CN102944539A - 基于量子点共振能量转移的mgmt活性检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测试剂盒及方法。所述试剂盒主要包括：（1）链霉亲和素修饰的磁性量子点；（2）四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物；（3）生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤；（4）缓冲液A；（5）O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品。本发明利用量子点与罗丹明之间的共振能量转移原理进行MGMT的活性检测，以最大限度地避免对TMR的直接激发，降低假阳性的发生率；使用Biotin-BG和anti-MGMT两种特异探针，通过酶催化和抗原-抗体的双重特异反应，保证了反应结果具有高度的特异性；本发明使用磁分离技术，简化了分离步骤，达到快速检测的目的。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测试剂盒及方法。
（二）背景技术
烷化剂是最大一类抗肿瘤药物，临床上常用的例子有环磷酰胺、尼莫司汀、卡巴嗪、硝卡芥、氮芥和替莫唑胺等，广泛用于治疗脑、头颈、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等恶性肿瘤。烷化剂药物对肿瘤细胞的杀伤主要是通过对DNA分子的鸟嘌呤O6位上的烷基化而实现的，而O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-Methylguanine DNA-Methyltransferase，MGMT）的存在能够去除这种烷基加合物，使肿瘤细胞和正常细胞得以生存而产生所谓的耐药性，是哺乳动物细胞修复烷化剂所造成DNA损伤的一个重要环节。如果肿瘤细胞中的MGMT水平过高可能会导致耐药，而对于正常细胞却可能减少其化疗的毒副作用。如何控制MGMT水平以达到最佳的化疗效果是如今MGMT研究的热点。而且，MGMT在预测肿瘤化疗的效果以及制订个体化治疗方案的潜在价值也已被大量实例研究所证实并被医学界广泛认可。因此，如何灵敏、准确地检测MGMT在细胞中的活性，对提高化疗效果以及减少药物毒副作用有着重要的意义。
不幸的是，目前还没有一种简易可靠、可应用于常规临床检验的方法来测定具有重要肿瘤学价值的MGMT活性。已有大量文献描述MGMT基因启动子甲基化以及MGMT蛋白表达的免疫测定并试图建立这些分子生物学和血清学指标与肿瘤耐药性、生存率以及个体化治疗方案的相关性，但这些烦琐而且不稳定的检测方法不适合在临床上常规使用，也因为它们不直接测定MGMT的酶学活性而可能引入各种与肿瘤耐药机制无关的干扰因素。基于同位素标记底物的MGMT活性测定法只适用于实验室研究而难以被用于常规临床检验中；此外，这种方法所用的蛋白沉淀步骤容易引入诸如黑色素（Melanin）等蛋白的非特异结合，引起假阳性。虽然有人用非同位素标记的底物和酶联免疫分析方法来测定MGMT活性，但这个方法需要多步而费时的固相分离和反应。从临床应用和检测效率（灵敏度）的角度来看，这是个明显的缺点。
很明显，无论在肿瘤生物学的基础研究中还是在肿瘤治疗的临床实践中，都急需发展一种简单可靠的方法来特异、灵敏地测定各种肿瘤组织和血样中的MGMT活性。
能量转移现象，即为内源性发色基团发生荧光淬灭和外源发色基团发生荧光敏化的现象。当两种物质分子的吸收峰和发射峰重叠或部分重叠时，通过分子之间的偶极一偶极的共振偶合可以使能量从供给体转移至受体。其中吸收能量的基团或物质成为能量受体，反之为能量供体。而荧光共振能量转移（Fluorescence energy transfer，FRET）是指电子激发能在适当的能量给体和受体之间传递，通过能量接受体的荧光增强可以简单地对待测物质进行定量分析，但是目前分析中所用的有机荧光染料存在吸收光谱窄、发射光拖尾等诸多问题，从而影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，并且供、受体发射光谱易产生相互干扰。最近报道的将发光量子点用于共振能量转移，可克服有机染料的不足之处，相对传统的有机荧光染料分子，量子点的发射光谱窄并且不拖尾，并有较宽的光谱激发范围，将它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，以最大限度地避免对能量受体的直接激发。因此，将荧光量子点用于MGMT的活性检测，可降低假阳性的发生率，并且具有较高的灵敏度，可以检测同等反应下相对常规浓度较低的被测物。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种基于FRET的MGMT活性检测的新方法，克服现有方法的不足。
本发明采用的技术方案是：
基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测试剂盒，主要包括：
（1）链霉亲和素修饰的磁性量子点；
（2）四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物；
（3）生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤；
（4）缓冲液A，其终浓度组成如下：20mM DTT，2mM EDTA，20%
（v/v）丙三醇，溶剂为100mM Tris-HCl，pH 7.6；
（5）O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品。
本发明试剂盒原理如下：
