法，具体地说是一种通过调节发酵培养液上方空气气压以及氧气浓度来实现细菌纤维素薄膜的密疏双层结构，并在培养过程中加入缓释微球制得具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
背景技术
皮肤被覆盖于人体全身表面，与外界环境直接接触，是解剖学和生理学上的重要边界器官。皮肤不仅能使人体不受到污染物或细菌的侵袭，也能保持人体水分不流失。由于皮肤对人体的重要保护作用，因此一旦皮肤发生大面积损伤或缺失时，便会对人体造成致命的伤害。皮肤不具备自修复的功能，为了修复、代替缺损的皮肤组织，各国的科学家都在致力于开发具有良好治疗效果的人造皮肤。
从结构上来说人体皮肤由表皮层和真皮层组成。表皮层在皮肤的最外层，表皮细胞彼此联接紧密，主要起到抵抗外界刺激以及防御的功能，因此是皮肤结构中最致密的一层。真皮层主要由胶原纤维和弹性纤维组成，主要起到保持皮肤弹性和张力的作用。由于真皮层中还富含血管、淋巴管以及毛发、皮脂腺、汗腺和肌肉，因此真皮层相较于表皮层结构更为疏松。因此，从表皮层到真皮层，人体的皮肤在结构上是具备一定梯度性的。
早期的人造皮肤主要有网状编织类人造皮肤，聚氨酯人造皮肤以及有机硅膜人造皮肤。这些早期人造皮肤无梯度变化，为均一结构，因此应用于临床治疗时不利于细胞的附着生长，造成新生皮肤生长缓慢从而延长了伤口愈合时间和治疗周期。具有梯度结构的人造皮肤从结构上来看更接近真实的皮肤，因此可以有效诱导缺损组织处细胞的迁移、增殖和分化。利用具有梯度结构的人造皮肤原位诱导缺损皮肤再生，可以大大的缩短伤口愈合周期。此外，还可以增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧性和机械耐磨性以及减少瘢痕增生。因此，在设计人造皮肤材料时，通常应模拟皮肤的表皮和真皮双层结构的特点，设计具有模拟表皮层和真皮层的双层结构人造皮肤。随着组织工程技术的发展，组织工程皮肤已成为皮肤缺损治疗的热点，理想的组织工程皮肤能够模拟天然皮肤的双层结构，具有三维多孔结构能够提供细胞向材料内部粘附、增殖、分化的空间，同时多孔结构也是获得营养和氧气、排出代谢产物的通道以及血管化的场所。
近几年来，关于具有梯度结构的人造皮肤的研究已经取得了不少的成果。CN101716375 公开了一种由纯天然原料制备的具有梯度孔结构和性能的人工皮肤，这种人工皮肤由表皮层和真皮层构成，其中表皮层是由纤维蛋白或丝素蛋白等蛋白与壳聚糖等多糖构成的薄膜结构，真皮层的主要成分是胶原蛋白。CN101716376A公开了一种生长因子缓释型双层人工皮肤，这种人工皮肤的表皮层是具有防水、透气、保护功能的聚氨酯或硅橡胶或聚乙二醇微孔薄膜，真皮层是由丝素蛋白和壳聚糖构成的生物大分子薄膜。CN102526810A公开了一种人工皮肤替代材料及制备方法，这种替代材料具有双层结构，其中基层为聚氨酯材料，在基层表面覆盖一层聚氨酯与聚N-异丙基丙烯酰胺经接枝共聚改性形成的结构层。这种替代物具有与真实皮肤相近的良好力学性能。CN102526808A公开了一种人工皮肤及制备方法，该人工皮肤包括微孔膜状表皮层以及天然高分子仿生真皮层。表皮层的主要成分为聚偏氟乙烯和/或其共聚物聚偏氟乙烯-三氟乙烯，真皮层是胶原膜。CN1785444A公开了一种胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法，该皮肤再生支架由胶原/壳聚糖多孔支架通过生物相容性良好的胶黏剂粘合而成。
目前已经公开的具有双层结构的人工皮肤制备技术主要通过涂膜、胶粘、喷淋成膜、热压成膜等复合方式人为地将人造表皮层与人造真皮层结合。其中涂膜与喷淋成膜是将表皮胶液喷涂到成型的人造真皮层表面，形成表面化学键合后得到人造皮肤；胶粘与热压成膜是指利用粘合剂通过分子间氢键与范德华力将已经成型的表皮层与真皮层结合。现有技术的人造皮肤在表皮层与真皮层结合界面存在结构上的突变，在各层内部不存在结构的梯度变化，只是简单的上密下疏结构。这样的构造不仅使皮肤组织细胞在材料疏密层结合界面处生长缓慢，还会破坏新生皮肤真皮层与表皮层结构的连续性，从而延长了治疗周期并且会使伤口处形成明显的疤痕。此外，胶粘与涂膜的制备工艺会在较大程度上影响表皮层与真皮层之间连通性最终影响人造皮肤材料的透气性能。现有技术中涉及的人造皮肤真皮层材料通常选用生物相容性良好的胶原蛋白，丝束蛋白，表皮层材料通常选用可降解材料（聚乳酸，聚乙二醇）或者惰性材料（硅橡胶，聚偏氟乙烯，聚氨酯），使其制备成本十分高昂，同时表皮层与真皮层由两种不同材料构成也增加了人为复合保证两种材料结合紧密的难度。
细菌纤维素（Bacterial Cellulose，也称微生物纤维素），是世界上公认的性能优异的新型生物材料。细菌纤维素的物理、化学和机械性能具有许多独特的性质：超细网状结构；高抗张强度和弹性模量；具有较高亲水性的同时，兼具良好的透气、吸水、透水性能，并有非凡的持水性和高湿强度。大量研究表明细菌纤维素具有良好的体内、体外生物相容性和良好的生物可降解性，极好的形状维持性能和形状可调控性。因此采用细菌纤维素作为皮肤修复材料具有以往其它生物材料、织物等无可比拟的优点，它是一种较理想的皮肤修复材料。
发明内容
本发明专利通过控制BC的培养条件并在培养过程中加入缓释微球，能够快速简便地制备出一种具有类似人体皮肤“上密下疏”的生物结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。与现有技术中多层状复合相比，本发明是使用细菌纤维素作为皮肤修复材料的基材。细菌纤维素具有良好的生物相容性以及细胞活性，是一种应用广泛的组织工程支架材料。本发明通过控制细菌纤维素培养过程中的培养条件，使β-1,4-葡萄糖链构成的纤维素微纤丝在通过分子内与分子间氢键结合并结晶成型的过程中，自发、有序地形成疏松到致密渐变的结构。结合程度更深，不仅局限于材料表面。与现有技术人为构造表皮层与真皮层相比，本发明制备得到的具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料无明显物理分层，结构连续性十分良好，不存在现有技术人造皮肤产品在两层界面处结构不连续的缺点；其次，疏松层与致密层内也存在结构的梯度变化，使得材料在最大程度上模仿了人体皮肤上密下疏的渐变梯度结构，能够明显缩短伤口愈合周期，并有效减少愈合后瘢痕的增生；此外，均匀的多孔结构能够加快血管化也可以作为组织工程皮肤的支架材料应用于皮肤修复。由于成型过程连续，本发明制备得到的具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料保持了细菌纤维素材料良好的透气性与持水性，能够长时间地使病患的创面维持一个湿态的环境，更有利于创面的愈合。具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的成型过程简单，培养周期短，制备过程绿色环保、简便快速、制备成本低廉，是一种理想的皮肤修复材料。
