CN102965377B

CN102965377B - 一种新德里金属β内酰胺酶1核酸适体及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN102965377B
Application number: CN201210314138.XA
Authority: CN
Inventors: 赵祖国; 喻云梅; 刘仿; 李国明; 张腊喜; 米娜; 晏双双; 许壁榆
Original assignee: Guangdong Medical University
Current assignee: Guangdong Medical University
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2032-08-30
Also published as: CN102965377A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新德里金属β内酰胺酶1核酸适体及其筛选方法和应用，本发明的核酸适体能够高亲和力和高特异性结合NDM-1，可用于NDM-1细菌的检测，并且可以大大缩短检测时间，从而为NDM-1基于核酸适体的临床快速诊断技术打下基础；本发明的核酸适体抗体亲和力与传统的抗体相当，而且生产过程更加简单，成本更低，因此能够替代传统抗体用于金属β内酰胺酶的快速诊断方法。

Description

一种新德里金属β内酰胺酶1核酸适体及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能够与新德里金属β内酰胺酶1高亲和力和高特异性结合的核酸适体及其筛选方法和应用。

背景技术

金属β内酰胺酶（metallo β-lactamases，简称MBLs）具有稳定且高效的碳青霉烯类（丝氨酸酶不能将其水解）的水解活性，可以催化水解除了单环外几乎所有的β-内酰胺类抗生素，而且MBLs不能被临床上的现有的MBLs抑制剂所抑制。目前，MBLs已经在多种临床革兰阴性菌株中分离出，另外，在炭疽杆菌中也发现编码MBLs的沉默基因。

2010年，印度、巴基斯坦等南亚国家出现了一种新型细菌变种基因，拥用这种基因的细菌对包括头孢类、碳青霉烯类、氨基糖苷类等绝大部分抗生素都有耐药性，科学家将这种超级耐药基因命名为新德里金属β内酰胺酶1 (New Delhi metallo-β-lactamase-1，简称NDM-1)基因，NDM-1是NDM-1基因所编码的产物酶。拥有NDM-1基因的超级细菌对几乎所有类型的抗生素都有耐药性，其患者将面临无药可救的境地。这为我们滥用抗生素敲响警钟的同时，也为耐药性及相关新抗研究提出了挑战。

中国大陆已有从鲍曼不动杆菌中检出NDM-1的报道。2010年10月26日，中国疾病预防控制中心通报，检出2 株产NDM-1 的屎肠球菌，该菌株分离自宁夏某县医院的2 例新生儿粪便标本。由于NDM-1多位于质粒、整合子等可移动元件上，易于广泛转移和传播，因此，加强NDM-1细菌的监测非常重要，对临床治疗亦十分有利，临床医师可以直接选择较敏感的化疗药物如单环类抗生素治疗，而且对患者而言，也可节约住院时间和费用。

目前，对于金属β内酰胺酶的检测，临床上普遍采用基于细菌培养的方法进行检测，然而，这种检测方法不仅费时，而且容易出现假阳性或假阴性。为此，中国于2011年颁布《产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌感染诊疗指南（试行版）》，指南中推荐NDM-1细菌的实验室诊断包括表型筛查、表型确认和基因确证三个步骤。其中，表型筛查是以美罗培南或亚胺培南纸片法（K-B法）或最低抑菌浓度（MIC）测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查，达标准者再用双纸片协同试验进行表型确认，最终采用NDM-1基因特异引物进行PCR 扩增及产物测序，确定菌株是否携带NDM-1基因。然而，表型筛查和表型确认均采用传统的药物敏感性测定方法，耗时较长，容易导致病情的延误。

核酸适体是能够特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸片段（单链DNA或单链RNA），它具有高特异性和亲和力识别其靶标分子，一些与疾病密切相关的生长因子、酶、受体等物质均能成为核酸适体的靶标。因此，亟需要研究和发展能够与NDM-1特异性结合的核酸适体，为NDM-1基于核酸适体的临床快速诊断技术打下基础，从而能够快速地检测出NDM-1细菌，使病情得到及时、有效地治疗。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术中的不足之处而提供一种易于制备、节约成本、能够与NDM-1高亲和力和高特异性结合的核酸适体，从而为NDM-1基于核酸适体的临床快速诊断技术打下基础。

