CN102943064B - 一种自造血干细胞中高效分化扩增cd4阳性t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种自造血干细胞中高效分化扩增CD4阳性T细胞的方法，该方法包括如下步骤：步骤a：收集血液血样品，步骤b：分离血液样品中单核细胞成分，步骤c：利用抗体富集单核细胞成分中的造血干细胞，步骤d：使用包含Notch-1的化学成分确定的CD4阳性细胞分化扩增培养基培养和扩增CD4阳性T细胞。本发明使用包含Notch-1的化学成分确定的培养系统在促进造血干细胞定向分化为CD4阳性T细胞的同时进行高效扩增，实现了该细胞的大量生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，一种使用化学成分确定的培养系统自造血干细胞中高效分化扩增CD4阳性T细胞的方法。
背景技术
T细胞是一群在细胞介导的免疫反应中有着重要作用的白细胞。研究表明，CD4阳性T细胞在艾滋病，癌症以及自身免疫性疾病中有着重要的作用。在细胞核器官移植过程中，CD4细胞群往往会发生改变，造成免疫排斥，或是继发性的免疫疾病。
实际上，之前人们为了治疗癌症已经克服细胞移植过程中造成的免疫异常和移植滞后现象，已经进行了防范的研究，包括体外增值CD4细胞群，来治疗治病或扭转体内免疫系统失衡。现在已经知道，体内绝大多数的T细胞是由骨髓造血干细胞在胸腺部位移植，经过胸腺的正向和反向选择而最终形成具有功能的免疫细胞。在分化过程中，干细胞向T细胞分化的最初标志是CD4抗原的表达。有研究已经仿照T细胞的发育模式，引入胸腺组织，来扩增CD4细胞群。然而，使用胸腺组织作为诱导扩增CD4细胞群必然面临着来源稀少以及外来抗原的污染。
造血干细胞是指生物体内能够进行自我更新，并维持机体血液组织细胞新陈代谢的一群细胞。在生物体血液组织受到内源或外源性的损害时,干细胞可以被激活执行分化功能,有层次的生成红细胞、白细胞和巨噬细胞等各种血液组织细胞，从而达到修复血液组织的目的.病人由于各种原因，实际上可能只是血液组织中某个组分丢失，比如艾滋病中CD4阳性细胞群丢失，所以成分输血更具有针对性，也有更好的治疗预期。
骨髓当中含有丰富的造血干细胞,因此得到了最为广泛和深入的研究。几十年前，人们已经开始进行骨髓移植来治疗白血病。骨髓移植的实质是造血干细胞的移植。研究证实,骨髓造血干细胞表达特定的表面抗原表型,比如,CD133,CD34等。实验表明，给白血病实验实验小鼠模型仅仅移植一个造血干细胞，也可以完全重建血液组织。但是，尽管骨髓造血干细胞细胞较易分离和培养,但是,骨髓来源有限,难以满足临床大量的需求，而造血干细胞的提供者也必须承受额外的痛苦。
脐带血是指早产或正常分娩婴儿脐带内的血液。与骨髓相比，脐带血来源充足，能够保证临床的大量需求。已经证实，脐带血种含有活性很强的造血干细胞群。脐带血中的造血干细胞与骨髓造血干细胞相似，有着相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文献表明，脐带血造血干细胞有着更原始的干细胞特性和更低的免疫原性。应用脐带血全血和造血干细胞移植治疗血液系统疾病屡见报道。但是由于体外分化技术的不完善,自造血干细胞分化为CD4阳性细胞等特性细胞群后进行成分性输血还鲜有报道。
发明内容
技术问题：本发明的方法通过获取血液样品，在不需要滋养层的情况下，使用化学成分确定的培养基，实现对造血干细胞向CD4阳性T细胞的定向分化以及高效扩增。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供的方案为：自造血干细胞中高效分化扩增CD4阳性T细胞的方法，该方法包括如下步骤：
步骤a：收集血液血样品，
步骤b：分离血液样品中单核细胞成分，
步骤c：利用抗体富集单核细胞成分中的造血干细胞，
步骤d：使用包含Notch-1的化学成分确定的CD4阳性细胞分化扩增培养基
培养和扩增CD4阳性T细胞。
优选的，其特征在于，所述血液样品是人的血样品。
优选的，其中所述血液样品指新鲜采集或存贮的脐带血、周边血或骨髓。
优选的，所述脐带血血样品均经过肝素抗凝，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单核细胞成分之后进行接种。
优选的，步骤c中，所述抗体为造血干细胞表面特征性抗原的抗体或抗体组合。
优选的，其中所述之特征性抗原，指任何具有标志意义的造血干细胞表面抗原，包括CD34,CD133抗原。
优选的，其中所述之特征性抗原组合,指具有标志意义的造血干细胞表面抗原组合，包括CD34+/CD29+/CD3-/CD4-抗原组合。
优选的，步骤d中，其中所述包含Notch-1的化学成分确定的CD4阳性细胞分化扩增培养基包括：基础培养基；添加成分为血小板生成素（ThrombopoietinTPO),Noth-1,和Flk-2/Flt3 ligand(FL),and 1%牛血清白蛋白（BSA）。