本发明的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料，是由两层结合紧密的细菌纤维素膜构成，所述的两层结合紧密的细菌纤维素膜为致密层与疏松层；所述的结合紧密是指所述致密层的纤维素微纤丝与所述疏松层的纤维素微纤丝通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键结合，形成分子层，层与层之间也通过分子内与分子间氢键结合，无明显物理分层；组成细菌纤维素的基本单元并非单根β-1,4-葡萄糖链，而是预微纤丝（premicrofibril），其由β-1,4-葡萄糖链组成，每9根β-1,4-葡萄糖链相互平行，通过分子内与分子间氢键结合，呈左手三螺旋状，是组成微纤丝（microfibril）的基本单位，直径为1.5nm。微纤丝（microfibril）直径为3.5nm，微纤与微纤之间通过分子内与分子间氢键结合，β-1,4-葡萄糖链呈平行排布，形成纤维素I型结晶结构。
其中所述致密层中的纤维素含量0.7×10-2～1.0×10-2g/cm3；所述疏松层中的纤维素含量0.2×10-2～0.5×10-2g/cm3，所述疏松层中均匀分布有孔径为50～250μm的微孔，孔隙率在80%以上。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料，所述的细菌纤维素膜是 由菌种在静置培养条件下，消耗糖源，与细胞内合成β-1,4-葡萄糖链并挤出细胞体外。3～4条β-1,4-葡萄糖链通过分子内与分子间氢键作用形成脂多糖层，4～5个脂多糖层通过分子内与分子间氢键形成直径在1.5nm左右的类晶团聚体，3～5个类晶团聚体通过分子内与分子间氢键形成直径在3.5nm左右的纤维素微纤丝，多条微纤丝通过分子内与分子间氢键作用形成纤维素丝束，多条丝束通过分子内与分子间氢键作用形成纤维素丝带。菌种细胞在发酵培养液表面无序运动，即使细胞发生分裂也不会影响纤维素丝带发生断裂。由β-1,4-葡萄糖链通过分子内与分子间氢键形成的纤维素微纤丝相互交织，彼此通过分子内与分子间氢键相互作用，最终在液面形成类似与无纺布结构的细菌纤维素膜。
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料，所述的具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的厚度为8～15mm，其中所述疏松层的厚度为6～13mm。
本发明还提供了一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，包括以下步骤：
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2～5，蛋白胨0.05～0.5，酵母膏0.05～0.5，柠檬酸0.01～0.1，磷酸氢二钠0.02～0.2，磷酸二氢钾0.01～0.1；
发酵培养液的pH为4.0～6.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接入菌液和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×105～2×107个/ml。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28～32℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构。通过在疏松层静置培养过程中添加缓释微球，使纤维素微纤丝之间通过分子内与分子间氢键结合，结晶形成细菌纤维素的过程中，原位包覆缓释微球，微球降解后，形成疏松层内部多孔结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1～2天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2～3天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在10～15%；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.3mm～0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期3～4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.1～1.5个标准大气压范围内，同时提高氧气浓度至50～100%范围内；直至细菌纤维素膜厚度达到1～4mm；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10～15%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10～15%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
