CN102964617A - 用于生物分子固定的薄膜、制作方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于生物分子固定的薄膜、制作方法及应用。所述用于生物分子固定的薄膜，其特征在于在电化学聚合沉积的聚苯胺薄膜中加入含有疏基分子的化学试剂R-SH，将还原单元中的二级胺部分还原成一级胺，将氧化单元中的三级胺叔胺还原成二级胺，使没有活性的氧化单元与醛基反应生成烯胺，从而增加了生物分子的固定效率。本发明提供的薄膜制备分为导电和非导电两大类，以QCM表面利用还原态聚苯胺固定蛋白质分子甲胎蛋白抗体和在不导电玻璃表面利用还原态聚苯胺固定核酸分子作为实例说明其应用。

Description

用于生物分子固定的薄膜、制作方法及应用

技术领域

本发明涉及一种用于生物分子固定的薄膜、制作方法及应用，特别是涉及一种在导电或不导电的传感器表面上能高密度固定含有氨基的核酸分子或蛋白质分子的薄膜，以及这种薄膜的制作方法及应用。

背景技术

业已知道，生物分子与生物传感器表面结合方式有以下四种：物理吸附、包被、静电吸附和共价结合。一般而言，评价合适的生物分子在传感器表面固定方法应满足下面三个标准：(1)该方法是否能让固定到表面的生物分子保持生物活性，(2)在不同pH值、温度、离子强度和化学性质的微环境中，该方法是否能重复、持久和稳定地固定生物分子，(3)该方法是否能让生物分子高效、均一和定向地固定在表面。共价结合能满足以上三个条件，尽管共价结合有可能会在一定程度上削弱生物分子的活性，但是仍然是迄今为止最好的固定方法。

目前，生物传感器表面最常用的共价结合固定方式是自组装技术：利用传感器表面特性（如羧基和氨基活化、金与巯基结合等）与交联试剂所带的活性基团（醛基、氨基、羧基、巯基等）形成的共价键结合，进而可以与生物分子末端的氨基或羧基共价结合，从而使生物分子可以稳定地固定在表面。在这种工艺中，自组装层的活性点数以及分布决定着整个修饰工艺最后的生物分子固定量和分布情况，但是自组装后活性点密度和均一性都难以重复，可能导致修饰后不同表面或同一表面不同区域存在较大差异；此外，选用的交联试剂其分子的另一端一般都有羧基、氨基等活性基团，这些基团在自组装过程中一定程度上也会与传感器表面相互作用，影响自组装效果；而且，自组装技术中形成的膜中可能存在缺陷会导致化学键断裂，成膜分子倒伏或脱落从而影响固定效果。鉴于生物传感器表面生物分子固定主要依靠自组装技术，所以国内外大多数研究者对生物传感器表面修饰的研究也就局限在不断改变含活性基团的化学试剂上。

近几年，在生物传感器表面制备活性薄膜层来实现共价结合表面修饰的研究越来越多，所述的活性薄膜比自组装单层膜厚得多，一般为聚合物层，它可以稳定、均匀地固定在传感器表面，且薄膜表层的活性基团之间具有一定空间位阻，可以顺利地连接后续的交联基团和生物分子。一般，在传感器表面制备薄膜的方式有蒸镀与溅射、离子镀、化学气相淀积、溶胶凝胶法、电化学聚合淀积、LB膜等，其中电化学聚合淀积制膜技术因其对仪器要求不高、操作过程简单、成膜速度快、制膜工艺成熟等优点而倍受研究者青睐。

