CN102964422A - 一种利用牛毛制备抗氧化肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用牛毛制备抗氧化肽的方法。其特点是将50份牛毛用水洗净，沥水/除杂，在温度35~65°C干燥4~8h，用浓度1~5wt%的碱性溶液500~1000份浸泡0.5~2h，经水洗至中性，用浓度0.05~0.5M的无机酸溶液500~1000份浸泡2~8h，再经水洗至中性，沥去水分，晾干，放入浓度0.5~3wt%的碱性溶液500~1000份中，在搅拌下，于温度40~80°C水解反应10~48h，得到牛毛蛋白水解液，在5000~10000rpm条件下离心10~30min，取上清液，用截留分子量≤10000Da 的透析袋在纯水中透析12~48h，得到牛毛多肽溶液，在温度35~45°C、真空度0.05~0.1MPa条件下低温浓缩，浓缩液在温度-65~-45°C、3~10Pa条件下冷冻干燥12~48h，得到牛毛抗氧化肽。

Description

一种利用牛毛制备抗氧化肽的方法

技术领域

本发明涉及一种利用牛毛制备抗氧化肽的方法，属于生物材料的制备领域。

背景技术

自由基是指含有未配对电子的原子、原子团、离子或分子，具有高度的氧化活性，易与蛋白质、脂类、脱氧核糖核酸（DNA）等生物大分子反应，导致机体的分子、细胞及组织器官的各种损伤，加速机体衰老并诱发各种慢性疾病。同时，自由基可引发食品的链式氧化，严重影响食品的品质及安全。科学研究表明，通过抗氧化物质清除自由基，是延缓衰老、预防疾病、抑制食品氧化的有效手段。目前，广泛使用的抗氧化剂主要是丁基羟基茴香醚（BHA）和2,6-二叔丁基对甲苯酚（BHT）等化学合成的物质。鉴于这些合成抗氧化剂对人体健康的潜在危害，在食品及医药领域的使用受到越来越多的限制。因此，寻找高效、安全的天然抗氧化剂已成为相关科研人员的研究热点。

抗氧化肽是一类具有优良乳化特性，能有效清除自由基，抑制脂质过氧化发生的肽类物质。抗氧化活性主要依靠组成中的疏水性氨基酸、抗氧化性氨基酸和功能性官能团，它们起到螯合金属离子、清除自由基、促进过氧化物分解等抗氧化作用。天然存在的抗氧化肽主要为肌肽和谷胱甘肽，这些肽类在自然界含量甚微，提取困难；人工合成抗氧化肽主要靠化学合成、酶法合成和重组DNA技术制备，这些途径技术要求高，成本昂贵，实用价值低。利用蛋白质水解制备抗氧化肽的方式目前较多被采用，该法条件温和，过程可控，操作简单，易于工业化生产。中国专利CN 100999752 B 一种源自胶原蛋白的抗氧化肽混合物及其制备方法和用途；中国专利CN 101748182 B 一种抗氧化肽的制备方法；中国专利 CN 101690604 B 一种米蛋白抗氧化肽的制备方法，公开了利用蛋白质酶解制备抗氧化肽的技术。上述方法虽工艺简单，但所用原料成本较高，高温灭酶过程可能破坏抗氧化肽的结构和功能，影响产品的质量，而关于采用牛毛非酶水解制备抗氧化肽的研究国内外的专利文献和非专利文献均未见有报道。

牛毛是畜牧加工业的主要副产品，我国年生产量约70余万吨。目前制革工业中广泛采用的保毛脱毛技术，即会产生大量的废弃牛毛。因牛毛纤维短、颜色深，大部分作为废物丢弃而难以回收利用。但牛毛是一种优良的可再生蛋白质资源，其组成中富含胱氨酸、谷氨酸等活性氨基酸及二硫键、巯基等功能性官能团。来自牛毛的抗氧化肽，安全性高、无毒副作用，通过利用牛毛开发具有清除自由基、延缓衰老作用的抗氧化肽不仅能丰富人们对毛蛋白加工利用基础理论及其科学问题的认识，有广阔的利用前景，也能带来显著的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种利用牛毛制备抗氧化肽的方法，其特点是以畜牧加工业的副产品牛毛为原料，成本低廉，工艺简单、条件温和，在避免对环境污染的同时，加强了对牛毛中蛋白质资源的综合利用，实现固体废物的高值转化。所得抗氧化肽安全性高，无毒副作用，清除自由基能力强，具有很好的抗氧化功能。

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。

利用牛毛制备抗氧化肽的方法如下步骤：

（1）将50份牛毛用水洗净，沥水/除杂，在温度35~65°C干燥4~8h，用浓度1~5wt%的碱性溶液500~1000份浸泡0.5~2h，经水洗至中性，用浓度0.05~0.5M的无机酸溶液500~1000份浸泡2~8h，再经水洗至中性，沥去水分，晾干备用；