（1）待测MGMT样品（a）与其底物即生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤（b）反应，在苄基转移到酶蛋白后形成生物素标记的MGMT（c）；（2）加入表面修饰链霉亲和素的磁性量子点（Mag-QDs-SA）（d）以及荧光染料四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物（tetramethylrhodamine-labeled anti-MGMT，TMR-anti-MGMT）（e）分别与MGMT结合，结果以MGMT为桥梁把量子点和罗丹明拉近到有效距离内；（3）在外界激发光激发下，量子点发光以及到罗丹明的共振能量转移。无MGMT活性的样本在检测中无法与生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤反应，进而无法使Mag-QDs-SA和TMR-anti-MGMT通过MGMT的桥联作用结合在一起，QDs与TMR之间无法发生荧光能量转移，也就不能检测到TMR的荧光发射峰增强。因此可以通过测量能量转移下罗丹明发射光的增强程度就可以得到与MGMT活性相关的定量指标，由此建立MGMT活性和能量转移关系的标准曲线并应用到各种检测场合。其原理图如图1所示。
本发明还涉及一种利用所述试剂盒检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的方法，所述方法包括：
（1）提取待测样品的总蛋白质；
（2）取10μL上述提取的总蛋白质，溶于50μL的缓冲液A中，然后加入50pmol的生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤，用纯水补足至300μL，经震荡混匀后，室温下反应90min，然后加入50pmol链霉亲和素修饰的磁性量子点，用缓冲液A补足至300μL，充分振荡混匀反应5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用缓冲液A反复洗涤多次，加入50pmol四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物，用含1%BSA的缓冲液A补足至300μL，充分振荡混匀反应30min，在磁力作用下除去上清液，并用缓冲液A反复洗涤多次，最后加入缓冲液A 300μL，移至96孔板中，在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下、在585nm处的发射光强；
（3）取不同量的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶溶于50μL缓冲液A中，配制梯度浓度的标准品溶液，分别按照步骤（2）的方法，进行反应，最后在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下、在585nm处的发射光强，绘制TMR荧光增强程度-MGMT浓度标准曲线；
TMR荧光增强强度可通过下式计算得到：
TMR荧光增强程度（%）=（FRET后TMR荧光强度—FRET前TMR荧光强度）/FRET前TMR荧光强度
FRET后TMR荧光强度即加入样品或标准品后反应溶液在400nm的激发光下、在585nm处测得的发射光强度，FRET前TMR荧光强度即MGMT浓度为0（即未添加样品或标准品）时反应溶液在585nm处的荧光发射强度；
（4）根据样品测得的荧光强度值，对照标准曲线，获得样品中的MGMT浓度数据。
所述待测样品为临床组织样品或临床细胞株样品。
待测样品为肿瘤细胞株样品时，总蛋白提取步骤如下：
1.裂解液制备：每500uL冷的缓冲液A（20mM DTT，2mM EDTA，20%（v/v）丙三醇，溶剂为100mM Tris-HCl，pH 7.6）中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物（10μg/mL抑肽酶，10μM抑氨肽酶素b，10μM亮抑酶肽，1μM胰肽素，0.1mM苯甲基磺酰氟，溶剂为前述缓冲液A），混匀后置冰上备用；
2.取5~10×106个细胞，在4℃，1000rpm条件下离心5~10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；
3.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清；
4.每5×106个细胞中加入500uL冷的裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15~20分钟；
5.在4℃，14000rpm条件下离心15分钟；
6.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
待测样品为临床组织样品时，总蛋白提取步骤如下：
1.裂解液制备：每500uL冷的缓冲液A中加入2uL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用；
2.取100mg组织样本剪碎，加入上述裂解液中，并用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体；
3.将组织匀浆吸入另一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm条件下离心5分钟；
4.将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
上述蛋白提取物分装后于-80℃冰箱保存备用。
本发明的有益效果主要体现在：
（1）利用量子点与罗丹明之间的共振能量转移原理进行MGMT的活性检测，以最大限度地避免对TMR的直接激发，降低假阳性的发生率。
（2）使用Biotin-BG和anti-MGMT两种特异探针，通过酶催化和抗原-抗体的双重特异反应，保证了反应结果具有高度的特异性。
（3）使用磁分离技术，简化了分离步骤，达到快速检测的目的。
（四）附图说明
图1为基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测原理示意图；
图2为TMR-anti-MGMT的荧光发射谱图；
图3为不同MGMT浓度下荧光发射光谱图（激发波长nm）：a：MGMT浓度为5.0pmol；b：MGMT浓度为7.5pmol；c：-MGMT浓度为10.0pmol；d：MGMT浓度为15.0pmol；
图4为基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测的工作曲线。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：利用本发明的MGMT活性检测方法测定细胞株HeLa S3中MGMT活性。
（1）Mag-QDs-SA的制备：