导电聚合物薄膜在生物传感器中的应用研究已经非常多，其中对聚苯胺膜的研究从未停止，这是因为其本身具有制备容易、单体便宜、稳定性强、成膜均匀致密等特点。早期，聚苯胺膜只是用来修饰和保护电极，Killard研究小组一直致力于利用电化学聚合技术研究聚苯胺膜，据报道，1999年他们就制备出可以利用静电吸附固定蛋白质的聚苯胺/聚乙烯磺酸复合膜（Killard,A.J.,et al.,Development of an electrochemical flow injection immunoassay(FIIA)for the real-time monitoring of biospecific interactions.Analytica Chimica Acta,1999.400:p.109-119；Grennan,K.,et al.,Optimisation and characterisation ofbiosensors based on polyaniline.Talanta,2006.68(5):p.1591-1600），然而基于聚苯胺膜共价结合生物分子的生物传感器研究开展得较少，2006年Sai研究小组（Sai,V.V.R.,et al.,Immobilization of antibodies on polyaniline films and itsapplication in a piezoelectric immunosensor.Analytical Chemistry,2006.78(24):p.8368-8373）第一次利用将聚苯胺膜修饰在具有导电性能的石英晶体微天平的金电极上，通过戊二醛进行蛋白质固定研究，但只是仅仅研究了聚苯胺薄膜的厚度对固定效率的影响，然而对单纯的聚苯胺膜本身的性质没有进一步探索，因为聚苯胺形成过程中还原单元与氧化单元共存，尤其表面的聚苯胺氧化单元不能与醛基反应，就不能用来固定蛋白质，大大影响了聚苯胺薄膜固定生物分子的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于生物分子固定的薄膜、制作方法及应用，本发明克服了现有的生物分子在传感器表面固定存在稳定性和一致性较差、固定效率难以控制等缺陷，并为改善现有导电聚合物表面固定生物分子固定效率差等不足，采用微机电系统工艺、电化学淀积方法以及不可逆的化学反应原理在导电或非导电的传感器表面制成稳定的还原态聚苯胺薄膜，有望可用于稳定、可靠、高密度地固定生物分子。如图1所示，本发明提供了一套制作该薄膜的工艺流程。一般经过电化学聚合淀积方法制成的聚苯胺薄膜包含分两个单元：还原单元和氧化单元，如图2所示。还原单元中的二级胺（仲胺）和苯胺单体中的一级胺（伯胺）都能与交联试剂上醛基或羧基发生反应形成烯胺和亚胺，生物分子中自带或修饰上的氨基或羧基基团会与交联试剂上另一端活性基团反应形成稳定的结构；而氧化单元中的三级胺（叔胺）因为没有活性不能与交联试剂上醛基或羧基反应结合。本发明提出在电化学聚合沉积的聚苯胺薄膜中加入含有巯基分子的化学试剂R-SH，可以将还原单元中的二级胺部分还原成一级胺，将氧化单元中的三级胺（叔胺）还原成二级胺，这样就会使原本没有活性的氧化单元可以与醛基反应生成烯胺，从而增加了生物分子的固定效率，如图3所示。

本发明所要解决的技术问题是：1、传感器表面直接固定生物分子需要复杂的化学反应前处理过程；2、氧化态和还原态杂合的聚苯胺薄膜在导电或非导电表面的制备方法；3、氧化态和还原态杂合的聚苯胺薄膜表面如何处理变成还原态的聚苯胺，该还原态聚苯胺含有大量有活性的一级胺和二级胺。

本发明中薄膜的主体结构——还原态聚苯胺薄膜的制作根据传感器表面的导电性不同，可分两大部分进行（如图4所示）：导电表面在清洁后用电化学聚合沉积方法（循环伏安法、恒电流法、恒电压法等）在表面形成聚苯胺薄膜，根据电解液溶质的不同可以调节该薄膜的氧化态和还原态组分，然后将聚苯胺薄膜浸泡在含有巯基-SH的化学试剂中，薄膜表面氧化态三级胺被完全还原；非导电表面需要在表面预先电镀、或蒸发、或溅射一层薄导电层，然后按照导电表面处理过程可以形成具有还原态聚苯胺薄膜。针对非导电表面，仅以循环伏安电化学聚合沉积法制作还原态聚苯胺薄膜的制作流程为例，具体而言：