需要指出的是：平稳期生长阶段中，先培养疏松层，再培养致密层也能得到相同结构的具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1～10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2～10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
如上所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括：木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，所述的缓释微球为具有皮芯结构，外径为50～250μm；其中，缓释微球内部含有过氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；缓释微球囊壁材料为明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖或胶原。所述的均匀加入是指：将缓释微球均匀分散在经过灭菌处理，调配好的发酵培养液中，速率在1～10mL/min范围内，由细菌纤维素薄膜上方喷淋至细菌纤维素薄膜上表面，液滴直径范围在50～250μm，其中80%的液滴直径小于150μm，喷淋时间在5～10分钟范围内。所述的缓释微球均匀加入至细菌纤维素薄膜上表面后，在24～72小时内持续释放缓释微球内部物质，并在内部物质释放完毕后的48小时内，缓释微球囊壁以溶解或降解的方式消失。
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，所述的高压 蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述发酵培养液置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，所述的通纯氧是指将医用氧以1L/min的速度通入上述的发酵培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4℃下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养液中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养液于28～32℃下摇床培养8～24小时。
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，所述的加压为连续增压或阶段性增压。
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，所述的连续增压是指每分钟向容器内充入压力百分数为1.32×10-2～5.63×10-2%的空气，基数是1个标准大气压，直至容器内空气压力为1.1～1.5个标准大气压时不再增加压力；所述的阶段性增压是指每小时向容器内充入压力百分数为0.797～3.437%的空气，基数同样是1个标准大气压，直至容器内空气压力为1.1～1.5个标准大气压时不再增加压力。
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，所述的提高氧气浓度为连续增加或阶段性增加；所述的连续增加是指：氧气浓度每分钟增加0.05～0.06%，直至氧气浓度达到50%时不再增加；所述的阶段性增加是指：在上述连续增压或阶段性增压过程中，使氧气浓度每小时增加2.92～3.33%，直至氧气浓度达到50%时不再增加。
如上所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，所述的高压灭菌是指将所述后处理后的具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜浸泡在纯净水中置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出冷却至室温；所述的低温封存是指将高压灭菌后的具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料置于4℃下保存。
本发明的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料，所述具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料与细胞生长因子、活性多肽以及抗菌物质通过物理吸附的方式进行复合；分别配置浓度为5～10wt%的细胞生长因子、活性多肽、抗菌物质的溶液，将材料在27～35℃的条件下分别在上述溶液中浸泡5～10天，随后经过清洗、灭菌，即可得到复合了细胞生长因子、活性多肽以及抗菌物质的皮肤修复材料。
细菌纤维素作为一种新型的天然水凝胶具有其独特的物理、化学和机械性质：超细网状结构；高抗张强度和弹性模量；高亲水性，良好的透气、吸水、透水性能，并有非凡的持水性和高湿强度。细菌纤维素的微纤丝束直径为3～4nm，而由微纤维束连接成的纤维丝带宽度为70～80nm，长度为1～9μm,是目前最细的天然纤维。
大量研究表明细菌纤维素具有良好的体内、体外生物相容性。极好的形状维持性能和原 位成型性。可以任意裁剪与皮肤有极好的伏贴性；独特的三维网状结构使得其能够在很长一段时间里保持湿润的状态，湿润的环境易于组织再生、还可以有效地减轻患者的疼痛，特殊的纳米结构促进细胞的相互作用、促进组织再生及减少疤痕组织生成；同时，还有利于材料在伤口处安全、方便地释放负载的药物，进一步促进伤口愈合。
本发明的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料，其纳米三维网状结构为细胞、组织的重建提供了必要的三维空间和力学支持，起到模拟细胞外基质（Extra cellular matrix，ECM）的作用。多孔结构的微孔能够提供细胞向材料内部粘附、增殖、分化的空间，同时多孔结构也是获得营养和氧气、排出代谢产物的通道以及血管化的场所。具有良好的组织相容性；生物可降解性和适合的降解率。