a）水溶性量子点的制备：在250mL三颈瓶中，加入CdCl2水溶液，搅拌下再加入用高纯水稀释的巯基乙酸溶液，并用1mol/L的NaOH水溶液调节pH为10，然后在适当搅拌速度下加入NaHTe水溶液。将此反应液加热至沸腾，开始记时取样，回流，在不同的时间段取样，获得不同粒径的量子点，（反应0.5h，2h，4h，可分别得到发绿色，黄色，橙色荧光的CdTe量子点，本发明优选粒径为2.9nm，发绿色荧光的量子点用于磁性Mag-QDs-SA的制备）。在反应0.5h获得的量子点溶液中加入乙醇沉淀后并干燥，加入纯水分散获得浓度为0.01mg/mL的量子点分散液。
b）磁性Mag-QDs-SA的制备：将10mL浓度为0.2g/mL柠檬酸钠稳定的Fe3O4纳米粒子分散液加入含有30mL乙醇和1mL 25%（w/w）氨水的混合溶液中在5℃超声分散30min，然后加入1mL正硅酸乙酯，在40℃下机械搅拌过夜后，将产物用乙醇和纯水在磁力作用下多次洗涤后放入60℃的真空烘箱干燥得到棕红色粉末，即二氧化硅磁性微球。取2g的二氧化硅磁性微球与2mL步骤a）制备的量子点分散液混合，加入0.5mLCdCl2（4mg/mL）水溶液，二者迅速沉淀，然后在外加磁力的作用下除去过量的Cd2+，然后将上述共沉淀物分散于含有5mL环己烷、0.5mL氨水（25%）和0.7mL的壬基酚聚氧乙烯醚乳化剂（NP-40）的混合溶液中，搅拌均匀后加入30μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），密封反应24h后，在磁力作用下得到表面氨基化的磁性量子点，用乙醇和水反复洗涤后，分散于PBS缓冲溶液中待用；
c）链霉亲和素在氨基化的磁性量子点表面的偶联：在磷酸缓冲液（PBS 0.1mol/L，pH=8.5）中，将氨基化的磁性量子点子0.6mg和250μL8.7g/L EDC混合，并向其加入0.12mg的链霉亲和素（SA），室温下搅拌反应3h后，在磁力作用下，得到沉淀聚集物，并用PBS（0.1mol/L，pH=7.4）洗涤，纯化得到表面修饰链霉亲和素的磁性量子点（Mag-QDs-SA）。
（2）四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物TMR-anti-MGMT的制备：
量取10ml浓度为6mg/ml的anti-MGMT，加在浓度为0.1mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液中透析过夜；将300μg四甲基异硫氰酸罗丹明溶于浓度为1mg/mL的二甲基亚砜中，取此溶液300μL，逐滴加入抗体溶液中，在室温中避光搅拌2h；把结合物移入直径3cm，高30cm的Bio-Gel P-6层析柱，此层析柱已用0.01mol/L pH8.0的PBS平衡过，流速为1.5mL/min；收集到的先流出的红色结合物即为标记抗体，分装后于4℃保存备用。
（3）生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤（B-BG）的制备：
将O6-苄基鸟嘌呤用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）稀释至1mg/mL，用1mL DMSO溶解N-羟基琥珀酰亚胺生物素（NHSB）1mg；向1mLO6-苄基鸟嘌呤溶液加入120μL NHSB溶液（即含NHSB 120μg）；在室温下持续搅拌，保温2～4小时；加入9.6μL 1mol/L NH4Cl（每25μgNHSB加1μL），在室温下搅拌10分钟；在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在1～3mL之间洗下；最后，样品加入叠氮钠（终浓度0.2g/L）及1.0g/L BSA，浓度为5μg/mL。将结合产物置4℃，避光保存。
（4）细胞样本制备
1.裂解液制备：每500uL冷的缓冲液A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物（10μg/mL抑肽酶，10μM抑氨肽酶素b，10μM亮抑酶肽，1μM胰肽素，0.1mM苯甲基磺酰氟），混匀后置冰上备用。
2.取5~10×106个细胞，在4℃，1000rpm条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞
3.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4.每5×106个细胞中加入500uL冷的裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15~20分钟。
5.在4℃，14000rpm条件下离心15分钟。
6.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
7.通过Bradford法，测定上清中溶液中的总蛋白含量。
（5）标准曲线绘制：
取2.0pmol、5.0pmol、7.5pmol、10.0pmol、15.0pmol的MGMT溶于50μL的缓冲液A中，然后加入50pmol的B-BG以及纯水使反应溶液总体积为300μL，经震荡混匀后，室温下反应90min，然后加入50pmol的Mag-QDs-SA以及缓冲液A，使反应总体积为300μL，充分振荡混匀反应5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用缓冲液A反复洗涤多次，加入50pmol TMR-anti-MGMT以及含1%BSA的缓冲液A，反应总体积为300μL，充分振荡混匀反应30min，在磁力作用下除去上清液，并用缓冲液A反复洗涤多次，最后加入缓冲液A 300μL，移至96孔板中，在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下，在585nm处的发射光强，绘制TMR荧光增强程度-MGMT浓度标准曲线，见图4。
