CN102954954A - 基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统 - Google Patents

Abstract

本发明所述的基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统，包括XYZ三轴机械臂及控制电路，精确温控系统工作台及控制电路，高通量荧光信号检测工作台及控制电路和系统控制软件四部分。该系统以多孔板为反应容器，配合系统包含的各种功能模块，在系统控制软件的协调和控制下能够完成核酸检测过程中的各种生化反应，具体功能包括液体精确转移、工作板精确转移、快速磁分离、吸头自动安装和丢弃、精确温度控制过程、样品低温存储、高通量荧光信号检测和系统软件总体控制。本发明将磁分离技术、颗粒微阵列技术、单碱基延伸技术和自动化系统相结合，在一系列高通量、自动化、高特异以及高实用性的单碱基差异检测新方法基础上建立新颖的高通量核酸检测系统。

Description

基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统

一、技术领域

本发明涉及生物医学研究、临床诊断所用的高通量核酸分析仪器，特别涉及一种基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统 

二、背景技术

随着人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）的完成，对人类遗传信息的研究正从测定DNA（Deoxyribonucleic Acid）序列、解释遗传信息的研究层面转移到在分子生物学水平上对生物学功能进行研究的层面上来，通过将病人与正常人的序列进行比较，从而找出那些可疑的核酸变异位点。而这些变异位点，或者说是标记，最常见的一类就是单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP），目前已成为最常用的第三代遗传标志物。SNP适合于对复杂性状的遗传解析以及基于群体基因识别等方面的研究，促使人们不断地寻找新的SNP标记和革新SNP检测技术，而高通量核酸检测技术的应用为感染性疾病和遗传性疾病筛查、肿瘤的分子诊断和药物基因组研究等领域提供了新的技术平台 

生物芯片技术的发展，为高通量SNP检测提供了良好的技术平台，然而由于生物芯片欠缺灵活度，成本一般较高，且每张芯片只能检测单个或者几个样本。此外，应用此类芯片分型时操作步骤较繁琐，一次实验耗时约3个工作日，且样本的制备需手工操作，因而对实验者的要求很高。这些不足之处在很大程度上限制了SNP检测芯片的大范围推广。近年来，由于磁性纳米颗粒具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、易修饰功能基团、易实现自动化以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和好的生物相容性，因而被广泛地应用于病原体检测、肿瘤的标志物早期诊断、疾病的体外可视检测等各个方面，在很多方面已经并正在代替或改进现有的生物芯片这一工具。 

另一方面，生物样本的高并行操作和制备是实现高通量核酸自动化检测的前提条件。面对大量样本的SNP位点分型，仅单纯依靠实验人员的手工操作，不仅在速度上难以满足要求，而且实验人员在面临高强度工作时难免出现失误，尤其在以基因扩增为基础的分子诊断方面，任何微小的误差将产生假阴性或者假阳性信号。因此，临床检验医生和研究者迫切需要一种从样本的制备、分型操作、直到最后的信号检测完全自动化的 高通量核酸检测系统，从而能够将医生和研究人员从实验台边上解放出来，大大加快检测速度和研究进程。近年来，自动检测仪器、自动移液系统与控制系统等得到了惊人的发展，已经从过去的单纯按照速度决定一切的时代改变为向质量、需求、便利方向发展。 

三、发明内容

本发明的目的：针对核酸突变及SNPs等常见变异的分析需要对多样本多位点进行高通量并行分析，从而实现快速、准确、高通量且高灵活的核酸突变与SNP分析系统的重大需求。 

本发明的技术方案：本发明的设计思想是将磁分离技术、颗粒微阵列技术、单碱基延伸技术和自动化系统相结合，在一系列高通量、自动化、高特异以及高实用性的单碱基差异检测新方法基础上建立新颖的高通量核酸检测系统。 

一种基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统，包括机械执行部分、电路控制部分和系统软件部分，电路控制部分控制机械执行部分的动作，系统软件部分对检查数据进行计算；机械执行部分包括壳体，以及位于壳体内的高通量磁分离系统、微量移液系统、精确温控系统和高通量荧光信号检测系统； 

a、微量移液系统，包括移液装置、三轴直角坐标机械臂、吸头存储装置和废液回收装置； 

三轴直角坐标机械臂包括X轴机械臂、Y轴机械臂和Z轴机械臂，分别对应XYZ坐标系的X、Y和Z轴；X轴机械臂、Y轴机械臂和Z轴机械臂上都设有导轨，导轨分别与X、Y和Z轴对应平行； 

