CN102952278A - 一种用于眼内填充的原位交联水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于眼内填充的原位交联水凝胶及其制备方法与应用。该制备方法包括如下步骤：式(I)所示四臂端巯基聚乙二醇与式(II)所示聚合物经原位交联反应即得。本发明还提供了上述方法制备的原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用。本发明所提供的人工玻璃体替代材料与传统的人工玻璃体替代材料相比，具有在眼内可长期填充，无明显毒性反应的优点，并且在结构上模拟原始的天然玻璃体结构，为亲水性。

Description

一种用于眼内填充的原位交联水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种用于眼内填充的原位交联水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

玻璃体切除术是临床上常用的治疗视网膜脱离、玻璃体出血、眼后段外伤等眼底疾患的手术方法。玻璃体被切除后，需要注入眼内填充物来进行视网膜的顶压复位和维持眼球外形。常用的眼内填充物有硅油和惰性气体(如SF₆、C₂F₆和C₃F₈等)。但硅油填充存在硅油乳化、继发性青光眼、角膜带状变性及并发性白内障等并发症，必须二次手术取出。对于那些硅油依赖眼，硅油取出后即眼球萎缩者，则无能为力。而气体眼内填充的时间比较短暂，因为气体会不断被眼内组织吸收，所以在眼内的容积逐渐缩小，不超过2个月的时间内，气体会完全吸收。因此，迄今为止，临床上缺乏比较理想的长期眼内填充物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于眼内填充的原位交联水凝胶及其制备方法与应用。

本发明提供的一种原位交联水凝胶的制备方法，包括如下步骤：式(I)所示多臂端巯基聚乙二醇与式(II)所示聚合物(α-PEG-MA)经原位交联反应即得；

式(I)中，m可为大于1的整数；式(II)中n可为大于1的整数。

上述的制备方法中，式(I)中，m可为25-75之间的整数；式(II)中n为30-60之间的整数。

上述的制备方法中，式(I)中m具体可为55，式(II)中n具体可为30或60。

上述的制备方法中，所述原位交联反应的溶剂可为水、质量百分浓度为0.9％的氯化钠水溶液和pH值为7.0-8.0的磷酸盐缓冲液中任一种。

上述的制备方法中，所述式(I)所示多臂端巯基聚乙二醇与式(II)所示聚合物的摩尔份数比可为(1-10)∶(1-10)，1∶1或1∶10。

本发明还提供了上述方法制备的原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用。

本发明所提供的人工玻璃体替代材料与传统的人工玻璃体替代材料相比，具有在眼内可长期填充，无明显毒性反应的优点，并且在结构上模拟原始的天然玻璃体结构，为亲水性。

附图说明

图1为本发明所制备的α-PEG-MA的核磁共振氢谱谱图。

图2为实施例3中使用实施例1制备的水凝胶进行流式细胞仪检测凋亡细胞比率(早期凋亡细胞，即分析数据中的“LR”；晚期凋亡细胞和坏死细胞，即分析数据中的“UR”；正常细胞，即分析数据中的“LL”；细胞碎片，即分析数据中的“UL”)。

图3为实施例4中使用实施例1制备的水凝胶填充兔眼玻璃体腔1年后的眼底照相。

图4为实施例4中使用实施例1制备的水凝胶填充兔眼玻璃体腔1年后的双眼视网膜电图。

图5为实施例4中使用实施例1制备的水凝胶填充兔眼玻璃体腔1年后的玻璃体腔凝胶离体照相。

图6为实施例4中使用实施例1制备的水凝胶填充兔眼玻璃体腔1年后的视网膜苏木素-伊红染色。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的四臂端巯基聚乙二醇(4ARM-PEG-SH)，数均分子量约为10000(其中，式(I)中，m为55)，购于JenChem，货号为4ARM-SH-10K。

下述实施例中所用的PEG-O-EMA是按照下述方法制备得到的：

以羟端基PEG(数均分子量约为2000，Alfa-Aesar提供，货号B22181)为原料，制备式(II)所示化合物，其中n为30或60。具体制备方法如下：

(1)将9.0g羟甲基丙烯酸乙酯(TCI提供，货号H0916)溶于75mL无水乙醚中，冰浴下滴入2.3mL三溴化磷，冰浴下反应3小时后于室温继续反应24小时，得到溴甲基丙烯酸乙酯。

(2)将20.0g端羟基PEG溶于300mL二氯甲烷中，加入2.4g氢化钠，搅拌1小时。在冰浴下滴入8mL上述制备的溴甲基丙烯酸乙酯，室温下反应24小时，即得式(II)所示化合物。

所得化合物的结构可以从图1的核磁氢谱得到确认。

实施例1、原位交联水凝胶的制备

将4ARM-PEG-SH和PEG-O-EMA(n为30)分别溶于水中，配制成浓度均为200mg/mL的溶液，将两者的溶液以体积比为1∶1在体外混合(该体系中，4ARM-PEG-SH与PEG-O-EMA的质量份数比为1∶1)，在室温下进行原位交联反应3h得到原位交联水凝胶。