(1)利用丙酮和乙醇溶液依次超声清洗传感器表面3-5min，在光学显微镜下观察，确保传感器表面洁净，然后将传感器浸泡在去离子水中待用；

(2)该传感器表面利用热蒸发工艺或溅射工艺制作一层厚度为几百纳米的金属层；

(3)配制浓度为0.5~1.5mol/L的酸溶液（硫酸、盐酸、硝酸等），并在其中溶解浓度为0.05~0.2mol/L的苯胺单体，形成用于聚合苯胺的电解质溶液，并通氮气除氧；

(4)分别以该传感器表面为工作电极、以甘汞电极为参比电极、以铂电极为对电极，在上述配制的电解质溶液中利用电化学工作站以循环伏安电化学方法在传感器表面聚合聚苯胺，形成一层很薄的深绿色聚苯胺膜；

(5)将聚苯胺薄膜浸泡于含有巯基-SH分子的化学试剂溶液中，约20min后取出，聚苯胺薄膜表面呈浅绿色；

这种还原态聚苯胺薄膜利用戊二醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）等交联试剂处理后可以连接不同活性基团修饰的生物分子。如用戊二醛作为交联试剂，固定氨基修饰的生物分子的步骤为：聚苯胺膜初步处理后，立即将浅绿色聚苯胺薄膜浸泡于浓度为2%~5%的交联剂中，过约1h后取出；在聚苯胺薄膜表面滴加含有氨基的生物分子溶液，过一段时间用清洗液清洗，氮气吹干，生物分子固定在聚苯胺薄膜表面；如用EDC和NHS作为交联试剂，固定氨基修饰的生物分子的步骤为：先将氨基修饰的生物分子与浓度为0.1~0.5mM的EDC和浓度为0.1~1.0mM的Sulfo-NHS反应（EDC:NHS=2:5）混合反应约1h，然后将反应好的混合溶液浸泡或滴在聚苯胺薄膜，约30min后生物分子就被固定在薄膜表面。

综上所述：传感器表面通过电化学聚合方法制备还原态和氧化态杂合的聚苯胺薄膜后，将聚苯胺薄膜浸泡在含巯基（-SH）的化学试剂中，巯基与聚苯胺中的二级、三级胺反应，从而得到完全还原态的聚苯胺薄膜，含有丰富的活性一级胺和二级胺，能够利用戊二醛等交联剂将含有氨基的蛋白分子或核酸分子进行固定。由此可见，本发明提供的还原态聚苯胺薄膜及制作方法具有以下几个特点：

(1)本发明通过电化学聚合淀积方法制成的聚苯胺薄膜与传感器表面接触紧密，含有的活性胺基团比传感器表面直接用化学反应产生的活性基团要多且稳定，避免了传统单分子组装共价化学修饰方法带来的不确定性和不稳定性。