本发明的目的之二在于克服现有技术中的不足之处，提供一种易于制备、节约成本的、能够与NDM-1高亲和力和高特异性结合的核酸适体的筛选方法。

本发明的目的之三在于提供一种上述核酸适体在NDM-1的检测中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种上述核酸适体在制备NDM-1的检测试剂中的应用。

本发明的目的由以下技术措施实现：

提供一种新德里金属β内酰胺酶1核酸适体，所述核酸适体为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

本发明还提供一种上述核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：

1) NDM-1的预处理

将NDM-1用包被缓冲液稀释至5μg/ml，向96孔酶标板的8个孔中分别加入120μl NDM-1溶液，4℃包被过夜，然后用150μl 选择缓冲液37℃封闭1h；

2)随机单链DNA文库的预处理

将随机单链DNA文库于95℃变性5mi后立即置于冰中10min，然后用选择缓冲液稀释至1ml，并于25℃ 温育30min；

3) 随机单链DNA文库中单链DNA与NDM-1的结合

将步骤2）预处理后的随机单链DNA文库加入至包被有BSA-CL的酶标板中，37℃条件下在湿盒中静置1h后，弃孔中的液体，然后每孔加入1×选择缓冲液200μl，连续震荡洗涤1min，用于去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链DNA，如此重复5次；最后一次洗涤后，向每孔中加入100μl 单链DNA洗涤缓冲液，80℃加热10min，再用酚：氯仿：异戊醇的比例为25:24:1制成的混合溶剂抽提一次，取上清，加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，最后定容至80μl，获得单链DNA 溶液；

4) 单链DNA的扩增

以步骤3)获得的单链DNA 溶液为模板进行PCR扩增，获得双链DNA；

5) 用于下一轮筛选的单链DNA的制备

将步骤4)获得的双链DNA用纯化试剂盒纯化，然后用链亲和素磁珠从双链DNA中分离单链DNA，投入到下一轮筛选；

6）反向筛选

由于使用了BSA进行包被，为了除去随机单链DNA文库中可能存在的与BSA结合的核酸适体，在每两轮正向筛选之间，进行一次反向筛选：

将经过某一轮筛选后获得的单链DNA加入到用BSA包被和封闭的酶标板孔中，于37℃温育45min，使BSA与核酸适体充分结合，然后，取上清，用于下一轮筛选；

7) 克隆及测序

经过10轮筛选后获得目的寡核苷酸序列，克隆测序所述目的寡核苷酸序列，最终获得核酸适体。

其中，步骤1)中，所述包被缓冲液为pH9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液。

其中，步骤2)和步骤3)中，所述选择缓冲液为pH 7.4的50 mmol/L Tris-HCl含1% BSA , 0.01%鲑鱼精DNA、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl₂、5 mmol/L KCl和0.05% Tween 20配制而成的溶液。

其中，所述步骤b中，所述洗涤缓冲液为pH 7.4的50 mmol/L Tris-HCl含0.05%（V/V）Tween 20配制而成的溶液。

由于上述核酸适体能够特异性结合NDM-1，因此，该核酸适体可用于NDM-1的检测以及用于制备NDM-1的检测试剂，从而可作为NDM-1基于核酸适体的临床快速诊断的用途。

本发明的有益效果：

本发明采用体外筛选技术筛选到一种能够与NDM-1高亲和力和高特异性结合的核酸适体，核酸适体仅需要通过简单的PCR技术即可大量制备，其理化性质稳定，与抗体相比，核酸适体的生产过程更加简单，成本更低，无明显的毒性及过敏源性；另一方面，单克隆抗体的分子量为160KD，而核酸适体的分子量介于4.95KD-29KD之间，在相同质量的情况下，核酸适体捕获的靶分子较抗体多，因此，本发明的核酸适体可用于NDM-1的检测，并且可以大大缩短检测时间，从而为NDM-1基于核酸适体的临床快速诊断技术打下基础。

