CN102965415A - 一种酶催化核苷类药物区域选择性岩藻糖基化修饰的方法 - Google Patents

一种酶催化核苷类药物区域选择性岩藻糖基化修饰的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶催化核苷类药物区域选择性岩藻糖基化修饰的方法，具体步骤如下：（1）将缓冲液、核苷和对硝基苯基β-岩藻糖苷混合均匀；（2）按酶用量为1~30U/克核苷的比例加入β-半乳糖苷酶，在30~55℃、200r/min下，反应5~100h后，在100℃下处理10min，淬灭酶反应；（3）利用柱层析分离得到修饰后的产物。本发明具有反应过程简单、区域选择性高、无需繁琐的保护与脱保护步骤、反应条件温和、环境友好及产物易分离等优点。

Description

一种酶催化核苷类药物区域选择性岩藻糖基化修饰的方法
技术领域
本发明属于应用生物催化领域，具体涉及一种利用β-半乳糖苷酶催化核苷类药物区域选择性岩藻糖基化修饰的方法。
背景技术
核苷类药物是一类重要的抗肿瘤及抗病毒试剂（J Clin Virol,2004,30,115）。例如，5-氟-2’-脱氧尿苷已广泛用于治疗结肠癌及肝转移等肿瘤，阿昔洛韦被用于治疗疱疹病毒感染。然而，核苷类药物通常表现出较低的口服生物利用度，故需要大剂量及经常服用以保持血药浓度高于治疗所需的最低阈值。此外，这类药物选择性较差，在杀死病变细胞的同时，也对正常细胞有较强的毒性，故在临床使用中通常表现出较大的毒副作用（Br J Pharmacol,2006,147,1）。
构效关系研究表明，经糖基化修饰合成的糖苷衍生物能有效屏蔽母药的毒性，当这类衍生物到达病变组织后，借助病变组织胞内β-糖苷酶的水解作用，释放出母药，从而有效提高母药选择性，降低其毒副作用(Bioorg Med ChemLett,2007,17,983;Angew Chem Int Ed,2009,48,6443)。例如，Abraham等发现5-氟尿苷经半乳糖化修饰后，对Balb/c小鼠的毒副作降低了近100倍（CellBiochem Biophys,1994,24,127）。Watanabe等发现5-氟尿苷及5-氟胞苷的5’-葡糖苷酸衍生物也能极大地屏蔽母药是毒性（J Med Chem,1981,24,893）。同时，糖苷衍生物借助与小肠内壁活性葡萄糖、半乳糖载体蛋白的识别，通过主动运输可有效增强药物的小肠吸收，提高其生物利用度（J Pharm Sci,1998,87,326）。并且，糖基化修饰还能有效提高药物的稳定性、水溶性等。例如，Bonina等发现齐多夫定的两种糖苷衍生物在血液中的稳定性远高于母药，显著提高了齐多夫定在血液中的保留时间，从而大大减少了给药次数（Eur J Pharm Sci,2002,16,167）。
此外，核苷的岩藻糖苷衍生物是诸多活性天然产物的重要合成砌块。例如肌苷岩藻糖苷衍生物是制备具有较强的抗革兰氏阳性菌和抗真菌活性的Shimofuridin A的重要合成子；鸟苷岩藻糖苷衍生物是合成具有刺激神经组织活性的HF-7的前提物（Russ Chem Rev,2004,73,401）。
目前，二糖核苷主要通过化学法合成，包括两种途径：a)O-糖基化：由核苷和单糖经O-糖基化反应而得到;b)N-糖基化：由二糖和核苷碱基经N-糖基化反应而得到（Mol Biol,2009,43,301）。由于两底物中均存在多个活性羟基或氨基，化学法的选择性差，故二糖核苷合成需要多步费时耗力的保护及脱保护步骤，工艺复杂。同时，在合成嘌呤类二糖核苷时，需要使用高毒性的汞盐催化剂，环境不友好（Russ Chem Rev,2004,73,401）。
二糖核苷合成的生物催化途径仍非常有限，并且仅有酶促核苷半乳糖基化及葡萄糖基化反应的报道（J Mol Catal B:Enzym,2007,47,28;J Mol Catal B:Enzym,2012,79,35;Bioorg Med Chem,2012,20,3111;J Biotechnol,2011,155,203）。到目前为止，仍未能实现酶催化核苷区域选择性岩藻糖基化反应合成含β-岩藻糖基的二糖核苷。
发明内容
基于来源于牛肝、牛睾丸及猪肝的β-半乳糖苷酶具有的特殊的底物特异性，针对现有技术存在的问题，本发明提供一种利用β-半乳糖苷酶催化核苷类药物区域选择性岩藻糖基化修饰合成核苷岩藻糖苷衍生物的方法。
本发明技术方案如下：
（1）将缓冲液、核苷和对硝基苯基β-岩藻糖苷混合均匀；
（2）按酶用量为1~30U/克核苷的比例加入β-半乳糖苷酶，在30~55℃、200r/min下，反应5~100h后，在100℃下处理10min，淬灭酶反应；
（3）离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率，或除去溶剂后，利用柱层析分离得到修饰后的产物。
优选地，步骤（1）所述核苷与对硝基苯基β-岩藻糖苷摩尔比为5:1~1:4。
优选地，步骤（2）所述β-半乳糖苷酶为来源于牛肝、牛睾丸及猪肝的β-半乳糖苷酶。
优选地，步骤（1）所述缓冲液的pH值为5.0~9.0。
优选地，步骤（1）所述缓冲液为柠檬酸-Na2HPO4缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液。
优选地，步骤（1）所述核苷为2’-脱氧尿苷、5-氟-2’-脱氧尿苷、5-氯-2’-脱氧尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷、碘苷、β-胸苷、5-三氟甲基-2’-脱氧尿苷、5-氟尿苷、齐多夫定、司他夫定、肌苷、鸟苷、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦中的一种。结构式如下：
Figure BDA00002425925800031
R＝H，F，Cl，Br，I，CH3，CF3
Figure BDA00002425925800032
Y＝H，NH2        X＝CH2，O
本发明与现有技术相比具有如下的优点：
1)本发明是在缓冲液中，以对硝基苯基β-岩藻糖苷为糖基供体，利用β-半乳糖苷酶催化核苷类药物进行区域选择性糖基化反应，合成核苷岩藻糖苷衍生物。该酶反应具有高度区域选择性，因此克服了传统化学法选择性低、易生成副产物、需要保护和脱保护操作、产率低及环境不友好等缺点。