(2)本发明中分别在导电表面和非导电表面制成的还原态聚苯胺薄膜，其作为传感器表面修饰材料可以广泛应用。

(3)本发明中采用微机电系统工艺、电化学聚合淀积工艺和巯基还原化学原理相结合方法制作还原态聚苯胺薄膜，方法可靠、简单。

附图说明

图1：用于固定生物分子的薄膜及其传感器结构示意图；

(1)导电表面的聚苯胺薄膜、交联试剂及生物分子的侧视示意图；

(2)非导电表面的聚苯胺薄膜、交联试剂及生物分子的侧视示意图；

图2：各种状态的聚苯胺示意图；

(1)氧化态和还原态杂合的聚苯胺；

(2)还原态聚苯胺；

(3)氧化态聚苯胺；

图3：聚苯胺在含有巯基的溶液中的反应示意图；

图4：生物分子在含有还原态聚苯胺表面固定流程示意图；

(1)导电表面利用还原态聚苯胺固定生物分子流程示意图；

(a)、(b)、(c)、(d)和(e)为工艺步骤，具体为：

(a)—清洗表面          (b)—淀积聚苯胺

(c)—还原聚苯胺        (d)—加交联试剂

(e)-生物分子与还原态聚苯胺反应并固定

(2)非导电表面利用还原态聚苯胺固定生物分子流程示意图；

(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)为工艺步骤，具体为：

(a)-清洗表面              (b)-生长金属层

(c)-淀积聚苯胺            (d)-还原聚苯胺

(e)-加交联试剂            (f)-生物分子与还原态聚苯胺反应并固定

图5：实施例1在石英晶体微天平表面固定蛋白质分子（甲胎蛋白抗体）的示意图；

(a)、(b)、(c)和(d)为工艺步骤，具体为：

(a)-清洗石英晶体微天平    (b)-金电极表面生长还原态聚苯胺

(c)-连接戊二醛            (d)-甲胎蛋白抗体与戊二醛连接并固定

图6：实施例2在玻璃表面固定核酸分子的示意图；

(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)为工艺步骤，具体为：

(a)—清洗玻璃                      (b)—生长或淀积铬/金导电层

(c)—淀积聚苯胺                    (d)—还原聚苯胺

(e)—交联试剂与核酸分子上羧基反应  (f)—聚苯胺表面活性胺固定核酸分子；

图中：

1—生物分子（包括核酸分子、蛋白质分子等）

2—交联试剂（包括戊二醛等）    3—还原态聚苯胺薄膜

4—导电的传感器表面            5—导电层（包括导电聚合物、金属等）

6—非导电的传感器表面          7—氧化态和还原态杂合的聚苯胺薄膜

8—石英晶体微天平              9—石英晶体微天平表面导电层

10—玻璃                       11—核酸分子。

具体实施方式

通过下面的具体实施方式以进一步阐明本发明所提供的用于生物分子固定的薄膜及制作方法包括三部分：

1、还原态聚苯胺薄膜的设计；

2、还原态聚苯胺薄膜的制作；

3、生物分子的固定。

实施例1在石英晶体微天平（QCM）表面利用还原态聚苯胺薄膜固定蛋白质分子（甲胎蛋白抗体）

设计还原态聚苯胺薄膜时考虑以下多个参数：传感器结构、导电层结构与面积、薄膜厚度、聚苯胺薄膜氢离子掺杂浓度、电化学聚合淀积时间、含巯基分子的试剂选择、氧化态聚苯胺表面处理时间、交联试剂选择与处理时间等等。例如，所选传感器表面的导电与否决定了是否需要在传感器表面预先沉积一层几百纳米的金属层，而导电层的结构以及厚度则需要根据实际需求，可以是Ti/Au或Ti/Pt等；在电化学法合成聚苯胺时氢离子浓度、电化学沉积时间都对生成的聚苯胺的结构与形态有重要影响；而对于含巯基分子试剂的选取既要保证巯基的作用也要避免其他基团的干扰，采用含巯基试剂的处理浓度与处理时间则决定了聚苯胺的还原效果；而最后交联试剂的选择与处理时间则需要和目标生物分子相对应以达到最佳固定效果。本实施例以石英晶体微天平为传感器，其金电极表面可以直接进行电化学镀膜，不需要进行预先镀金属；同时，对于QCM而言，其具有晶体振荡频率变化Δf正比于工作电极上沉积物的质量改变△M的特性，根据这一特性能有效检测出QCM电极上沉积物的质量。含巯基R-SH的化学分子选用半胱胺（又名巯基乙胺，NH₂-CH₂-CH₂-SH），其两端含有两个活性基团——氨基和巯基，在聚苯胺电化学聚合后加入一定比例的半胱胺，其巯基可以用于还原聚苯胺的将要形成的氧化单元，而且其氨基可以裸露在还原态聚苯胺表面，促使生成的复合膜中一级胺和二级胺数量大量增加，大大增加生物分子的固定密度和固定效率。交联试剂选用戊二醛，两个醛基能分别与基底活性胺和生物分子氨基结合。本实施例选用甲胎蛋白抗体（一种蛋白质分子，蛋白质分子都含有氨基基团）作为需要固定的生物分子。具体制作工艺主要分为以下四个部分，包括下列步骤：