（6）MGMT活性检测：在上述10μL浓度为9.8mg/mL HeLa S3的提取物中加入50μL的缓冲液A中，然后加入50pmol的B-BG以及纯水使反应溶液总体积为300μL，经震荡混匀后，室温下反应90min，再磁力作用下，除去上清液，然后加入50pmol的Mag-QDs-SA以及缓冲液A，使反应总体积为300μL，充分振荡混匀反应5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用缓冲液A反复洗涤多次，加入50pmolTMR—anti-MGMT以及1%BSA的缓冲液A，反应总体积为300μL，充分振荡混匀反应30min，在磁力作用下除去上清液，并用缓冲液A反复洗涤多次，最后加入缓冲液A 300μL，移至96孔板中，在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下，在585nm处的发射光强。按标准曲线换算后，其MGMT表达活性为738fmol/mg蛋白质。
实施例2：利用本发明的MGMT活性检测方法测定细胞株HeLa MR中MGMT活性。
（1）表面修饰链霉亲和素的磁性量子点（QuantumDots-Streptavidin，Mag-QDs-SA）的制备：同实施例1。
（2）四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物TMR—anti-MGMT的制备：
同实施例1。
（3）生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤（B-BG）的制备：
同实施例1。
（4）细胞样本的制备：
1.裂解液制备：每500uL冷的缓冲液A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物（10μg/mL抑肽酶，10μM抑氨肽酶素b，10μM亮抑酶肽，1μM胰肽素，0.1mM苯甲基磺酰氟），混匀后置冰上备用。
2.取5~10×106个HeLa MR细胞，在4℃，1000rpm条件下离心5~10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞
3.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4.每5×106个细胞中加入500uL冷的裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15~20分钟。
5.在4℃，14000rpm条件下离心15分钟。
6.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
7.通过Bradford法，测定上清中溶液中的总蛋白含量。
（5）标准曲线绘制：
同实施例1。
（6）MGMT活性检：在上述10μL浓度为9.5mg/mL HeLa MR的提取物中加入50μL的缓冲液A（100mM Tris-HCl，pH 7.6，20mMDTT，2mM EDTA，20%丙三醇）中，然后加入50pmol的B-BG以及纯水使反应溶液总体积为300μL，经震荡混匀后，室温下反应90min，再磁力作用下，除去上清液，然后加入50pmol的Mag-QDs-SA以及缓冲液A，使反应总体积为300μL，充分振荡混匀反应5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用缓冲液A反复洗涤多次，加入50pmolTMR—anti-MGMT以及1%BSA的缓冲液A，反应总体积为300μL，充分振荡混匀反应30min，在磁力作用下除去上清液，并用缓冲液A反复洗涤多次，最后加入缓冲液A 300μL，移至96孔板中，在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下，在585nm处的发射光强。按标准曲线换算后，其MGMT表达活性为82fmol/mg蛋白质。
实施例3：利用本发明的MGMT活性检测方法测定组织样本星型胶质瘤中MGMT活性。
(1)表面修饰链霉亲和素的磁性量子点（QuantumDots-Streptavidin，Mag-QDs-SA）的制备：
同实施例1。
(2)四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物TMR—anti-MGMT的制备：同实施例1。
(3)生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤（B-BG）的制备：同实施例1。
(4)组织样本的制备：
1.裂解液制备：每500uL冷的缓冲液A中加入2uL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2.取100mg胶质瘤组织样本剪碎，加入上述裂解液中，并用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3.将组织匀浆吸入另一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm条件下离心5分钟。
4.将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
5.通过Bradford法，测定上清中溶液中的总蛋白含量。
（5）标准曲线绘制：
同实施例1。
（6）MGMT活性检：在上述10μL浓度为10.1mg/mL胶质瘤的提取物中加入50μL的缓冲液A（100mM Tris-HCl，pH 7.6，20mM DTT，2mM EDTA，20%丙三醇）中，然后加入50pmol的B-BG以及纯水使反应溶液总体积为300μL，经震荡混匀后，室温下反应90min，再磁力作用下，除去上清液，然后加入50pmol的Mag-QDs-SA以及缓冲液A，使反应总体积为300μL，充分振荡混匀反应5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用缓冲液A反复洗涤多次，加入50pmolTMR-anti-MGMT以及1%BSA的缓冲液A，反应总体积为300μL，充分振荡混匀反应30min，在磁力作用下除去上清液，并用缓冲液A反复洗涤多次，最后加入缓冲液A 300μL，移至96孔板中，在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下，在585nm处的发射光强，按标准曲线换算后，其MGMT表达活性为821fmol/mg蛋白质。
Claims (3)
1.基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测试剂盒，主要包括：