Y轴机械臂与壳体的底板连接，且Y轴平行于底板所在平面；X轴机械臂通过滑块与Y轴机械臂上的导轨连接，且X轴平行于底板所在平面；Z轴机械臂通过滑块与X轴机械臂上的导轨连接，且Z轴垂直于底板所在平面；Y轴机械臂上连接有电机，该电机通过丝杠结构连接X轴机械臂，且丝杠平行于Y轴；X轴机械臂上连接有电机，该电机通过丝杠结构连接Z轴机械臂，且丝杠平行于X轴；所述Z轴机械臂的正面和背面都设有导轨，两面的导轨分别通过滑块连接移液装置和移板机械装置；Z轴机械臂的正面和背面分别设有电机，两个电机分别通过丝杠结构连接移液装置和移板机械装置，这两个丝杠平行Z轴；移液装置和移板机械装置在XYZ坐标系下运动； 

在底板上分布有废弃物回收装置、枪尖存储台、磁分离工作位、第二工作位、储液工作位、温控工作位、第一工作位、制冷存储工作位和高通量荧光信号检测系统，它们被移液装置和移板机械装置的运动路径覆盖；所述吸头存储装置在针尖存储台上； 

第二工作位上安装有孔板支架；储液工作位是一个长方形的凹槽，凹槽大小适合于深孔孔板，使得深孔孔板稳定放置在储液工作位上；第一工作位为一个凹槽，凹槽大小与标准酶标板相符，用于放置酶标板； 

b、精确温控系统，包括安装在温控工作位的精确温控装置和固定在制冷存储工作位上的样本存储装置； 

c、高通量荧光信号检测系统，包括荧光检测光路系统及其控制系统；除了荧光检测工作位的位置，高通量荧光信号检测系统其余位置全部为密封不透光设计； 

d、高通量磁分离系统，包括安装在磁分离工作位上的微孔板磁分离装置，移板机械装置。 

所述X轴机械臂、Y轴机械臂和Z轴机械臂上的导轨两端都装有位置传感器。 

所述移板机械装置，包括直线导杆、凸轮、直流电机、弹簧和两个机械手指；两个机械手指安装在两根平行的直线导杆上，并且两个机械手通过弹簧连接；凸轮与直流电机的转子连接；凸轮装在两直线导杆之间，且两个机械手指夹住凸轮。 

所述的吸头存储装置，包括吸头盒、吸头盒导轨、步进电机、传送带、推挡器、多通道红外发射接收装置、单通道红外发射接收装置和单通道光电传感器； 

吸头存储装置分为吸头安装区域和吸头存储区域两部分；吸头安装区域为一个吸头盒占用的空间，吸头存储区域为吸头暂存区域； 

步进电机通过传送带带动推挡器运动，首先使推挡器位于吸头盒入口处的初始位置，然后推挡器正向移动推动吸头盒沿着导轨运动，直到处于吸头安装区域的吸头盒触发单通道红外收发装置；当一盒吸头用尽后，推挡器继续正向移动，使用完的吸头盒落入废液回收装置的1区中，下一盒吸头进入吸头安装区；当所有吸头用尽后，推挡器复位至初始位置处； 

所述的精确温控系统包括微孔板反应阱、半导体制冷器，散热片、横流风扇、直流电机、热盖导轨和热盖；精确温控装置包括热盖，热盖在直流电机的驱动下在热盖导轨上自由移动，使得热盖自动关闭与打开，且当关闭时能够与微孔板反应阱内的微孔板充分地接触；微孔板反应阱下的半导体制冷器的下端安放散热片与横流风扇。 

所述的制冷样本存储装置包括散热片、反应阱、上盖、半导体制冷片及温度传感器；温度传感器在反应阱内，反应阱下为半导体制冷片，半导体制冷片下为散热器，上盖设有与反应阱相对应的微孔，上盖活动盖在反应阱上。 

高通量荧光检测系统内部结构包括位置传感器、传送带、角钢、步进电机、滑杆、微孔板托盘和黑色玻璃；在X方向和Y方向分别设有两个步进电机，步进电机通过传送带驱动角钢在X方向和Y方向往复运动，进而带动角钢另一端连接的X向滑杆和Y向滑杆，从而控制微孔板托盘在底板上的位置；在传送带两端安装有位置传感器。 

本发明的基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统具有如下功能和创新点： 

1．该系统以多孔板为反应容器，配合系统包含的各种功能模块，在系统控制软件的协调和控制下能够完成核酸检测过程中的各种生化反应，系统包含能够精确定位每个工作位的机械移板装置，将多孔板、酶标板等反应板在不同工作位之间进行相互转移，转移过程中能够保持反应板处于平稳状态； 

2．构建了适合于96孔微孔板的高通量磁分离系统，在系统软件控制下能够对96孔微孔板内的样品进行快速磁分离操作； 

3．八通道微量移液系统可一次性向多孔板中的多个微孔中加入或吸取指定容量的液体，同时多通道移液装置自动完成安装、打掉吸头(更换吸头设计)、吹打液体等操作步骤；同时该装置配有废液回收装置，能够将废弃吸头和废液回收便于用户进行统一处理； 