1、QCM芯片的清洗与预处理：

(4)依次采用丙酮、乙醇以及去离子水对QCM芯片的金（Au）膜电极进行超声清洗，清洗结束后用氮气吹干待用；

(5)将PDMS涂覆在QCM芯片的引线上，在80℃下烘烤2h使聚二甲基硅氧烷（PDMS）固化，PDMS对芯片引线起到绝缘保护作用；

(6)测量预处理后的QCM芯片的基频f₀，作为频率变化的参考值。

2、还原态聚苯胺薄膜的制备：

(5)配置浓度为1.0mol/L的硫酸溶液，并在其中添加苯胺单体，苯胺单体最终浓度为0.1mol/L，充分混合后得到聚苯胺制备所需电解液，对配置好的电解液通氮气30min除氧；

(6)实验采用三电极体系，以QCM芯片的Au膜为工作电极（WE），饱和甘汞电极为参比电极（RE），铂丝电极（Pt）为对电极（CE）。采用循环伏安法（CV法）制备聚苯胺膜，其中扫描电压范围为-0.2~0.9V，扫描速度为20mV/s，扫描周期数为5；

(7)镀膜结束后用去离子水快速冲洗聚苯胺膜表面除去膜上附带的杂质离子。

(8)将完成镀膜并清洗过的QCM芯片迅速浸泡到浓度为0.01mol/L的半胱胺溶液中，20min后取出，并用去离子水快速冲洗；

3、还原态聚苯胺膜表面的修饰处理：

(3)将半胱胺处理后的芯片浸泡到浓度为2%的戊二醛溶液（pH=7.4）中，30min后取出，并用磷酸盐缓冲液（Na₂HPO₄和NaH₂PO₄配置，pH=7.4）快速冲洗；

(4)测量聚苯胺膜改性修饰后QCM芯片的基频f₀′，根据QCM谐振频率变化量与电极表面沉积物质量变化的正比关系通过比较f₀与f₀′可得到聚苯胺的沉积情况并进行优化。

4、甲胎蛋白抗体的固定：

(5)配置浓度为0.5mg/mL的甲胎蛋白抗体溶液，在保湿盒中将修饰后的聚苯胺膜浸泡在甲胎蛋白抗体溶液中孵化1h进行蛋白固定；

(6)孵化结束后，用PBS溶液冲洗聚苯胺膜表面除去非共价连接固定的蛋白；

(7)测量固定蛋白后的QCM芯片的基频f₀″；

(8)同样根据QCM的频率变化量正比于电极表面沉积量的特性，通过比较f₀″和f₀′的值可以得出固定在QCM表面金电极上的甲胎蛋白抗体的量。

实施例2在玻璃表面利用还原态聚苯胺薄膜固定核酸分子

一般制作微阵列芯片需要将玻璃表面羟基化、醛基化，然后将氨基修饰的核酸分子固定。本实施例利用还原态聚苯胺在玻璃表面固定核酸分子，考虑到玻璃表面不导电，需要在玻璃表面生长或淀积铬（约50nm）/金（约20nm）导电层；然后按照实施例一步骤1中(1)和步骤2中(1)、(2)、(3)在玻璃表面制得聚苯胺薄膜；选用β-巯基乙醇作为R-SH化学试剂用于还原聚苯胺中氧化单元，将完成镀膜并清洗过的玻璃迅速浸泡到浓度为0.1mol/L的β-巯基乙醇溶液中，20min后取出，并用去离子水快速冲洗；末端带有羧基的核酸分子与浓度为0.2mM的EDC和浓度为0.5mM的Sulfo-NHS反应，反应1h后将混合溶液滴在已处理的聚苯胺薄膜玻璃上，反应30min后用磷酸盐缓冲液（Na₂HPO₄和NaH₂PO₄配置，pH=7.4）快速冲洗，这样带有羧基的核酸分子就固定在玻璃表面，如图6所示。