（1）链霉亲和素修饰的磁性量子点；
（2）四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物；
（3）生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤；
（4）缓冲液A，其终浓度组成如下：20mM DTT，2mM EDTA，20%丙三醇，溶剂为100mM Tris-HCl，pH 7.6；
（5）O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品。
2.利用权利要求1所述试剂盒检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的方法，所述方法包括：
（1）提取待测样品的总蛋白质；
（2）取10μL上述提取的总蛋白质，溶于50μL的缓冲液A中，然后加入50pmol的生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤，用纯水补足至300μL，经震荡混匀后，室温下反应90min，然后加入50pmol链霉亲和素修饰的磁性量子点，用缓冲液A补足至300μL，充分振荡混匀反应5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用缓冲溶液A反复洗涤多次，加入50pmol四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物，用含1%BSA的缓冲液A补足至300μL，充分振荡混匀反应30min，在磁力作用下除去上清液，并用缓冲溶液A反复洗涤多次，最后加入缓冲溶液A 300μL，移至96孔板中，在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下、在585nm处的发射光强；
（3）取不同量的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶溶于50μL缓冲液A中，配制梯度浓度的标准品溶液，分别按照步骤（2）的方法，进行反应，最后在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下、在585nm处的发射光强，绘制TMR荧光增强程度-MGMT浓度标准曲线；
（4）根据样品测得的荧光强度值，对照标准曲线，获得样品中的MGMT浓度数据。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述待测样品为临床组织样品或临床细胞株样品。
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| CN105802928A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-07-27 | 苏州偲聚生物材料有限公司 | 用于检测血清中mgmt抗体的多肽，检测器件和检测试剂盒 |
| CN106990084A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-07-28 | 山东师范大学 | 一种基于单个量子点的用于检测dna甲基转移酶的纳米传感器 |
| CN107475213A (zh) * | 2016-06-08 | 2017-12-15 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 用于检测血清中mgmt抗体的多肽，检测器件和检测试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101601042A (zh) * | 2006-11-03 | 2009-12-09 | 贝勒研究院 | 通过血液白细胞微阵列分析诊断转移性黑色素瘤和监测免疫抑制的指示物 |
-
2012
- 2012-09-24 CN CN201210357904.0A patent/CN102944539B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101601042A (zh) * | 2006-11-03 | 2009-12-09 | 贝勒研究院 | 通过血液白细胞微阵列分析诊断转移性黑色素瘤和监测免疫抑制的指示物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LONGJIANG ZHANG ET AL.: "Delivery of therapeutic radioisotopes using nanoparticle platforms: potential benefit in systemic radiation therapy", 《NANOTECHNOLOGY, SCIENCE AND APPLICATIONS》 * |
| MONIKA E. HEGI ET AL.: "MGMT Gene Silencing and Benefit from Temozolomide in Glioblastoma", 《THE NEW ENGLAND JOURNAL》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105802928A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-07-27 | 苏州偲聚生物材料有限公司 | 用于检测血清中mgmt抗体的多肽，检测器件和检测试剂盒 |
| CN107475213A (zh) * | 2016-06-08 | 2017-12-15 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 用于检测血清中mgmt抗体的多肽，检测器件和检测试剂盒 |
| CN106990084A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-07-28 | 山东师范大学 | 一种基于单个量子点的用于检测dna甲基转移酶的纳米传感器 |
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