本专利发明的一种具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料能够作为敷料产品根据患者病情的实际情况培养得到与患者伤口皮肤相似上密下疏的生物结构，可以在很大程度上缩短患者伤口愈合的周期，并且明显减少愈合后疤痕的产生。同时，也可以作为组织工程支架材料应用于皮肤修复领域。
有益效果：
与现有技术先比，本发明的有益效果是：
（1）一种具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料成型过程连续，疏松层与致密层之间由纳米微纤丝通过分子内与分子间氢键结合。使β-1,4-葡萄糖链构成的纤维素微纤丝在通过分子内与分子间氢键结合并结晶成型的过程中，自发、有序地形成疏松到致密渐变的结构。结合程度更深，不仅局限于材料表面。
（2）一种具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料无明显物理分层，结构连续性十分良好，不存在现有技术人造皮肤产品在两层界面处结构不连续的缺点；其次，制备过程中加入缓释微球制备出一种具有类似人体皮肤“上密下疏”结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。疏松层与致密层内存在结构的梯度变化，疏松层中具有均匀分布的多孔，最大程度模仿了人体皮肤上密下疏的渐变梯度结构。
（3）一种具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料在现有技术基础上，通过增加培养过程中与细菌纤维素薄膜相接触的空气压力，使得细菌纤维素薄膜内部有氧区面积增加；同时精确控制压力，不使细菌纤维素薄膜下沉。改善了现有技术中只依靠提高氧气分压来构造疏密结构的单一工艺，同时也解决了氧气分压过高所导致纤维素增长速度变缓的缺陷。
（4）一种具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料保持了细菌纤维素材料良好的透气性与持水性，能够长时间地使病患的创面维持一个湿态的环境，更有利于创面的愈合。能 够明显缩短伤口愈合周期，并有效减少愈合后瘢痕的增生。
（5）一种具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料
（6）一种具有疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料成型过程简单，培养周期短，制备过程绿色环保、简便快速、制备成本低廉，是一种理想的皮肤修复材料。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料，是由两层结合紧密的细菌纤维素膜构成，所述的两层结合紧密的细菌纤维素膜为致密层与疏松层；所述的结合紧密是指所述致密层的纤维素微纤丝与所述疏松层的纤维素微纤丝通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键结合，形成分子层，层与层之间也通过分子内与分子间氢键结合，无明显物理分层；组成细菌纤维素的基本单元并非单根β-1,4-葡萄糖链，而是预微纤丝（premicrofibril），其由β-1,4-葡萄糖链组成，每9根β-1,4-葡萄糖链相互平行，通过分子内与分子间氢键结合，呈左手三螺旋状，是组成微纤丝（microfibril）的基本单位，直径为1.5nm。微纤丝（microfibril）直径为3.5nm，微纤与微纤之间通过分子内与分子间氢键结合，β-1,4-葡萄糖链呈平行排布，形成纤维素I型结晶结构。
其中所述致密层中的纤维素含量0.7×10-2～1.0×10-2g/cm3，所述疏松层中的纤维素含量0.2×10-2～0.5×10-2g/cm3。所述疏松层中均匀分布有孔径为50～250μm的微孔，孔隙率在80%以上。
所述的细菌纤维素膜是由菌种消耗糖源，分泌纤维素微纤丝通过分子内与分子间氢键结合形成。
所述的具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的厚度为8～15mm，其中所述疏松层的厚度为6～13mm。
低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例1
1）发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨0.05，酵母膏0.05，柠檬酸0.01，磷酸氢二钠0.02，磷酸二氢钾0.01；
培养液的pH为4.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×105个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构。通过在疏松层静置培养过程中添加缓释微球，使纤维素微纤丝之间通过分子内与分子间氢键结合，结晶形成细菌纤维素的过程中，原位包覆缓释微球，微球降解后，形成疏松层内部多孔结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在10%；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.3～0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期3天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.1个标准大气压范围内，同时提高氧气浓度至50%；直至细菌纤维素膜厚度达到1～4mm；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例2
1）发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1；