Claims (8)

1.用于生物分子固定的薄膜，其特征在于在电化学聚合沉积的聚苯胺薄膜中加入含有疏基分子的化学试剂R-SH，将还原单元中的二级胺部分还原成一级胺，将氧化单元中的三级胺叔胺还原成二级胺，使没有活性的氧化单元与醛基反应生成烯胺，从而增加了生物分子的固定效率。

2.按权利要求1所述的薄膜，其特征在于所述的还原态聚苯胺薄膜利用戊二醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺Sulfo-NHS交联试剂处理后可连接不同活性基团修饰的生物分子。

3.按权利要求2所述的薄膜，其特征在于：

a)用戊二醛作为交联试剂，固定氨基修饰的生物分子的步骤为：聚苯胺膜初步处理后，立即将浅绿色聚苯胺薄膜浸泡于浓度为2%~5%的交联剂中，1h后取出；在聚苯胺薄膜表面滴加含有氨基的生物分子溶液，过一段时间用清洗液清洗，氮气吹干，使生物分子固定在聚苯胺薄膜表面；

b)用EDC和NHS作为交联试剂，固定氨基修饰的生物分子的步骤为：先将氨基修饰的生物分子与浓度为0.1~0.5mM的EDC和浓度为0.1~1.0mM的Sulfo-NHS反应（EDC:NHS=2:5）混合反应1h，然后将反应好的混合溶液浸泡或滴在聚苯胺薄膜，30min后生物分子就被固定在薄膜表面。

4.按权利要求1所述的薄膜的制备方法，其特征在于根据传感器表面的导电性不同，分两大部分进行：①导电表面在清洁后用循环伏安法、恒电流法或恒电压法电化学聚合沉积方法在表面形成聚苯胺薄膜，根据电解液溶质的不同调节该薄膜的氧化态和还原态组分，然后将聚苯胺薄膜浸泡在含有巯基-SH的化学试剂中，薄膜表面氧化态三级胺被完全还原；②非导电表面需要在表面预先电镀、蒸发或溅射一层薄导电层，然后按照导电表面处理过程可以形成具有还原态聚苯胺薄膜。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于对于非导电表面和以循环伏安电化学聚合沉积法制作还原态聚苯胺薄膜的制作流程为：

（1）利用丙酮和乙醇溶液依次超声清洗传感器表面3-5min，在光学显微镜下观察，确保传感器表面洁净，然后将传感器浸泡在去离子水中待用；

（2）在传感器表面利用热蒸发工艺或溅射工艺制作一层厚度为几百纳米的金属层；

（3）配制浓度为0.5~1.5mol/L的酸溶液，并在其中溶解浓度为0.05~0.2mol/L的苯胺单体，形成用于聚合苯胺的电解质溶液，并通氮气除氧；

（4）分别以所述的传感器表面为工作电极、以甘汞电极为参比电极、以铂电极为对电极，在上述配制的电解质溶液中利用电化学工作站以循环伏安电化学方法在传感器表面聚合聚苯胺，形成一层很薄的深绿色聚苯胺膜；

