CN102943118B - 同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重pcr引物及其扩增方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物及其扩增方法和用途，涉及3套引物，即Leptosphaeria lindguistii和Diaporthe helianth通用引物，L.lindguistii特异引物和D.helianth特异引物。通用引物扩增序列作为所有菌株菌丝基因组DNA提取模板的质量监控，L.lindguistii特异引物和D.helianth特异引物针对L.lindguistii和D.helianthi两个基因位点同时进行PCR扩增。L.lindguistii和D.helianth通用引物及各自特异引物可用于两种菌的菌丝基因组DNA三重特异PCR扩增。
Description
技术领域
本发明涉及PCR技术检测寄生于向日葵中向日葵黑茎病菌（Leptosphaeria lindguistii）和向日葵茎溃疡病菌（Diaporthe helianthi）的三重PCR引物及其扩增方法和用途，属于菊科向日葵中向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌检测领域。
背景技术
向日葵（Helianthus annuus）属一年生草本植物，是我国五大油料作物之一，向日葵种植简单、抗旱抗逆性强，依据其用途，分油用型、食用型和中间型3个类型。向日葵适应性强，对栽培环境条件要求不高，较之玉米、大豆更能适应恶劣气候。向日葵是近年来世界上发展很快的一种新兴油料作物，由于其含油率高达5 0%以上，品质好等优点成为食品加工、化工、燃料工业、饲料加工业和医药等原料，其市场前景无限广阔（曹孟梁.国内向日葵发展概况及经济价值.山西农业,2008,(16):19-20）。
目前向日葵的平均产量仅1828kg/hm2，种子含油量仅25%～32%，，均远低于现有栽培品种的生物学潜能，这主要是由于病害所致（冉俊祥.向日葵病害种类分布和防治.国外农学—向日葵,1991,(4):17）。近年来我国不断从国外进口向日葵种子，仅2010年就达3082.46吨，其中90%以上来自阿根廷、法国、美国等向日葵黑茎病、茎溃疡疫区。2005年～2007年在新疆伊犁河谷发现并鉴定向日葵黑茎病为一种蔓延迅速、危害严重的向日葵病害(陈卫民等.国内新病害—向日葵茎点霉黑茎病在新疆伊犁河谷的发生初报.云南农业大学报,2008,23(5):610-612）。2010年，天津口岸在来自阿根廷、法国的向日葵种子中，检出检疫性有害生物向日葵黑茎病菌Leptosphaerialindguistii（Luo JF et al., Detection and identification of Phoma macdonaldii in sunflower seeds imported from Argentina.AustralasianPlant Pathology,2011,40(5):504-509），这是国内首次自进境向日葵种子中截获向日葵黑茎病菌，由于其对向日葵的严重危害，质检总局发布警示通报，与农业部于2010年联合发布公告将其列入进境植物检疫性有害生物名录，并指定天津局制定行业标准。
向日葵黑茎病菌（L.lindguistii）和向日葵茎溃疡病菌（D.Helianthi）是向日葵上寄生的两种重要检疫性真菌病害。L.lindguistii无性态为茎点霉属Phoma，D.helianthi为拟茎点霉属Phomopsis。1987年Aerette和Gulga首次报道了该病的发生，以及病原菌的分离、鉴定与回接等，向日葵黑茎病发病初期在向日葵叶柄基部出现黑色斑点，并迅速沿茎杆扩展至整个植株，导致小、空、瘪的向日葵籽产生，使种子产量和油产量严重降低，早期发病植株枯死，发病较晚者则矮化瘦弱，倒伏，重病田发率100%，死亡率达51%以上。1980年首次在南斯拉夫发现和鉴定的向日葵茎溃疡病菌（Muntanola-Cvetkovic Met al.,On the identity of the causative agentof a serious Phomopsis Diaporthe disease in sunflower plants.NovaHedwigia,1981,34:417-435），随后在法国和美国也发现此病害，主要侵染植株的叶部、茎部、头状花序，叶片病斑棕色或黑色，可致茎秆萎蔫、干枯变黑，葵盘发育不良，不能形成成熟的种子或致干枯败育。1984年法国出现此病害后，损失达田间向日葵作物总量的40%左右。
随着经济全球化进程的加快和我国对外开放的深入发展，农产品进出口数量日益增大，检疫有害生物传入我国风险也逐年增加（商鸿生等,向日葵的检疫性有害生物.植物检疫,2001,15(3):152-154）。向日葵作为一种重要的油料作物和食用产品，可传带多种有害生物，近年来，我国从国外引进大量向日葵种子，有害生物传入我国的风险很大，对我国的向日葵种植业极为不利。常规生物学检测方法是种子带菌检测（陈卫民等,向日葵黑茎病种子带菌检测初步研究.《中国植物病理学会2008年学术年会论文集》,2008），经过分离培养可通过肉眼直观菌落、分生孢子器、分生孢子等形状颜色来鉴定真菌病害。 