2)本发明无需基团保护和脱保护操作，合成工艺简单，产物易分离。
3)本发明是在温度为30~55℃、常压条件下，利用酶法修饰得到岩藻糖苷衍生物，反应条件温和、环境友好。
附图说明
图1为5’-O-β-岩藻糖基-5-氟-2’-脱氧尿苷的NMR氢谱图。
图2为5’-O-β-岩藻糖基-5-氟-2’-脱氧尿苷的NMR碳谱图。
图3为5’-O-β-岩藻糖基-2’-脱氧尿苷的NMR氢谱图。
图4为5’-O-β-岩藻糖基-2’-脱氧尿苷的NMR碳谱图。
图5为5’-O-β-岩藻糖基-5-溴-2’-脱氧尿苷的NMR氢谱图。
图6为5’-O-β-岩藻糖基-5-溴-2’-脱氧尿苷的NMR碳谱图。
图7为5’-O-β-岩藻糖基-碘苷的NMR氢谱图。
图8为5’-O-β-岩藻糖基-碘苷的NMR碳谱图。
图9为5’-O-β-岩藻糖基-阿昔洛韦的NMR氢谱图。
图10为5’-O-β-岩藻糖基-阿昔洛韦的NMR碳谱图。
具体实施方式
通过实施例进一步说明本发明，但不局限于实施例。
实施例1
在15mL带盖三角瓶中加入2mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH 7.0)、0.02mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.04mmol 5-氟-2’-脱氧尿苷，混合均匀，随后加入0.06U牛肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。90h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，离心后利用液相色谱测定产物5’-O-β-岩藻糖基-5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为30%。产物NMR氢谱和碳谱分别如附图1和2所示。
实施例2
在15mL带盖三角瓶中加入2mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH 6.0)、0.02mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.04mmol 5-氟-2’-脱氧尿苷，混合均匀，随后加入0.21U牛肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。24h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，离心后利用液相色谱测定产物5’-O-β-岩藻糖基-5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为41%。
实施例3
在15mL带盖三角瓶中加入2mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH 7.0)、0.02mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.04mmol 5-氟-2’-脱氧尿苷，混合均匀，随后加入0.21U牛肝β-半乳糖苷酶，于50℃及200r/min下反应。17h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，离心后利用液相色谱测定产物5’-O-β-岩藻糖基-5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为40%。
实施例4
在15mL带盖三角瓶中加入2mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH 7.0)、0.02mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.10mmol 5-氟-2’-脱氧尿苷，混合均匀，随后加入0.21U牛肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。27h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，离心后利用液相色谱测定产物5’-O-β-岩藻糖基-5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为53%。
实施例5
在15mL带盖三角瓶中加入2mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH 7.0)、0.02mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.10mmol 5-氟-2’-脱氧尿苷，混合均匀，随后加入0.30U牛睾丸β-半乳糖苷酶，于45℃及200r/min下反应。20h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，离心后利用液相色谱测定产物5’-O-β-岩藻糖基-5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为50%。
实施例6
在15mL带盖三角瓶中加入2mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH 7.0)、0.02mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.06mmol 2’-脱氧尿苷，混合均匀，随后加入0.42U猪肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。24h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，离心后利用液相色谱测定产物5’-O-β-岩藻糖基-2’-脱氧尿苷的浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为43%。产物NMR氢谱和碳谱分别如附图3和4所示。。
实施例7