（5）将聚苯胺薄膜浸泡于含有巯基-SH分子的化学试剂溶液中，20min后取出，生成的聚苯胺薄膜表面呈浅绿色。

6.按权利要求5所述的方法，其特征在于：

a)步骤（3）所述的酸溶液为硫酸、盐酸或硝酸溶液；

b)步骤（2）所述的金属层为Ti/Au或Ti/Pt。

7.按权利要求1所述的薄膜的应用，其特征在于在石英晶体微天平表面利用还原态聚苯胺固定量的质分子甲胎蛋白抗体，具体分为4方面：

A、石英晶体微天平QCM芯片的清洗与预处理：

(1)依次采用丙酮、乙醇以及去离子水对QCM芯片的金Au膜电极进行超声清洗，清洗结束后用氮气吹干待用；

(2)将PDMS涂覆在QCM芯片的引线上，在80℃下烘烤2h使聚二甲基硅氧烷PDMS固化，PDMS对芯片引线起到绝缘保护作用；

(3)测量预处理后的QCM芯片的基频f₀，作为频率变化的参考值；

B、还原态聚苯胺薄膜的制备：

(1)配置浓度为1.0mol/L的硫酸溶液，并在其中添加苯胺单体，苯胺单体最终浓度为0.1mol/L，充分混合后得到聚苯胺制备所需电解液，对配置好的电解液通氮气30min除氧；

(2)采用三电极体系，以QCM芯片的Au膜为工作电极WE，饱和甘汞电极为参比电极RE，铂丝电极Pt为对电极CE；采用循环伏安法制备聚苯胺膜，其中扫描电压范围为-0.2~0.9V，扫描速度为20mV/s，扫描周期数为5；

(3)镀膜结束后用去离子水快速冲洗聚苯胺膜表面除去膜上附带的杂质离子；

(4)将完成镀膜并清洗过的QCM芯片迅速浸泡到浓度为0.01mol/L的半胱胺溶液中，20min后取出，并用去离子水快速冲洗；

C、还原态聚苯胺膜表面的修饰处理：

(1)将半胱胺处理后的芯片浸泡到浓度为2%pH=7.4的戊二醛溶液中，30min后取出，并用磷酸盐缓冲液快速冲洗；pH=7.4的磷酸盐缓冲液由Na₂HPO₄和NaH₂PO₄配置；

(2)测量聚苯胺膜改性修饰后QCM芯片的基频f₀′，根据QCM谐振频率变化量与电极表面沉积物质量变化的正比关系通过比较f₀与f₀″可得到聚苯胺的沉积情况并进行优化；

D、甲胎蛋白抗体的固定：

(1)配置浓度为0.5mg/mL的甲胎蛋白抗体溶液，在保湿盒中将修饰后的聚苯胺膜浸泡在甲胎蛋白抗体溶液中孵化1h进行蛋白固定；

(2)孵化结束后，用PBS溶液冲洗聚苯胺膜表面，以除去非共价连接固定的蛋白；

(3)测量固定蛋白后的QCM芯片的基频f₀″；

(4)同样根据QCM的频率变化量正比于电极表面沉积量的特性，通过比较f₀″和f₀′的值可以得出固定在QCM表面金电极上的甲胎蛋白抗体的量。

8.按权利要求1所述的薄膜的应用，其特征在于在玻璃表面利用还原态聚苯胺薄膜固定核酸分子；利用还原态聚苯胺在玻璃表面固定核酸分子，玻璃表面不导电，需要在玻璃表面生长或淀积铬/金导电层；然后按照权利要求7中步骤A中(1)和步骤B中(1)、(2)、(3)在玻璃表面制得聚苯胺薄膜；选用β-巯基乙醇作为R-SH化学试剂用于还原聚苯胺中氧化单元，将完成镀膜并清洗过的玻璃迅速浸泡到浓度为0.1mol/L的β-巯基乙醇溶液中，20min后取出，并用去离子水快速冲洗；末端带有羧基的核酸分子与浓度为0.2mM的EDC和浓度为0.5mM的Sulfo-NHS反应，反应1h后将混合溶液滴在已处理的聚苯胺薄膜玻璃上，反应30min后用磷酸盐缓冲液快速冲洗，使带有羧基的核酸分子固定在玻璃表面。

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