由于从不同地理位置感染病原菌的植株及不同时间分离得到的L.lindguistii和D.helianthi，难免在L,lindguistii和D.helianthi菌落形态上存在交叉重叠且有时需延长菌株培养时间达20天左右才能诱激产生分生孢子器，此种情况下不仅耗时费力，且很难根据菌落形态准确、快速、有效地鉴定出两种病原菌，从而造成检疫人员的漏检和误检，且不能满足口岸“快验快放”的要求，从而错过病害最佳防治时期，导致病害在田间肆虐发展。2010年，天津出入境检验检疫局动植食中心在来自阿根廷向日葵种子首次截获检疫有害真菌L.lindguistii；2011年，又在法国进境向日葵种子中截获L.lindguistii。因此，加强对口岸进境向日葵携带有害生物快速、准确的检测显得极为重要，对保护和促进我国向日葵产业健康发展具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：设计同步检测向日葵上向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物，包括向日葵黑茎病菌的特异引物和向日葵茎溃疡病菌特异引物，与文献提供的通用引物对ITS1/ITS4，建立同步检测向日葵上向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物及其扩增方法和用途。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物，实现两种检疫性真菌病害同步分子检测的特异引物，序列如下：
向日葵黑茎病菌的特异引物：LLF：TAG CAT TGT TAG CCG AGG
LLR：CAG CCA GTC TTC TAG CTT GG
向日葵茎溃疡病菌的特异引物：DHF：CGA GAA ATC GTC CGT GAT
DHR：ATA CGG TCG GAC AGA CCA
所述LLF/LLR扩增片段为255bp，DHF/DHR扩增片段为394bp，特异引物用于向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的菌丝基因组DNA特异三重PCR扩增。
还包括检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的通用引物，序列如下：
ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G
ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
所述引物用于向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为560bp—600bp，作为提取和扩增过程的质量监测。
一种同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物的扩增方法，包括下述的扩增体系和扩增程序：
（1）扩增体系
建立20μL的扩增体系，包括10×Buffer 2.0μL，其中含终浓度为1.5mmol/L的MgCl2；2.5mmol/L dNTPs为2.0μL；0.4μL Taq DNA聚合酶，浓度5U/μL；浓度为20μmol/L的引物ITS1/ITS4、LLF/LLR和DHF/DHR依次为1.0μL/1.0μL、0.8μL/0.8μL、0.6μL/0.6μL；DNA模板1.5μL；余量为双蒸水；
(2)反应程序
设立反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃复性20s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸7min。
上述同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物在检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌方面的应用。
本发明的有益效果是：建立了方法简便、重现性好的L.lindguistii和D.helianth的三重PCR三重PCR引物，能将L.lindguistii和D.helianth区别开来。采用引物监测实验过程，避免假阴性。实现了在同一PCR管中3组引物同步检测L.lindguistii和D.helianthi，该三重PCR检测体系的建立简化和方便了对L.lindguistii和D.helianthi的检测，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，可有效在口岸检测中推广应用。
附图说明
图1是本发明菌丝基因组DNA三重PCR扩增。
具体实施方式
本发明的同步检测检疫性真菌病害向日葵黑茎病菌（L.Lindguistii）和茎溃疡病菌（D.Helianthi）的三重PCR引物，实现同时检测L.lindguistii和D.Helianthi。
（1）设计向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌各自的特异引物，序列如下：
向日葵黑茎病菌的特异引物：LLF：TAG CAT TGT TAG CCG AGG
LLR：CAG CCA GTC TTC TAG CTT GG
向日葵茎溃疡病菌的特异引物：DHF：CGA GAA ATC GTC CGT GAT
DHR：ATA CGG TCG GAC AGA CCA
LLF/LLR扩增片段为255bp，DHF/DHR扩增片段为394bp，这两套特异引物用于向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的菌丝基因组DNA特异三重PCR扩增。