附图说明

图1为本发明的新德里金属β内酰胺酶1的 SDS-PAGE银染结果图。

图2为本发明的核酸适体对新德里金属β内酰胺酶1亲和力的SPR检测结果图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行进一步描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1核酸适体

核酸适体的核苷酸序列为：

GCAATGGTACGGTACTTCCTGTTTTATGTTGTGTGTCTTGTTTTGCTACTTTTCGCCGGCCGTTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA（SEQ ID NO:1）。

实施例2 核酸适体的筛选方法

一、主要试剂及缓冲液：

（一）主要试剂：

1. 用于核酸适体筛选的NDM-1

本发明选用的NDM-1 纯度大于99%，由意大利Siena大学的Jean-Denis Docquier教授惠赠。

NDM-1的 SDS-PAGE银染结果如图1所示。

图1中：第一泳道为蛋白MARKER，第二至四泳道为NDM-1电泳结果，第二泳道10ng，第三泳道为20ng，第四泳道为40ng蛋白；箭头所指为NDM-1蛋白电泳条带。

电泳结果表明，在蛋白质电泳条带中未看见明显的蛋白跳蛋，表明该酶纯度较高，完全可以用于核酸适体的筛选。

2. 随机单链DNA文库

本发明采用的随机单链DNA文库由Invitrogen广州公司合成，中间45个碱基为随机序列，两端为固定的引物序列，库容量大约为10¹⁵，其序列如下：

5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-(N₄₅)-CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3’；

引物由Invitrogen广州公司合成，用于核酸适体的扩增、扩增结果的检测及从PCR产物中分离单链DNA的分离：

第一引物：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’；

生物素标记的第二引物：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’；

3.其他主要试剂

PCR产物纯化试剂盒（购自德国Qaigen公司）、T-A克隆试剂盒及Taq DNA聚合酶（购自宝生物大连有限公司）、Oligreen 单链DNA染料（购自美国Invitrogen公司）、链亲和素磁珠（购自美国Invitrogen公司）。

（二）主要缓冲液及溶液

1. Tris-HCl缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4；

2. 包被缓冲液：pH9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液；

3. 封闭缓冲液：pH 7.4的50 mmol/L Tris-HCl含1% 牛血清办蛋白（bovine serum album，BSA）和150 mmol/L NaCl；

4. 洗涤缓冲液：pH 7.4的50 mmol/L Tris-HCl含0.05%（V/V）Tween 20；

5. 选择缓冲液：pH 7.4的50 mmol/L Tris-HCl含1% BSA , 0.01%鲑鱼精DNA、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl₂、5 mmol/L KCl和0.05% Tween 20；

6. 5×Tris-硼酸贮存液：分别加入54gTris 碱、27.5g 硼酸以及 20 ml 0.5mol/L EDTA，调pH8.0，终体积为 1L；

7. 40%丙烯酰胺溶液：分别加入 38g 丙烯酰胺和 2g 亚甲双丙烯酰胺，用蒸馏水定溶至100ml；

8. DNA上样缓冲液：尿素 4.8g、0.5M EDTA 0.4ml、1M Tris-HCl（pH 8.5） 0.05ml、溴酚蓝 0.025g、超纯水定容至 10ml，4℃贮存。

二、核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：

1. NDM-1的预处理

2. 随机单链DNA文库的预处理

3. 随机单链DNA文库中单链DNA与NDM-1的结合

将预处理后的随机单链DNA文库加入至包被有BSA-CL的酶标板中，37℃条件下在湿盒中静置1h后，弃孔中的液体，然后每孔加入1×选择缓冲液200μl，连续震荡洗涤1min，用于去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链DNA，如此重复5次；最后一次洗涤后，向每孔中加入100μl 单链DNA洗涤缓冲液，80℃加热10min，再用酚：氯仿：异戊醇的比例为25:24:1制成的混合溶剂抽提一次，取上清，加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，最后定容至80μl，获得单链DNA 溶液；