4．本系统设计了适合于96孔板的精确温控系统，该装置采用新型的半导体制冷片为加热制冷部件，利用半导体材料的帕尔贴效应来实现热量转移，无需制冷剂，具有清洁、制冷迅速、易于控制等特点； 

5.该系统具有对反应过程中的样品进行低温存储的功能。系统包含一个样本存储装置，该装置能够对多孔板中的样本进行低温保存，其中存储台温度：4℃； 

6．该系统构建了高通量荧光信号检测系统，能够完成对96孔酶标板中指定微孔进行荧光信号检测，具有成本低、结构简单、检测灵敏度高等特点，同时结合本系统，提出了生物大分子检测结果的判定标准； 

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述： 

四、附图说明

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明： 

图1为基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统三维布局图； 

其中：Y轴机械臂1；X轴机械臂2；Z轴机械臂3；八通道移液装置4；移板机械装置5；废弃物回收装置6；枪尖存储台7；磁分离工作位8；第二工作位9；储液工作位 10；温控工作位11；第一工作位12；制冷存储工作位13；高通量荧光信号检测系统14；仪器外壳65。 

图2为三轴直角坐标机械臂结构图； 

其中：伺服电机15；滑块16；联轴器17；丝杠18；直线导轨19。 

图3为移板机械装置结构图； 

其中：直线导轨20；步进电机21；导杆22；凸轮以及直流电机23；弹簧24；机械手指25。 

图4为吸头存储装置与废液回收装置示意图； 

其中：8通道激光接收装置26；步进电机27；枪尖盒导轨28；枪尖盒29；传送带30；8通道激光发射装置31；枪尖盒入口32；推挡器33；单通道光电传感器34；枪尖安装区域35；枪尖存储区域36。 

图5（a）和图5（b）分别为精确温控装置的侧视图和俯视图； 

其中：96孔微孔板反应阱37；核心加热器件半导体制冷片38；散热片39；横流风扇40；直流电机41；热盖导轨42；热盖43。 

图6为微孔板磁分离装置结构示意图； 

其中：钕铁硼永磁体44；96孔板支架45；底座46；96孔板支架固定螺丝47。 

图7为样本存储装置结构图； 

其中：48孔反应阱48；上盖49；散热片50。 

图8为高通量荧光信号检测系统外部结构图； 

其中：外壳51；激发光源52；光电倍增管53；光纤54；光路通口55；底座56；密封门57；微孔板托盘58。 

图9(a)和图9(b)为高通量荧光信号检测系统的底板采用步进电机的机械传动装置结构示意图，其中图9(a)为底部示意图；图9(b)为内部示意图； 

其中：步进电机59；位置传感器60；传送带61；角钢62；滑杆63；黑色玻璃64。 

图10为基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统总体框图。 

图11(a)为三轴直角坐标机械臂控制电路示意图；图11(b)三轴机械臂移板机械装置控制电路示意图。 

图12为精确温度控制装置控制电路示意图。 

图13为高通量荧光信号检测系统控制电路示意图。 

五、具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明和描述： 

参照图10，本发明是由系统核心方法、系统硬件和系统软件三个主要部分组成的，其中系统核心方法包括基于功能化磁性纳米颗粒的核酸自动化提取技术、靶序列的获取与放大技术、基于双色荧光标签的高通量SNP分型技术、基于单碱基循环延伸的高灵敏突变检测技术、基于磁分离和PCR array的快速分子诊断、基于磁分离的快速荧光免疫检测等。这些检测方法具有高通量、高灵敏度、低成本等特点，与软硬件有机结合，构成一种基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统。系统硬件由四部分组成，分为高通量磁分离系统、微量移液系统、精确温控系统和高通量荧光信号检测四部分。最后还包括系统控制软件。 

图1所示为基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统三维布局图，参照图11，系统硬件部分全部安装在底板上，并且在外部有一个可开关的封闭式系统外壳65。系统硬件由四部分组成，其中高通量磁分离系统包括安装在磁分离工作位8上的微孔板磁分离装置，移板机械装置5和三轴机械臂（X轴机械臂2，Y轴机械臂1，Z轴机械臂3）。其中Y轴机械臂1通过固定螺丝直接与系统底板相连，机械臂下部中空，用于安装机械臂所有的控制电路，X轴机械臂2起点一端通过固定金属板和固定螺丝安装在Y轴机械臂1导轨上，与Y轴机械臂1成90°，使得X轴机械臂及其安装在上面的所有装置可以在Y轴方向随意移动。Z轴机械臂3安装在X轴机械臂2侧面导轨上，中间有丝杠穿过，使得Z轴机械臂3可以在X轴方向自由移动，这三个机械臂构成了系统的三轴直角坐标机械臂，此系统的所有移动过程，都是通过这个部分完成的。，三轴直角坐标机械臂在保证运动速度的同时，能够有效地进行精确定位，从而可以配合移板机械装置、微量移液装置等完成生物样本的地自动化处理。 