（2）将上述处理后的牛毛，放入浓度0.5~3wt%的碱性溶液500~1000份中，在搅拌状态下，于温度40~80°C水解反应10~48h，得到牛毛蛋白水解液；

（3）将上述牛毛蛋白水解液，在5000~10000rpm条件下离心10~30min，取上清液，用截留分子量≤10000Da 的透析袋在纯水中透析12~48h，得到牛毛多肽溶液；

（4）将牛毛多肽溶液在温度35~45°C、真空度0.05~0.1MPa条件下低温浓缩，浓缩液再在温度-65~-45°C、3~10Pa条件下冷冻干燥12~48h，得到牛毛抗氧化肽。

所述无机酸为盐酸、硫酸、硝酸和磷酸中的任一种。

所述碱性溶液中的碱为MgO、CaO、NaOH、KOH、Na₂CO₃和NaHCO₃中的至少一种。

所述利用牛毛制备抗氧化肽的方法制备得到的抗氧化肽。

所述抗氧化肽在保健品、化妆品、食品、医药产品中作为抗氧化成分应用。

性能测试

采用总抗氧化能力检测试剂（ABTS法）测定本发明产品的自由基清除能力；采用普鲁士蓝法测定本发明产品的还原能力；按照文献方法测定本发明产品在花生油体系中的抗氧化能力。所用测定方法均为常规检测手段，具体操作如下：

①ABTS法测定抗氧化肽的自由基清除能力（Zeng et al. Antibrowning and antimicrobial activities of the water-soluble extract from pine needles of Cedrus deodara. Journal of FoodScience, 2011, 76, C318-C323.）

将等量的7mM ABTS溶液与2.45mM过硫酸钾混合并置于暗处12~16小时以制备ABTS基液。用纯水稀释ABTS基液至其在波长734nm处吸光度为0.700±0.005，得ABTS工作液。取0.1mL不同浓度样品液，与3.9mL ABTS工作液混合，6min后测量其在734nm处的吸光度，纯水做空白对照。自由基清除率按下式计算：

清除率（%）=（1-A_样品/A_空白）×100%

②普鲁士蓝法测定抗氧化肽的还原能力（Zeng et al. Chemicalcomposition, antimicrobial and antioxidant activities of essential oil from Gnaphlium affine. Food and Chemical Toxicology, 2011, 49, 1322-1328.）

取2.5mL不同浓度的样品溶液，同2.5mL磷酸缓冲液（0.2M，pH6.6）和2.5mL铁氰化钾溶液（l％，w/v）混匀，50°C保温20min，迅速冷却，再加入2.5mL三氯乙酸（10％，w/v），混合后3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL纯水和0.5mL FeCl₃溶液(0.1％, w/v)，混匀，测定其在700nm处的吸光度。吸光度越大，表示还原力越强。

③测定抗氧化肽在花生油体系中的抗氧化能力（张红梅等. 花生衣红抗氧化活性的研究. 食品与生物技术学报, 2005, 24, 83-87.）

在花生油中添加不同量的样品，置70°C恒温烘箱中孵育，间隔24小时测定花生油的过氧化值(POV)。POV的测定方法：取2mL油样并加入20mL冰醋酸与氯仿的混合液（1∶1，v/v），及1mL饱和KI溶液，暗处放置3min后加入30mL纯水，以淀粉溶液(1%，w/v)做指示剂，用0.01M的Na₂ S₂O₃标准溶液滴定，同时做空白试验，POV值按下式计算：

$\mathrm{POV}(\%)=\frac{(V_1-V_2)\×\mathrm{Cs}}{m}\×0.269\×100\%$

式中： V₁ 为试样耗用Na₂S₂O₃标准溶液的体积（mL），V₂为空白耗用Na₂S₂O₃标准溶液的体积（mL），Cs为Na₂S₂O₃标准溶液的浓度（mol/L），m为试样的质量（g）；0.269为Na₂S₂O₃标准溶液1mL相当于碘的克数。

本发明及其产品具有以下优点：

（1）原料牛毛为畜牧加工业副产品，来源广泛，成本低廉，不仅对牛毛资源的开发具有重要意义，而且实现了废物的循环利用，促进了农副产品的高值转化，减少了对环境的污染，变废为宝。

（2）制备工艺简单，易于操作，产品不含有害成分，适合大规模生产。

（3）抗氧化效果好，清除自由基能力强，安全性高，无毒副作用，分子量低，活性稳定，易被人体吸收利用。广泛用于保健品、化妆品、食品、医药领域，具有显著的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为实施例1中所制备牛毛抗氧化肽的ABTS自由基清除能力。

图2为实施例2中所制备牛毛抗氧化肽的还原能力。

图3为实施例3中所制备牛毛抗氧化肽在花生油体系中的抗氧化能力。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1：