4. 单链DNA的扩增

取1/8体积的单链DNA 溶液为模板，按照下述方案进行PCR扩增：

94℃ 5min后，进行3个循环：94℃ 1min，37℃ 1min 20sec，58 ℃40sec，然后58℃ 2min；

取 1μl 上述 PCR 产物为模板，再次 PCR扩增，每 5 个循环取样进行凝胶电泳分析：

1）制备聚丙烯酰胺凝胶：将尿素3.78g、40%丙烯酰胺溶液2.7ml、5×Tris-硼酸 0.9ml、超纯水3.2ml、TEMED 90μl及10%过硫酸铵90μl进行混合制备凝胶；

2）将 DNA 样品与DNA上样缓冲液混合，80℃处理5min后，加样，接上电极（正极接下槽），在 100V 恒压下进行电泳；

3）电泳至溴酚蓝迁移至凝胶中下部时，切断电源，取下PAGE胶，进行银染，检测DNA电泳的条带；

根据电泳结果，选择 PCR 产量大、无杂带的循环数为最佳循环数，并按最佳循环次数将剩余 PCR产物扩增成双链DNA。

5. 用于下一轮筛选的单链DNA的制备

将步骤4获得的双链DNA用纯化试剂盒纯化，然后用链亲和素磁珠从双链DNA中分离单链DNA，并按照表1投入到下一轮筛选中：

表1. 核酸适体筛选过程中的NDM-1及单链DNA的用量

筛选轮数	NDM-1量（μg）	投入模板的量（pg）	投入DNA的量（ng）
				1	10μg	46464000	46464
2	10μg	23232000	23232
				3	10μg	11616000	11616
4	10μg	5808000	5808
				5	10μg	2904000	2904
6～8	10μg	1452000	1452
				9～10	10μg	726000	726

6.反向筛选

由于使用了BSA进行包被，因此，为了除去文库中可能存在的与BSA结合的核酸适体，在每两轮正向筛选之间，进行一次反向筛选：将经过某一轮筛选后获得的单链DNA加入到用BSA包被和封闭的酶标板孔中，于37℃温育45min，使BSA与核酸适体充分结合，然后，取上清，用于下一轮筛选；

7.克隆及测序

三、核酸适体与NDM-1的SPR亲和力（解离平衡常数K _d ）检测

采用strepavidin芯片，在Biacore3000上进行表面等离子共振检测，检测温度为25℃。

芯片用30μl的1M NaCl（含50 mM NaOH）洗涤两次，然后在第一通道注射溶于工作缓冲液（50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.4，0.005%（V/V）Tween 20）的10nM生物素化的核酸适体，上样流速为5 μl/ml，第二通道同时注射工作缓冲液，作为对照。

将NDM-1蛋白用工作缓冲液稀释（12.5 to 500 nM）后上样，上样时间为120s，滞留300s，然后洗涤五次；芯片表面用溶于工作缓冲液的30μl的5 M 尿素进行再生，用仪器自带的软件进行K _d和K _a分析。

核酸适体对NDM-1亲和力的SPR检测结果如图2所示。

结果表明，核酸适体与NDM-1的亲和力的解离平衡常数Kd为5nM，由于Ka为K _d的倒数，K _a为2×10⁸L/mol。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>广东医学院

<120>一种新德里金属β内酰胺酶1核酸适体及其筛选方法和应用

<160>1

<210>

<211>88

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

GCAATGGTAC GGTACTTCCT GTTTTATGTT GTGTGTCTTG TTTTGCTACT 50

TTTCGCCGGC CGTTCAAAAG TGCACGCTAC TTTGCTAA 88

Claims

1.一种新德里金属β内酰胺酶1(NDM-1)核酸适体，其特征在于：所述核酸适体为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

2.一种如权利要求1所述的核酸适体的应用，其特征在于：用于NDM-1的检测。

3.一种如权利要求1所述的核酸适体的应用，其特征在于：用于制备NDM-1的检测试剂。