移板机械装置5安装在Z轴机械臂3背面导轨上，它结合三轴直角坐标机械臂可实现各工作位之间转移96孔微孔板的要求。移板机械装置能够平行抓板，水平误差小于0.1mm。在放置反应板的过程中，可完成压板动作以保证反应板平稳放置在工作位上。在完成压板动作时，移板机械装置在反应板两侧均匀施力。反应板放置到工作位上之后，保证板沿与固定台面之间间距小于0.1mm。在磁分离工作位8上装有微孔板磁分离装置，其作用是使反应板中的磁性颗粒和溶液分离，获得所需的试剂（颗粒或者溶液）以进行下一步实验。 

微量移液系统能够在系统软件的控制下实现自动安装卸载吸头、配合机械臂自动完成在不同工作位之间液体转移操作、洗涤磁性颗粒、吹打液体等实际操作步骤。根据系统所应完成的动作，该系统主要包含四个部分：八通道微量移液装置4、三轴直角坐标 机械臂、吸头存储装置6和废液回收装置7。由于本系统在进行移液的同时进行反应板转移的情况是不允许的，微量移液系统与高通量磁分离系统中共用三轴直角坐标机械臂以节省系统的空间和成本。 

八通道微量移液装置4固定在Z轴机械臂3正面导轨上，可以在XYZ轴方向自由移动，到达指定目标位置，系统采用的微量移液系统原理类似于普通注射器，其核心部件是采用注射式加样原理的全自动液体稀释器，将决定整个移液系统的精度。吸头存储装置6和废液回收装置7安装于Y轴机械臂1和工作台之间，它与Y轴平行，整体长度也与Y轴机械臂相同，吸头存储装置用于暂存实验中所需的一次性吸头，废液回收装置用于暂存试验中产生的废弃吸头、废液以及废弃的吸头盒，移液装置4可以在三轴轴机械臂的驱动下到达此装置上方完成吸头的自动安装。 

在高通量核酸检测方法中，需要对96孔反应板内的样本进行精确、快速控温，从而完成核酸的杂交等功能，同时在高通量自动化检测过程中，样本、反应试剂在反应前或者反应后均需要低温保存，因此系统必需精确温控系统，它由安装在温控工作位11上可快速升降温的精确温控装置和固定在制冷存储工作位13上能够进行低温存储的样本存储装置组成。这两个装置内部为温度控制电路，温控装置通过四角的固定螺丝安装在系统底板上。 

系统工作位除了信号检测全部安装在Y轴机械臂的右侧底板上，包括磁分离工作位8，第二工作位9，储液工作位10，温控工作位11，第一工作位12，制冷存储工作位13。第二工作位9上安装有96孔板支架，它用于放置标准96孔板；储液工作位10是一个长方形的凹槽，可使得深孔板稳定放置在工作位上，用于常温储存实验所需试剂；第一工作位12同样为一个凹槽，大小与96孔酶标板相符，用于放置酶标板，当含有最后结果的液体转移至酶标板后，通过移板机械装置将其移至信号检测模块进行结果检测。 

高通量荧光信号检测系统14包括荧光检测光路系统和荧光检测控制系统，采用固定的荧光光路系统，通过机械传动装置拖动96孔酶标板至检测位置，从而能够完成对96孔酶标板中指定微孔中进行荧光信号检测。通过系统控制软件可以选择不同的激发光源、滤色片、信号增益等参数，检测结果能够直观地呈现在软件界面上并能够完成数据的初步分析。高通量荧光信号检测系统14与系统工作位平行安装在Y轴机械臂1右侧，总体形状为长方体，通过底部四角螺丝固定在系统底板上，因为用光学检测方法进行结果分析，所以除了荧光检测工作位的位置，系统其余位置全部为密封不透光设计，以免有杂光干扰。 

参照图2，本系统设计了XYZ三轴直角机械臂，整个机械臂的结构如图2所示，在传动方式上，采用滚珠丝杆18驱动三轴直角机械臂，可以确保系统运动效率高、发热小，能够实现精确高速进给，适合本系统，丝杠安装在机械臂上部。在驱动方式上，选择松下A4系列伺服电机15组成的伺服驱动系统驱动三轴直角机械臂。伺服电机在制动、过载等性能上都比步进电机具有一定的优势，很好地满足了本系统的需求，伺服电机安装在机械臂起点一侧，与丝杠相连。在伺服电机15与丝杠18之间使用联轴器17作为连接部件，同时起到自动补偿作用。在三轴机械臂一侧都装有双导轨19，使得运动组件可以在导轨上自由稳定的移动。机械臂的两端分别设有位置传感器用于标识机械臂的起点和终点。 

参照图11（a），图示为机械臂控制电路，由于伺服电机带有的编码器，因此伺服电机不会出现丢步现象。伺服驱动器设置为位置控制模式，控制电路连接示意图如图11（a）所示。机械臂控制核心为微处理器（单片机），因为处理器信号与驱动器信号电平不一致，所以中间需要光耦隔离。 