培养液的pH为6.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构。通过在疏松层静置培养过程中添加缓释微球，使纤维素微纤丝之间通过分子内与分子间氢键结合，结晶形成细菌纤维素的过程中，原位包覆缓释微球，微球降解后，形成疏松层内部多孔结构；
a.细菌纤维素生长诱导期2天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期3天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在15%；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.3～0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.5个标准大气压范围内，同时提高氧气浓度至100%；直至细菌纤维素膜厚度达到1～4mm；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为15%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为15%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的 氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例3
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3，蛋白胨0.3，酵母膏0.3，柠檬酸0.05，磷酸氢二钠0.1，磷酸二氢钾0.05；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构。通过在疏松层静置培养过程中添加缓释微球，使纤维素微纤丝之间通过分子内与分子间氢键结合，结晶形成细菌纤维素的过程中，原位包覆缓释微球，微球降解后，形成疏松层内部多孔结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在12.5%；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.3～0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.3个标准大气压范围内，同时提高氧气浓度至75%；直至细菌纤维素膜厚度达到1～4mm；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1.3个标准大气压，同时维持氧气浓度为12.5%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压， 同时维持氧气浓度为12.5%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例4
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在10%；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，采用连续增压，每分钟向容器内充入压力百分数1.32×10-2%的空气，基数是一个标准大气压，直至容器内空气压力为1.1个标准大气压时不再增加压力。使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.1个标准大气压，同时采用连续增加氧气浓度的方 式，使氧气浓度每分钟增加0.05%，直至氧气浓度达到50%时不再增加；当细菌纤维素膜厚度达到8mm时，将其取出，即得到具备疏密结构的细菌纤维素薄膜；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例5
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在10%范围内；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，采用连续增压，每分钟向容器内充入压力百分数5.63×10-2%的空气，基数是一个标准大气压，直至容器内空气压力为1.5个标准大气压时不再增加压力。使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.5个标准大气压，同时采用连续增加氧气浓度的方式，使氧气浓度每分钟增加0.06%，直至氧气浓度达到50%时不再增加；当细菌纤维素膜厚度达到8mm时，将其取出，即得到具备疏密结构的细菌纤维素薄膜；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例6
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在10%范围内；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，采用阶段性增压，每小时向容器内充入压力百分数0.797%的空气，基数是一个标准大气压，直至容器内空气压力为1.1个标准大气压时不再增加压力。使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.1个标准大气压，同时采用阶段性增加氧气浓度的方式，使氧气浓度每小时增加2.92%，直至氧气浓度达到50%时不再增加；当细菌纤维素膜厚度达到8mm时，将其取出，即得到具备疏密结构的细菌纤维素薄膜；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例7