（2）文献报道的向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的通用引物，序列如下：
ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G
ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
上述引物用于向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为560bp—600bp，作为提取和扩增过程的质量监测。
本发明建立检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物及其扩增方法，包括扩增体系的建立及反应程序的设立。
（1）扩增体系
经过体系优化，建立20μL的扩增体系，包括10×Buffer 2.0μL（其中含终浓度为1.5mmol/L的MgCl2)；2.5mmol/L dNTPs为2.0μL；0.4μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)；浓度为20μmol/L的引物ITS1/ITS4、LLF/LLR和DHF/DHR依次为1.0μL/1.0μL、0.8μL/0.8μL、0.6μL/0.6μL；DNA模板1.5μL（约为40ng)，加双蒸水至20μL。
（2）反应程序
经过优化，设立反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃复性20s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸7min。
本发明设计合成了2套引物，包括自行设计的引物L.lindguistii和D.helianth的特异引物LLF/LLR和DHF/DHR。文献报道的引物ITS1/ITS4对所有实验材料菌丝DNA进行质量监测，避免检测过程中的假阴性，3套引物对L.lindguistii和D.Helianth进行三重PCR扩增。
所述同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物在检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌方面的应用。
本发明建立了快速简便、特异性强、灵敏度高、准确可靠的L.lindguistii和D.Helianthi三重PCR分子检测方法，能将L.lindguistii和D.Helianthi区别开来。该方法的建立为两种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异可行的方法，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
实施例1：实验材料菌丝的培养
本实验供试菌株包括L.lindguistii和D.helianth同属菌株、茎点霉属phoma和拟茎点霉属phomopsis近似种及其他从向日葵上分离得到的真菌病害共计15个菌株（见表1）。
实验涉及的材料包括6株ATCC菌株购买于美国菌种保藏中心，wto2、4771-2为天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心从进境阿根廷、法国向日葵种子中截获，L2-1、3-21、13-1、mx-1、T-1、a9、a10供试菌株为天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心从植株上分离培养获得，供试材料的相关信息见表1。
表1供试材料
挑取L.lindguistii和D.helianthi少量菌丝置于PDA培养基，12h光照黑暗交替，25℃恒温保湿培养7d（Luo JF et al.,Detection andidentification of Phoma macdonaldii in sunflower seeds imported fromArgentina.Australasian Plant Pathology,2011,40(5):504-509）。培养7d后收集大量菌丝供DNA提取。
实施例2：菌丝基因组DNA的提取
采用美国QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit提取菌丝DNA，提取的菌丝DNA溶于100μL 1×TE缓冲液中，其余菌丝DNA置于-70℃保存。
实施例3：菌丝基因组DNA的三重PCR检测
PCR扩增相关试剂为大连宝生物（TaKaRa）工程公司产品。
3.1反应混合液的配制
反应体系为20μL：10×Buffer 2.0μL（其中含有终浓度为1.5mmo l/L的MgCl2)；2.5mmol/L dNTPs为2.0μL；0.4μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)；浓度为20μmol/L的引物ITS1/ITS4、LLF/LLR和DHF/DHR依次为1.0μL/1.0μL、0.8μL/0.8μL、0.6μL/0.6μL；DNA模板1.5μL（约为40ng)，余量为无菌水，以向日葵黑茎病菌的引物ITS1/ITS4扩增片段的克隆质粒作为阳性对照，无菌水为模板作为阴性对照。