当机械臂工作时，伺服驱动器将接收到的命令通过编码器分解为脉冲和命令相关电平，控制伺服电机按照设定的速度和方向转动，同时通过联轴器带动丝杠以相同的方向和速度转动，此时安装在机械臂上的相关装置将会随着丝杠螺纹的传动而进行相同方向和速度的移动，以上即为机械臂的基本运动过程。在机械臂两端的位置传感器在运动时一直处于检测状态，当相关装置运动至机械臂两端时，传感器检测到相关信号并作出反馈，保证机械臂安全。 

参照图3，图示为移板机械装置示意图，主要由直线导轨20，步进电机21，导杆22，凸轮以及直流电机23，弹簧24和机械手指25组成。与机械臂运动原理相同，装置安装在Z轴机械臂侧面导轨上，不同的是驱动方式采用步进电机，在步进电机21和丝杠的驱动下，装置能够沿直线导轨20做上下运动。在导轨的顶端安装有位置传感器，在装置内部安装有两根平行导杆22，两个机械手指25通过弹簧24连接并被安装在两根导杆22上，可以沿导杆22移动，它们与安装在中间的凸轮23紧密接触，凸轮23可在与之相连的直流电机23的驱动下按照顺时针方向转动，由于凸轮呈椭圆型，使得机械手指25可在凸轮的驱动下作往复运动，形成了机械手指25张开和闭合的动作。通过检测固定在机械手指上的位置传感器可判断机械手指25的张开和闭合状态。 

移板机械装置控制电路主要包括用于控制机械装置沿着Z方向运动的步进电机，用于控制机械手指张开和闭合的直流电机，整个控制电路示意图如图11（b）所示。直流 电机和步进电机分别利用直流电动机驱动芯片和高性能步进电机驱动芯片来驱动，位置传感器将状态信号反馈给微处理器进行处理。 

当系统上电后，机械装置在步进电机21的驱动下到达顶端的复位位置（位置传感器），通过三轴机械臂运动至反应板上方，控制直流电机使得凸轮23运动使机械手指25呈打开状态，在步进电机21驱动下下降至抓板位置（反应板上方约1mm），控制凸轮23转动90°使机械手指25呈闭合状态，抓紧反应板的边沿，然后驱动使反应板与装置一起上升至复位位置，抓板过程完成；机械臂再次运动带动反应板一起运动至目标工作位上方，移板装置下降使反应板放入工作位，之后凸轮23再次转动90°，机械手指25张开，与反应板脱离，随着装置上升至复位位置，放板过程完成。注意在机械臂运动过程中移板装置不可有包括升降，凸轮转动等一系列动作，防止发生碰撞。 

参照图4，吸头存储装置和废液回收装置整个系统的构成如图5所示。废液回收装置由两个区域构成，1区是用来回收可重复使用的吸头盒，2区是用来收集实验过程中产生的废弃吸头、废弃反应板以及废液等。 

吸头存储装置6主要由吸头盒、吸头盒导轨28、步进电机27、传送带30、推挡器33、8通道激光发射装置31、8通道激光接收装置26、单通道光电传感器34等组成。整个装置分为吸头安装区域35和吸头存储区域36两部分。吸头安装区域35为一个吸头盒占用的空间，移液装置可以在三轴轴机械臂的驱动下到达吸头安装区域35完成吸头的自动安装。吸头存储区域36为吸头暂存区域，最多可以并排摆放5个吸头盒。吸头盒设计成96孔板样式，一次性可放置96个吸头，孔间间距与八通道微量移液装置一致，便于自动安装吸头。在安装区域下方装有步进电机27，传送带30的一端与之相连，另一端安装在吸头入口32位置，位于整个装置的中间，当步进电机27转动时带动传送带随之转动，使得安装在传送带上方的推挡器33也随之做前后水平移动，带动所有吸头盒自动移至安装区域，在安装区域终点处装有单通道光电传感器34，用于检测吸头盒位置。在整个装置的两端装有8通道激光发射装置31和8通道激光接收装置26，它们通过螺丝固定于装置上方，每个检测通道与吸头盒每一行位于同于垂直平面，用于检测吸头安装结果。 

系统开启后，步进电机27通过传送带30带动推挡器33运动，首先使推挡器33位于吸头盒入口32处的初始位置，然后推挡器33正向移动推动吸头盒29沿着导轨运动，直到处于吸头安装区域的吸头盒触发单通道光电传感器34，此时吸头盒的位置被精确定位。系统软件控制XY轴机械臂使移液装置到达吸头安装区域正上方，进而通过控制Z轴机械臂3来控制移液装置与吸头的距离，使吸头与装置紧密结合，之后移液装置上升， 带动吸头离开吸头盒，吸头安装检测自动开启，发射装置31打开激光器，发出8通道激光，如果所有通道顺利装有吸头，则激光无法通过，接收装置没有相应，完成吸头的自动安装过程，如果有漏装，则接收装置收到光电信号并反馈，提示安装失败。当一盒吸头用尽后，推挡器33继续正向移动，使用完的吸头盒落入废液回收装置的1区中，下一盒吸头进入吸头安装区。当所有吸头用尽后，推挡器33复位至初始位置处，系统软件提示用户添加吸头。 