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在10%范围内；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，采用阶段性增压，每小时向容器内充入压力百分数3.437%的空气，基数是一个标准大气压，直至容器内空气压力为1.5个标准大气压时不再增加压力。使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.5个标准大气压，同时采用阶段性增加氧气浓度的方式，使氧气浓度每小时增加3.33%，直至氧气浓度达到50%时不再增加；当细菌纤维素膜厚度达到8mm时，将其取出，即得到具备疏密结构的细菌纤维素薄膜；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例8
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在10%范围内；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，采用连续增压，每分钟向容器内充入压力百分数3.00×10-2%的空气，基数是一个标准大气压，直至容器内空气压力为1.3个标准大气压时不再增加压力。使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.3个标准大气压，同时采用连续增加氧气浓度的方式，使氧气浓度每分钟增加0.55%，直至氧气浓度达到50%时不再增加；当细菌纤维素膜厚度达到8mm时，将其取出，即得到具备疏密结构的细菌纤维素薄膜；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例9
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在10%范围内；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，采用阶段性增压，每小时向容器内充入压力百分数1.50%的空气，基数是一个标准大气压，直至容器内空气压力为1.3个标准大气压时不再增加压力。使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.3个标准大气压，同时采用阶段性增加氧气浓度的方式，使氧气浓度每小时增加3.00%，直至氧气浓度达到50%时不再增加；当细菌纤维素膜厚度达到8mm时，将其取出，即得到具备疏密结构的细菌纤维素薄膜；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
实施例10
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1；
发酵培养液的pH为5.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×107个/mL。
3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的上密下疏的双层结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气浓度在10%；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期4天：
平稳生长期分两个阶段：
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
致密层形成阶段，采用连续增压，每分钟向容器内充入压力百分数1.32×10-2%的空气，基数是一个标准大气压，直至容器内空气压力为1.1个标准大气压时不再增加压力。使与细 菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.1个标准大气压，同时采用连续增加氧气浓度的方式，使氧气浓度每分钟增加0.05%，直至氧气浓度达到50%时不再增加；当细菌纤维素膜厚度达到8mm时，将其取出，即得到具备疏密结构的细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料。
Claims (9)
1.一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1）发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2～5，蛋白胨0.05～0.5，酵母膏0.05～0.5，柠檬酸0.01～0.1，磷酸氢二钠0.02～0.2，磷酸二氢钾0.01～0.1，余量为水；
发酵培养液的pH为4.0～6.0；
将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2）菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：菌种细胞数目在2×105～2×107个/ml；3）静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28～32℃静置培养；
通过分步调节发酵培养液上方空气整体气压以及氧气分压来实现细菌纤维素薄膜的疏密双层结构；通过在疏松层静置培养过程中添加缓释微球，使纤维素微纤丝之间通过分子内与分子间氢键结合，结晶形成细菌纤维素的过程中，原位包覆缓释微球，微球降解后，形成疏松层内部多孔结构；
a.细菌纤维素生长诱导期1～2天：控制与发酵培养液液面相接触的空气压力为1个标准大气压，直至细菌将发酵培养液中溶解的氧气消耗殆尽后浮上液面，液面出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；
b.细菌纤维素快速生长期2～3天：控制与细菌纤维素膜上表面空气压力为1个标准大气压，同时保持氧气体积浓度在10～15%范围内；至细菌纤维素薄膜厚度达到0.3～0.5mm；
c.细菌纤维素平稳生长期3～4天：
平稳生长期分两个阶段：
致密层形成阶段，加压使与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力在1.1～1.5个标准大气压范围内，同时提高氧气浓度至50～100%范围内；直至细菌纤维素膜厚度达到1～4mm；