优选的，步骤b中，所述分离的方法,包括磁珠或流式细胞仪。
有益效果：本发明使用了成分确定的培养基对造血干细胞进行向CD4阳性细胞群的分化，同时实现了大量扩增。CD4阳性细胞分化扩增培养基各种化学成分确定，大大降低了培养过程中引入外来抗原的影响，对生产出的CD4阳性细胞进行质量控制提供了有效保证。在此环境下，生产出大量均一的CD4阳性细胞群，实现了本发明。
附图说明
图1：脐带血造血干细胞向CD4阳性细胞群分化扩增过程中细胞生长方式。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明做进一步说明。
本发明涉及自造血干细胞通过定向分化和高效扩增获取CD4阳性T细胞的方法。CD4阳性T细胞在一些与免疫相关联的疾病比如艾滋病，肿瘤和自身免疫性疾病中有着重要的功能。现已正实，在输血过程中可以造成CD4阳性细胞种群的减少，从而引起相关的病症。人们已经试图在体外扩增CD4阳性T细胞，但是仍有许多缺陷，比如，分化效率以及扩增效率不足，以及，在培养扩增过程中引入组织成分作为滋养层。后者显然存在着扩增方法繁琐，不利于进行大量扩增。在培养过程中，引入组织成分，容易造成污染以及物种间的污染。因此如何简便高效的扩增CD4阳性T细胞成为了阻碍其向临场转化的难题。本发明包括在不使用滋养层的培养体系中，使用包含Notch-1的化学成分确定的培养系统在促进造血干细胞定向分化为CD4阳性T细胞的同时进行高效扩增，实现了该细胞的大量生产。
本发明的方法通过获取血液样品，在不需要滋养层的情况下，使用化学成分确定的培养基，实现对造血干细胞向CD4阳性T细胞的定向分化以及高效扩增。
本发明所述的分离、分化和扩增造血干细胞的主要步骤如下：
在无菌条件下获取血液样品，25-200ml,肝素抗凝。造血干细胞的分离纯化过程在获取样品后后24小时内进行。
首先，使用同体积IMDM稀释抗凝过的血液，与5g/L的甲基纤维素按4:1混合，静置30分钟，沉降红细胞。吸取上清，离心后，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2500rpm离心20min，取界面层，加PBS制成单核细胞悬液，离心洗涤。富集单核细胞群中的造血干细胞。造血干细胞在以IMDM为基础的培养基中培养，该培养基中还含有Thrombopoietin(TPO)、Notch-1、Flk-2/Flt3 ligand(FL)和BSA等添加成分。细胞在悬浮状态下生长，每7天加一倍的新鲜培养基，维持细胞密度在106/ml一下。
具体而言，为达到本发明所述目的,本发明首先富集血液样品中造血干细胞，使用CD4阳性细胞分化扩增培养培养基将脐带血造血干细胞向CD4阳性细胞群分化，并实现大量扩增。CD4阳性细胞分化扩增培养培养基的成分包括Iscove’smodified Dulbecco’s medium(IMDM)，血小板生成素(TPO),Notch-1和Flk-2/Flt3ligand(FL),和牛血清白蛋白。
本发明所述的分离、分化和扩增造血干细胞的主要步骤如下：
在无菌条件下获取血液样品，25-200ml,肝素抗凝。造血干细胞的分离纯化过程在获取样品后后24小时内进行。
首先，使用同体积IMDM稀释抗凝过的血液，与5g/L的甲基纤维素按4:1混合，静置30分钟，沉降红细胞。吸取上清，离心后，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2500rpm离心20min，取界面层，加PBS制成单核细胞悬液，离心洗涤。富集单核细胞群中的造血干细胞。造血干细胞在以IMDM为基础的培养基中培养，该培养基中还含有血小板生成素(TPO)、Notch-1、Flk-2/Flt3 ligand(FL)和牛血清蛋白等添加成分。细胞在悬浮状态下生长，每7天加一倍的新鲜培养基，维持细胞密度在106/ml一下。
本发明使用了成分确定的培养基对造血干细胞进行向CD4阳性细胞群的分化，同时实现了大量扩增。CD4阳性细胞分化扩增培养基各种化学成分确定，大大降低了培养过程中引入外来抗原的影响，对生产出的CD4阳性细胞进行质量控制提供了有效保证。在此环境下，生产出大量均一的CD4阳性细胞群，实现了本发明。
实施例1：脐带血造血干细胞的分离纯化
将在无菌条件下采集的脐带血以体积比1:1与细胞在α-MEM混合稀释，与5g/L的甲基纤维素按4:1混合，静置30分钟，沉降红细胞。吸取上清，离心后，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上，2500rpm离心20min，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤。
因为Ficoll-Hypaque的比重为1.077g/ml,其比单核细胞重但比红细胞轻，因此可以将单核细胞与残留的红细胞分离。收集界层面即可收集到比较纯的单核细胞。