参照图6，微孔板磁分离装置由96孔板支架45和底座46构成。该装置的磁性元件使用强磁性的钕铁硼永磁体44，底座46和96孔支架45均选用铝材制作，支架45上设有12×8个孔，避免在磁分离时96孔微孔板的移动造成磁分离位置不准确。钕铁硼永磁体磁条44嵌入底座46的凹槽内，6根条形永磁体组成阵列，磁条所处的位置与96孔板上各排试管的间隙对应，满足所有微孔同时进行磁分离的要求，通过调节96孔板支架固定螺丝47可方便地调整支架高度。用户进行磁分离时，系统通过移板机械装置的移板过程使96孔板嵌入到磁分离装置中，静置后，反应板中的磁性颗粒均在磁场作用下团聚到微孔侧壁上，分离完成。这时可根据实验需要，分离上清液和磁性颗粒，提取需要部分进行下一步实验。 

参照图5，精确温控装置参考市场化的热循环仪的结构进行设计，其简化结构示意图如图6所示。其中37为96孔微孔板反应阱，38为核心加热器件半导体制冷片，39为散热片，40为横流风扇，41为直流电机，42为热盖导轨，43为热盖。精确温控装置包含有热盖43，可使96孔微孔板内的液体在加热的时候避免蒸发。 

本系统为提高反应阱温度变化速率，保证反应阱的温度均一性，需要使用6片半导体制冷器38串联组成阵列，对反应阱进行加热/制冷。使用时，半导体制冷器38上端紧贴反应阱底部。因为半导体制冷器38热端和冷端的温差也会影响半导体制冷器的性能，所以在半导体制冷器的下端安放散热片39与风扇40，尽快散掉非工作端堆积的热量。本装置同时优化了反应阱的结构，使反应阱与离心管贴合更加密切。在反应阱上方装有热盖43，两侧为热盖导轨42，热盖43可在直流电机41的驱动下在热盖导轨42上自由移动，使得反应阱自动关闭与打开。用户进行温控时，系统通过移板机械装置5的移板过程使96孔板嵌入到96孔反应阱中，通过半导体制冷片、横流风扇和散热片进行控温，同时直流电机转动，使得热盖运动至反应阱上方，温控过程结束后，直流电机反向转动，热盖反向运动至指定位置，温控过程结束。 

参照图7，样本存储装置与精确温控装置的结构及设计原理一样，不同之处是采用48孔反应阱作为样品存储机构。该装置主要由散热片50、48孔反应阱48、上盖49及 半导体制冷片及温度传感器等组成，上盖49一端通过螺栓固定在装置一侧，另一端带有螺丝，在反应阱相同一侧有相应螺母，其结构图如图7所示。使用时，将需要制冷存储的样品加入48孔微孔板中，将该板放入到样本存储装置的48孔反应阱48中，盖上上盖49并旋紧螺丝。上盖含有与48孔反应阱相对应的微孔，当需要加样或者吸取液体时，移液器可透过上盖49的微孔直接从48孔反应板中吸取液体。 

参照图12，温度控制模块以高精度低噪声的AD转换芯片为核心，温度采集电路采用四线制接法，通过高精密铂电阻采集温度。在温控算法方面，采用了PID控制和模糊控制相结合的复合控制算法，同时结合Bang-Bang控制达到了快速温度变化的效果。微控制器通过SPI总线与AD芯片进行通信，读取AD转换的结果。同时通过光耦和驱动芯片来控制热盖的开关。 

参照图8，图8所示为高通量荧光信号检测系统外部结构图，整个系统由底座56、外壳51、微孔板托盘58、密封门57、激发光源52、光电倍增管53、光纤54和光路通口55等结构组成，内部所有部件安装在底座56上，为了隔光此装置安装有外壳51，二者通过螺丝固定，在外壳上部安装有激发光源52和光电倍增管53，有光纤54与它们相连，用于传送光电信号至光路通口处55，在装置另一侧外部装有密封门57，其大小适合于机械移板装置，在相应直流电机的带动下，密封门57可以自动打开或关闭。 

参照图9，高通量荧光信号检测系统的底座底部结构如图9（a）所示，在X方向和Y方向分别设有两个步进电机59，步进电机通过与之相连的传送带61可驱动角钢62在X方向和Y方向往复运动，带动角钢62另一端连接的滑杆X 63和滑杆Y 63，如图9(b)所示，滑杆63另一端固定在微孔板托盘58的两侧，从而可以控制微孔板托盘58在底座上的位置，使96孔酶标板的任意一个微孔能够达到光路通口55处。在传送带61两端安装有位置传感器60，作为机械系统的原点，在系统上电时首先使机械系统处于该点。底板上安装有黑色不透明玻璃64。 