疏松层形成阶段，维持与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10～15%，直至细菌纤维素薄膜厚度增长至2～8mm时，在细菌纤维素薄膜上表面均匀加入缓释微球；维持与细菌纤维素膜上表面接触的空气压力为1个标准大气压，同时维持氧气浓度为10～15%，直至细菌纤维素膜厚度达到8～15mm时将其取出，即得到具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜；
4）后处理；
静置培养结束后，将上述的具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1～10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2～10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料；
所述具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料是由两层结合紧密的细菌纤维素膜构成，所述的两层结合紧密的细菌纤维素膜为致密层与疏松层；所述的结合紧密是指所述致密层的纤维素微纤丝与所述疏松层的纤维素微纤丝通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键结合，形成分子层，层与层之间也通过分子内与分子间氢键结合，无明显物理分层；
其中所述致密层中的纤维素含量0.7×10-2～1.0×10-2g/cm3；所述疏松层中的纤维素含量0.2×10-2～0.5×10-2g/cm3，所述疏松层中均匀分布有孔径为50～250μm的微孔，孔隙率在80%以上。
2.根据权利要求1所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，所述的细菌纤维素膜是由菌种消耗糖源，分泌纤维素微纤丝通过分子内与分子间氢键结合形成；所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括：木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，所述的具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的厚度为8～15mm，其中所述疏松层的厚度为6～13mm。
4.根据权利要求1所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，所述的缓释微球为具有皮芯结构，外径为50～250μm；其中，缓释微球内部含有过氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；缓释微球囊壁材料为明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖或胶原；所述的均匀加入是指：将缓释微球均匀分散在经过灭菌处理，调配好的发酵培养液中，速率在1～10mL/min范围内，由细菌纤维素薄膜上方喷淋至细菌纤维素薄膜上表面，液滴直径范围在50～250μm，其中80%的液滴直径小于150μm，喷淋时间在5～10分钟范围内；所述的缓释微球均匀加入至细菌纤维素薄膜上表面后，在24～72小时内持续释放缓释微球内部物质，并在内部物质释放完毕后的48小时内，缓释微球囊壁以溶解或降解的方式消失。
5.根据权利要求1所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述发酵培养液置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
6.根据权利要求1所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，所述的通纯氧是指将医用氧以1L/min的速度通入上述的发酵培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4℃下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养液中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养液于28～32℃下摇床培养8～24小时。
7.根据权利要求1所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，所述的加压为连续增压或阶段性增压；所述的连续增压是指每分钟向容器内充入压力百分数为1.32×10-2～5.63×10-2%的空气，基数是1个标准大气压，直至容器内空气压力为1.1～1.5个标准大气压时不再增加压力；所述的阶段性增压是指每小时向容器内充入压力百分数为0.797～3.437%的空气，基数是1个标准大气压，直至容器内空气压力为1.1～1.5个标准大气压时不再增加压力。
8.根据权利要求1所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，所述的提高氧气浓度为连续增加或阶段性增加；所述的连续增加是指：氧气浓度每分钟增加0.05～0.06%，直至氧气浓度达到50%时不再增加；所述的阶段性增加是指：在上述连续增压或阶段性增压过程中，使氧气浓度每小时增加2.92～3.33%，直至氧气浓度达到50%时不再增加。
9.根据权利要求1所述的一种具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料的制备方法，其特征在于，所述的高压灭菌是指将所述后处理后的具备疏密结构的多孔细菌纤维素薄膜浸泡在纯净水中置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出冷却至室温；所述的低温封存是指将高压灭菌后的具备疏密结构的多孔细菌纤维素皮肤修复材料置于4℃下保存。
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