将获取的单核细胞用PBS稀释，2000rpm，离心10min,去掉上清液，并加入新的PBS打散，稀释。以同样的条件再洗涤一次，可见沉积于离心管底部的细胞。
随后，使用磁珠分离系统分离并富集CD34+/CD4-细胞组分。
细胞清洗后，接种于普通股24孔细胞培养板，培养条件为IMDM,20ng/ml血小板生成素(TPO),50ng/ml Notch-1,以及50ng/ml Flk-2/Flt3 ligand(FL)并添加1%牛血清蛋白。每7天添加一倍新鲜培养基。
本发明不局限与所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的要旨、构思和宗旨的情况下，可以对本分所述混合物和方法或方法中个步骤的前后次序进行改动、添加和替换。此外，本发明提及的分离方法，包括但不限于磁珠以及流式细胞仪等分离方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。
Claims (2)
1.一种自造血干细胞中高效分化扩增CD4阳性T细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤a：收集血液血样品，
步骤b：分离血液样品中单核细胞成分，
步骤c：利用抗体富集单核细胞成分中的造血干细胞，
步骤d：使用包含Notch-1的化学成分确定的CD4阳性细胞分化扩增培养基培养和扩增CD4阳性T细胞；
所述血液样品是人的血样品；
其中所述血液样品指新鲜采集或存贮的脐带血、周边血或骨髓；
所述脐带血血样品均经过肝素抗凝，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单核细胞成分之后进行接种；
步骤c中，所述抗体为造血干细胞表面特征性抗原的抗体或抗体组合，其中所述之特征性抗原是CD34+/CD4-抗原组合；
步骤d中，其中所述包含Notch-1的化学成分确定的CD4阳性细胞分化扩增培养基为：基础培养基；添加成分为血小板生成素,Noth-1,和Flk-2/Flt3 ligand,and 1％牛血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的自造血干细胞中高效分化扩增CD4阳性T细胞的方法，其特征在于，步骤b中，所述分离的方法,包括磁珠或流式细胞仪。
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| CN103789259A (zh) * | 2014-02-10 | 2014-05-14 | 江苏霖峯细胞技术股份有限公司 | 自血液样品中同时分离间充质干细胞和造血干细胞的方法 |
| CN105420191A (zh) * | 2015-12-02 | 2016-03-23 | 上海华颜医药科技有限公司 | 一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法 |
-
2012
- 2012-12-04 CN CN201210512263.1A patent/CN102943064B/zh active Active
Non-Patent Citations (6)
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| "Notch1 突变对HSC体外分化为T/B淋巴细胞的影响;王磊等;《中国免疫学杂志》;20111231;第27卷(第3期);第2部分-第3部分 * |
| SANCHEZ et al.Thymus-independent T-cell differentiation in vitro.《British Journal of Haematology》.1998,第1198页右栏第2段-第1199页左栏第3段. |
| Thymus-independent T-cell differentiation in vitro;SANCHEZ et al;《British Journal of Haematology》;19981231;第1198页右栏第2段-第1199页左栏第3段 * |
| 侯瑞霞等.造血干细胞定向分化为T 细胞的体外培养.《中国麻风皮肤病杂志》.2006,第22卷(第8期),673-675. |
| 王磊等."Notch1 突变对HSC体外分化为T/B淋巴细胞的影响.《中国免疫学杂志》.2011,第27卷(第3期),第2部分-第3部分. |
| 造血干细胞定向分化为T 细胞的体外培养;侯瑞霞等;《中国麻风皮肤病杂志》;20060831;第22卷(第8期);673-675 * |
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| CN102943064A (zh) | 2013-02-27 |
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