（1）将50份牛毛用水洗净，沥水/除杂，在温度 35°C干燥8h，用浓度1wt%的NaOH溶液500份浸泡0.5h，经水洗至中性，用浓度0.05M的盐酸溶液1000份浸泡8h，再经水洗至中性，沥去水分，晾干备用；

（2）将上述处理后的牛毛，放入浓度0.5wt%的NaOH溶液500份中，在搅拌状态下，于温度40°C水解反应48h，得到牛毛蛋白水解液；

（3）将上述牛毛蛋白水解液在5000rpm条件下离心30min，取上清液，用截留分子量≤10000Da 的透析袋在纯水中透析48h，得到牛毛多肽溶液；

（4）将牛毛多肽溶液在温度35°C、真空度0.05MPa条件下低温浓缩，浓缩液再在温度-65°C、3Pa条件下冷冻干燥12h，得到牛毛抗氧化肽。

所制备牛毛抗氧化肽的ABTS自由基清除能力的结果详见图1所示。

实施例2：

（1）将50份牛毛用水洗净，沥水/除杂，在温度50°C干燥6h，用浓度2.5wt%的NaCO₃溶液700份浸泡1h，经水洗至中性，用浓度0.3M的硫酸溶液700份浸泡5h，再经水洗至中性，沥去水分，晾干备用；

（2）将上述处理后的牛毛，放入浓度1.5wt%的KOH溶液700份中，在搅拌状态下，于温度60°C水解反应24h，得到牛毛蛋白水解液；

（3）将上述牛毛蛋白水解液在8000rpm条件下离心20min，取上清液，用截留分子量≤10000Da 的透析袋在纯水中透析36h，得到牛毛多肽溶液；

（4）将牛毛多肽溶液在温度40°C、真空度0.08MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液再在温度-55°C、5Pa条件下冷冻干燥24h，得到牛毛抗氧化肽。

所制备牛毛抗氧化肽的还原能力如图2所示。

实施例3：

（1）将50份牛毛用水洗净，沥水/除杂，在温度65°C干燥4h，用浓度5wt%的NaHCO₃溶液1000份浸泡2h，经水洗至中性，用浓度0.5M的硝酸溶液500份浸泡2h，再经水洗至中性，沥去水分，晾干备用；

（2）将上述处理后的牛毛，放入浓度3wt%的Na₂CO₃溶液1000份中，在搅拌状态下，于温度80°C水解反应10h，得到牛毛蛋白水解液；

（3）将上述牛毛蛋白水解液在10000rpm条件下离心10min，取上清液，用截留分子量≤10000Da 的透析袋在纯水中透析12h，得到牛毛多肽溶液；

（4）将牛毛多肽溶液在温度45°C、真空度0.1MPa条件下低温真空浓缩，浓缩液再在温度-45°C、10Pa条件下冷冻干燥48h，得到牛毛抗氧化肽。

所制备牛毛抗氧化肽在花生油体系中的抗氧化能力如图3所示。

Claims (5)

1.一种利用牛毛制备抗氧化肽的方法，其特征在于该方法包括以下步骤，按重量份计为：

（1）将50份牛毛用水洗净，沥水/除杂，在温度35~65°C干燥4~8h，用浓度1~5wt%的碱性溶液500~1000份浸泡0.5~2h，经水洗至中性，用浓度0.05~0.5M的无机酸溶液500~1000份浸泡2~8h，再经水洗至中性，沥去水分，晾干备用；

（2）将上述处理后的牛毛，放入浓度0.5~3wt%的碱性溶液500~1000份中，在搅拌状态下，于温度40~80°C水解反应10~48h，得到牛毛蛋白水解液；

（3）将上述牛毛蛋白水解液，在5000~10000rpm条件下离心10~30min，取上清液，用截留分子量≤10000Da 的透析袋在纯水中透析12~48h，得到牛毛多肽溶液；

（4）将上述牛毛多肽溶液在温度35~45°C、真空度0.05~0.1MPa条件下低温浓缩，浓缩液在温度-65~-45°C、3~10Pa条件下冷冻干燥12~48h，得到牛毛抗氧化肽。

2.如权利要求1所述利用牛毛制备抗氧化肽的方法，其特征在于无机酸为盐酸、硫酸、硝酸和磷酸中的任一种。

3.如权利要求1所述利用牛毛制备抗氧化肽的方法，其特征在于碱性溶液中的碱为MgO、CaO、NaOH、KOH、Na₂CO₃和NaHCO₃中的至少一种。

4.如权利要求1所述利用牛毛制备抗氧化肽的方法制备得到的抗氧化肽。

5.如权利要求4所述抗氧化肽在保健品、化妆品、食品、医药产品中作为抗氧化成分应用。

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