3.2PCR反应程序
94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃复性20s，72℃延2℃延，40个循环；72℃延伸7min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色及成像观察目的条带。
3.3结果分析
同一PCR管中3组引物ITS1/ITS4、LLF/LLR和DHF/DHR对15个菌株的菌丝DNA进行PCR扩增，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳能够明确的区分L.lindguistii和D.helianthi这两种寄生于向日葵上的检疫性真菌病害。泳道P为L.lindguistii的引物ITS1/ITS4的560bp—600bp扩增片段克隆质粒作为质量监控；泳道1和2分别为L.lindguistii（wto2和4771-2）ITS区域约560bp—600bp扩增片段及特异引物扩增片段为255bp；泳道3和4分别为D.helianthi（ATCC62082和ATCC201540）ITS区域560bp—600bp扩增片段及特异引物扩增片段为394bp；5-15分别为2株向日葵黑茎病菌同属菌株L.biglobosa（L2-1）和L.maculans（3-21），2株与向日葵黑茎病菌的无性态同属菌株Phoma sp.（mx-1）和Phoma lycopersici（ATCC11847），3株向日葵茎溃疡病菌同属菌株D.Phaseolorum.var.Caulivora（TCC28464）、D.phaseolorum.var.meridionalis（ATCC200236）和D.vaccinii Shear（ATCCMYA-1156），1株与向日葵茎溃疡病菌无性态同属菌株Phomopsis spp（13-1），1株木贼镰刀菌Fusarium equiseti(T-1)，1株向日葵菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum(a9）和1株梭孢壳菌Thielavia hyrcaniae(a10），ITS区域扩增片段约560—600bp，无特异引物扩增片段；泳道N为阴性对照 H2O；泳道M为DL100bp Marker。（图1）。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
Claims (4)
1.一种同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物，其特征在于，实现两种检疫性真菌病害同步分子检测的特异引物，序列如下：
向日葵黑茎病菌的特异引物：LLF：TAG CAT TGT TAG CCG AGG
LLR：CAG CCA GTC TTC TAG CTT GG
向日葵茎溃疡病菌的特异引物：DHF：CGA GAA ATC GTC CGT GAT
DHR：ATA CGG TCG GAC AGA CCA
所述LLF/LLR扩增片段为255bp，DHF/DHR扩增片段为394bp，特异引物用于向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的菌丝基因组DNA特异三重PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物，其特征在于，还包括检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的通用引物，序列如下：
ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G
ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
所述引物用于向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为560—600bp，作为提取和扩增过程的质量监测。
3.一种权利要求1所述的同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物的扩增方法，其特征在于，包括下述的扩增体系和扩增程序：
（1）扩增体系
建立20μL的扩增体系，包括10×Buffer 2.0μL，其中含终浓度为1.5mmol/L的MgCl2；2.5mmol/L dNTPs为2.0μL；0.4μL Taq DNA聚合酶，浓度5U/μL；浓度为20μmol/L的引物ITS1/ITS4、LLF/LLR和DHF/DHR依次为1.0μL/1.0μL、0.8μL/0.8μL、0.6μL/0.6μL；DNA模板1.5μL；余量为双蒸水；
(2)反应程序
设立反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃复性20s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸7min。
4.如权利要求1所述同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物在检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌方面的应用。
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