用户进行信号检测时，密封门57打开，系统通过移板机械装置的移板过程使96孔酶标板嵌入到微孔板托盘58中，密封门57关闭，当机械传动装置接收到命令后，通过计算得出所需要行进的距离，微孔板托盘58在步进电机59的驱动下，拖动96孔酶标板，使其中的某个微孔处于光路通口55的正下方，此时激发光照射到微孔内的样品上，能够最大效率地激发荧光，而样品发射出的荧光再次通过透镜汇聚后，通过光纤54传导到达光电倍增管53的检测窗，由光电倍增管53将荧光信号转换成电信号，然后再经过信号处理得到荧光强度。进行完荧光信号的检测后，机械装置能够继续拖动酶标板使 下一个需要检测的微孔处于检测位置处，重复上述步骤可以完成对所有设定的微孔中荧光信号的检测。 

参照图13，根据高通量荧光检测系统所需要完成的工作，控制系统主要包含：机械传动系统控制电路、光源采样电路、低纹波可调直流电源、信号调理电路等。 

参照图11，系统在硬件平台的基础上设计了系统控制软件，通过该软件可设定相应的实验步骤和设置相应的参数对整个系统进行控制。软件系统主要由用户管理、实验设计、数据分析及数据库管理四个部分组成。用户管理部分主要包括用户权限管理、系统设置(系统校准与定位)等。系统设置包括对机械部分、移液模块、实验平台、温控模块以及信号检测模块的校准程序等。实验设计部分包括实验台设置、实验步骤设置、样品试剂的管理、预运行及运行界面等。实验平台设置主要是设定用户向各个模块中添加样品、各种反应试剂以及反应板的操作步骤。数据库管理主要是对实验流程的保存、实验数据的保存以及网络服务器的构建。最终实验数据可通过数据处理模块进行相应的处理，得到不同的统计图 

基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统具体工作过程实施例： 

1.首先是是实验前的准备工作：将一次性吸头摆放到吸头盒内，然后放置到高通量核酸检测系统内；将废物回收装置清理干净；使用移液器将本次实验常温下所需的试剂装入深孔板中并放到系统的储液工作位上，使用移液器将本实验低温下所需的试剂装入48孔板中并放到系统的制冷存储工作位上，将试剂盒放入自动化工作站中的B号工作位上。将装有样本的96孔板放入到本系统中的温控工作位上。 

2.软件设置：按照试验平台的实际布置，在系统软件上进行相应的设置，此处需要确保系统控制软件中的设置与实际摆放一致。其中实验第一步必须为上电自检，包括伺服驱动器检测、机械臂复位、机械抓手检测、吸头安装检测和吸头盒自动移动至安装区域，若一切正常则自动进行下一步，如果出现问题则暂停实验并提示用户。 

3.提取： 

1)裂解：移液装置4首先在XY轴机械臂带动自动安装吸头。随后在位于B号工作位上的试剂盒中吸取试剂加入到温控工作位上的96孔板中，随后自动运动至废液存储区域丢弃吸头。重新安装吸头，将96孔板内的溶液温和吹打混匀后，在系统控制下启动精确温控装置进行裂解 

2)结合：充分吹打混匀试剂盒中试剂，吸取混合液至96孔板中。通过机械臂使移板机械装置将96孔板移至磁分离单元，丢弃上清液。 

3)清洗：清洗过程可通过反复吹打过程来实现，首先在96孔板中加入清洗液，之 后通过多次吹打清洗，将96孔板移至磁分离处，弃去清洗液，最后将反应板移回原工作位，完成一次清洗。 

4)洗脱：在试剂盒内吸取洗脱液加入到反应板内，温和吹打混匀，将反应板转移至温控单元，温控孵育5min后，进行磁分离，将上清液转移至新的96孔板中。 

4.扩增： 

1）吸取基因组DNA溶液至新的96孔板中，从制冷存储工作位中吸取引物和混合液。 

2）在本系统温度控制工作位上进行扩增，得到产物。 

在整个实验过程中，新吸头盒自动移至安装区域，如果6盒吸头全部用完，则系统提示用户重新安装吸头，当安装完成，实验继续进行并将新吸头盒自动推至安装区域。 

Claims (7)

1.一种基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统，包括机械执行部分、电路控制部分和系统软件部分，电路控制部分控制机械执行部分的动作，系统软件部分对检查数据进行计算，其特征在于：包括机械执行部分壳体，以及位于壳体内的高通量磁分离系统、微量移液系统、精确温控系统和高通量荧光信号检测系统；

a、微量移液系统，包括多通道移液装置、三轴直角坐标机械臂、吸头存储装置和废液回收装置；

三轴直角坐标机械臂包括X轴机械臂、Y轴机械臂和Z轴机械臂，分别对应XYZ坐标系的X、Y和Z轴；X轴机械臂、Y轴机械臂和Z轴机械臂上都设有导轨，导轨分别与X、Y和Z轴对应平行；