实施例2、原位交联水凝胶的制备

将4ARM-PEG-SH和PEG-O-EMA(n为60)分别溶于质量百分含量为0.9％的氯化钠水溶液中，配制成浓度均为50mg/mL的溶液，将两者的溶液以体积比为1∶10在体外混合(该体系中，4ARM-PEG-SH与PEG-O-EMA的质量份数比为1∶10)，在下进行原位交联反应3h得到原位交联水凝胶。

实施例3、原位交联水凝胶的制备及其细胞安全性试验

(1)将4ARM-PEG-SH和PEG-O-EMA分别溶于pH＝7.4浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度均为50mg/mL的溶液，将两者的溶液以体积比为1∶1在体外混合，室温下进行原位交联反应3h得到凝胶块，用于细胞实验。

(2)细胞系(大鼠视网膜色素上皮细胞D407细胞系)常规培养，培养液为DMEM/F12＝1∶1(购于美国Hyclone公司)，加入胎牛血清(终浓度为10％)，取传至3-6代的细胞用于实验。

(3)0.25％的胰酶消化细胞，混匀，制成细胞悬液，消化制成细胞悬液后按5×106/ml接种于无菌6孔培养板。放入37度5％CO₂的恒温培养箱内培养，至细胞融合到70％孔底面积，给予无血清的培养液培养12h。

(4)弃掉培养液，每孔重新加入新鲜的无血清培养液1ml，同时加入制备的原位交联水凝胶块，对照组不加，培养箱内继续培养24h。

(4)冷PBS洗涤2次。0.25％胰酶消化至细胞开始脱落，20％胎牛血清终止消化。冷PBS洗涤2次。1000rpm离心5分钟；弃上清，用100ul凋亡结合缓冲液重悬浮细胞；细胞悬液转移至流式管，加5ul Annexin V和10ul PI；室温避光作用15分钟。

(5)加入400ul结合缓冲液，上机(流式细胞仪；BD FACS Calibur)检测。

结果显示：在凝胶组，早期凋亡细胞比率6.3％，晚期凋亡细胞比率为3.32％(图2)；在正常对照组，早期凋亡细胞比率为4.55％，晚期凋亡细胞比率为4.2％。

上述结果表明，本发明提供的新材料原位交联凝胶没有明显的细胞毒性反应。

实施例4、实施例1制备的原位交联水凝胶的动物眼内填充安全性试验

试验选取青紫兰兔。

动物实验步骤如下：

(1)麻醉青紫兰兔。

(2)沿角膜缘剪开半侧球结膜，19G巩膜穿刺刀造灌注孔和玻切孔。

(3)插入灌注头，打开灌注，灌注液的配方如下：500ml乳酸林格氏液中加入50％葡萄糖4ml，地塞米松(5mg/1ml)1.6ml，盐酸肾上腺素(1mg/1ml)0.Sml，妥布霉素(8万U/1ml)0.2ml。

(4)玻璃体切割头伸入玻璃体腔，切除全部玻璃体。

(5)将实施例1制备的原位交联水凝胶注入玻璃体腔。

(6)缝合巩膜口和球结膜。

(7)结膜囊涂抹泰利必妥眼膏。

手术1年后，进行眼底照相检查，可见视网膜及脉络膜表现正常，无出血、渗出等病理性改变(如图3所示)；视网膜电图检查显示双眼a/b波振幅和潜伏期相近，原位交联凝胶眼(左眼)无明显视网膜毒性功能损害(如图4所示)；处死兔子，剖开眼球，可见玻璃体腔内存在符合玻璃体透明/不定型的特点，表面无渗出膜、出血覆盖(如图5所示)；对兔眼视网膜用苏木素-伊红染色(如图6所示)，可见视网膜各层次结构正常，细胞排列紧密，未见水肿、出血等改变。

综上，细胞试验证实本发明提供的原位交联水凝胶的细胞毒性轻微；动物试验显示，长达一年的时间，本发明提供的原位交联水凝胶在玻璃体切除后的兔眼内仍保持凝胶形式存在，并且保持透明；视网膜和脉络膜的各层组织结构存在，未见出血、水肿等病理改变，尤为重要的是，视网膜的功能也大致正常；动物体内试验也证实本材料在眼内填充是安全的。

Claims (6)

1.一种原位交联水凝胶的制备方法，包括如下步骤：式(I)所示多臂端巯基聚乙二醇与式(II)所示聚合物经原位交联反应即得；

式(I)中，m为大于1的整数；式(II)中n为大于1的整数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：式(I)中，m为25-75之间的整数；式(II)中n为30-60之间的整数。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述原位交联反应的溶剂为水、质量百分浓度为0.9％的氯化钠水溶液和pH值为7.0-8.0的磷酸盐缓冲液中任一种。

4.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述式(I)所示多臂端巯基聚乙二醇与式(II)所示聚合物的摩尔份数比为(1-10)∶(1-10)。

5.权利要求1-4中任一所述方法制备的原位交联水凝胶。

6.权利要求5所述的原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用。

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