在15mL带盖三角瓶中加入2mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH 7.0)、0.02mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.06mmol 5-溴-2’-脱氧尿苷，混合均匀，随后加入0.21U牛肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。24h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，离心后利用液相色谱测定产物5’-O-β-岩藻糖基-5-溴-2’-脱氧尿苷的浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为44%。产物NMR氢谱和碳谱分别如附图5和6所示。。
实施例8
在15mL带盖三角瓶中加入2mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH 7.0)、0.02mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.06mmol碘苷，混合均匀，随后加入0.21U牛肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。24h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，离心后利用液相色谱测定产物5’-O-β-岩藻糖基-碘苷的浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为60%。产物NMR氢谱和碳谱分别如附图7和8所示。
实施例9
在15mL带盖三角瓶中加入2mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH 7.0)、0.02mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.06mmol阿昔洛韦，混合均匀，随后加入0.21U牛肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。48h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，离心后利用液相色谱测定产物4’-O-β-岩藻糖基-阿昔洛韦的浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为36%。产物NMR氢谱和碳谱分别如附图9和10所示。
实施例10
在250mL带盖三角瓶中加入40mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH7.0)、0.4mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及0.8mmol 5-氟-2’-脱氧尿苷，混合均匀，随后加入2.1U牛肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。24h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，除去溶剂后，利用柱层析分离得到71mg 5’-O-β-岩藻糖基-5-氟-2’-脱氧尿苷（45%收率）。
实施例11
在250mL带盖三角瓶中加入40mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH7.0)、0.4mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及1.2mmol碘苷，混合均匀，随后加入2.1U牛肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。24h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，除去溶剂后，利用柱层析分离得到118mg 5’-O-β-岩藻糖基-碘苷（59%收率）。
实施例12
在250mL带盖三角瓶中加入40mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mM,pH7.0)、0.4mmol对硝基苯基β-岩藻糖苷及1.2mmol阿昔洛韦，混合均匀，随后加入2.1U牛肝β-半乳糖苷酶，于40℃及200r/min下反应。48h后，将反应液升温至100℃处理10min，淬灭酶反应，除去溶剂后，利用柱层析分离得到49mg 5’-O-β-岩藻糖基-阿昔洛韦（33%收率）。

Claims (6)

1.一种酶催化核苷类药物区域选择性岩藻糖基化修饰的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将缓冲液、核苷和对硝基苯基β-岩藻糖苷混合均匀；
（2）按酶用量为1~30U/克核苷的比例加入β-半乳糖苷酶，在30~55℃、200r/min下，反应5~100h后，在100℃下处理10min，淬灭酶反应；
（3）利用柱层析分离得到修饰后的产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述核苷为2’-脱氧尿苷、5-氟-2’-脱氧尿苷、5-氯-2’-脱氧尿苷、5-溴-2’-脱氧尿苷、碘苷、β-胸苷、5-三氟甲基-2’-脱氧尿苷、5-氟尿苷、齐多夫定、司他夫定、肌苷、鸟苷、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述核苷与对硝基苯基β-岩藻糖苷摩尔比为5:1~1:4。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述缓冲液的pH值为5.0~9.0。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为柠檬酸-Na2HPO4缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述β-半乳糖苷酶为来源于牛肝、牛睾丸及猪肝的β-半乳糖苷酶。
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