Y轴机械臂与壳体的底板连接，且Y轴平行于底板所在平面；X轴机械臂通过滑块与Y轴机械臂上的导轨连接，且X轴平行于底板所在平面；Z轴机械臂通过滑块与X轴机械臂上的导轨连接，且Z轴垂直于底板所在平面；Y轴机械臂上连接有电机，该电机通过丝杠结构连接X轴机械臂，且丝杠平行于Y轴；X轴机械臂上连接有电机，该电机通过丝杠结构连接Z轴机械臂，且丝杠平行于X轴；所述Z轴机械臂的正面和背面都设有导轨，两面的导轨分别通过滑块连接移液装置和移板机械装置；Z轴机械臂的正面和背面分别设有电机，两个电机分别通过丝杠结构连接移液装置和移板机械装置，这两个丝杠平行Z轴；移液装置和移板机械装置在XYZ坐标系下运动；

在底板上分布有废弃物回收装置、枪尖存储台、磁分离工作位、第二工作位、储液工作位、温控工作位、第一工作位、制冷存储工作位和高通量荧光信号检测系统，它们被移液装置和移板机械装置的运动路径覆盖；所述吸头存储装置在针尖存储台上；

第二工作位上安装有孔板支架；储液工作位是一个长方形的凹槽，凹槽大小适合于深孔孔板，使得深孔孔板稳定放置在储液工作位上；第一工作位为一个凹槽，凹槽大小与标准酶标板相符，用于放置酶标板；

b、精确温控系统，包括安装在温控工作位的精确温控装置和固定在制冷存储工作位上的样本存储装置；

c、高通量荧光信号检测系统，包括荧光检测光路系统及其控制系统；除了荧光检测工作位的位置，高通量荧光信号检测系统其余位置全部为密封不透光设计； 

d、高通量磁分离系统，包括安装在磁分离工作位上的微孔板磁分离装置，移板机械装置。

2.根据其权利要求1所述的基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统，其特征是所述X轴机械臂、Y轴机械臂和Z轴机械臂上的导轨两端都装有位置传感器。

3.根据其权利要求1所述的基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统，其特征是所述移板机械装置，包括直线导杆、凸轮、直流电机、弹簧和两个机械手指；两个机械手指安装在两根平行的直线导杆上，并且两个机械手通过弹簧连接；凸轮与直流电机的转子连接；凸轮装在两直线导杆之间，且两个机械手指紧贴中间凸轮。

4.根据其权利要求1所述的基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统，其特征是所述的吸头存储装置，包括吸头盒、吸头盒导轨、步进电机、传送带、推挡器、多通道红外发射接收装置、单通道红外发射接收装置和单通道光电传感器；

吸头存储装置分为吸头安装区域和吸头存储区域两部分；吸头安装区域为一个吸头盒占用的空间，吸头存储区域为吸头暂存区域；

步进电机通过传送带带动推挡器运动，首先使推挡器位于吸头盒入口处的初始位置，然后推挡器正向移动推动吸头盒沿着导轨运动，直到处于吸头安装区域的吸头盒触发单通道红外收发装置；当一盒吸头用尽后，推挡器继续正向移动，使用完的吸头盒落入废液回收装置的1区中，下一盒吸头进入吸头安装区；当所有吸头用尽后，推挡器复位至初始位置处。

5.根据其权利要求1所述的基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统，其特征是所述的精确温控系统包括微孔板反应阱、半导体制冷器，散热片、横流风扇、直流电机、热盖导轨和热盖；精确温控装置包括热盖，热盖在直流电机的驱动下在热盖导轨上自由移动，使得热盖自动关闭与打开，且当关闭时能够与微孔板反应阱内的微孔板充分地接触；微孔板反应阱下的半导体制冷器的下端安放散热片与横流风扇。

6.根据其权利要求1所述的基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统，其特征是所述的制冷样本存储装置包括散热片、反应阱、上盖、半导体制冷片及温度传感 器；温度传感器在反应阱内，反应阱下为半导体制冷片，半导体制冷片下为散热器，上盖设有与反应阱相对应的微孔，上盖可以打开或者活动盖在反应阱上。

7.根据其权利要求1所述的基于磁分离的多样本多位点高通量核酸分析系统，其特征是高通量荧光检测系统内部结构包括位置传感器、传送带、角钢、步进电机、滑杆、微孔板托盘和黑色玻璃；在X方向和Y方向分别设有两个步进电机，步进电机通过传送带驱动角钢在X方向和Y方向往复运动，进而带动角钢另一端连接的X向滑杆和Y向滑杆，从而控制微孔板托盘在底板上的位置；在传送带两端安装有位置传感器。 

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